Características fenotípicas útiles para la identificación presuntiva de Candida guilliermondii

M.V. Pinoni, V. Castán, M.I. Maegli, J. Lorenzo, F. Frizzera, V. Jewtuchowicz, M.T. Mujica*

Centro de Micología, Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires. Paraguay 2155 (1121) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.

*Correspondencia. E-mail: mtmujica@gmail.com

RESUMEN

En el medio CHROMagar Candida, Candida guilliermondii desarrolló una colonia de color rosado-púrpura. En láminas de agar leche-tween 80 al 1%, presentó a las 48 h de cultivo a 28 °C levaduras pequeñas, ovoides y brotantes, de 3 a 5 µm, que no formaron seudomicelio y que posteriormente desarrollaron un conglomerado característico de seudohifas con disposición radiada. Estas se encontraron bien desarrolladas a las 96 h de incubación. Los ensayos de asimilación resultaron negativos para la trehalosa y positivos para la sacarosa . Estos hallazgos fueron validados en el 100% de los aislamientos con los métodos automatizados ID 32C y Vitek YBC, los que señalaron a Candida famata como segunda opción, con un porcentaje de confianza del 10%. El estudio de la micromorfología de las levaduras aumenta la probabilidad de una identificación correcta, particularmente si se debe discriminar entre especies que presentan perfiles bioquímicos similares.

Palabras clave: Candida guilliermondii; Micromorfología; CHROMagar Candida; Candida

ABSTRACT

Useful phenotypic characteristics for presumptive identification of Candida guilliermondii. Candida guilliermondii developed a pink-purplish colony on CHROMagar Candida. In the micromorphology in milk-tween 80 1% agar at 28 °C after 48 h of incubation C. guilliermondii showed small (3-5 µm), spherical yeasts without pseudohyphaes. This Candida species presented a characteristic cluster of blastospores with pseudohyphaes radiating from the centre at 96 h. The trehalose-sucrose assimilation assay was applied to the C. guilliermondii isolates which proved negative for trehalose and positive for sucrose. These results allowed for the presumptive identification of C. guilliermondii. The results were concordant in 100% of the isolates with the identification of the C. guilliermondii species by the ID 32C and Vitek YBC methods. Such automated methods offered Candida famata as a second option, with a reliability percentage of 10%. Micromorphological studies increase yeast identification reliability, especially among species presenting similar biochemical profiles.

Key words: Candida guilliermondii; Candida micromorphology; CHROMagar Candida; Candida

Las especies del género Candida constituyen la cuarta causa de sepsis de origen nosocomial (12, 16) y son aisladas de diversos materiales (boca, piel, uñas, genitales y orina). Su identificación resulta esencial en el laboratorio, porque orienta las decisiones terapéuticas y permite realizar mapas epidemiológicos y establecer medidas preventivas frente a brotes intrahospitalarios.
Los métodos tradicionales de identificación de levaduras se basan en la determinación de sus características morfológicas y de sus requerimientos nutricionales, para lo cual se utilizan técnicas artesanales muy laboriosas y que insumen mucho tiempo. Por estos motivos han surgido métodos comerciales, algunos automatizados, basados en la actividad enzimática de las levaduras, los que muestran buena especificidad y reproducibilidad y están facilitando la tarea en el laboratorio de microbiología (1, 6, 7).
Actualmente, la utilización de medios cromogénicos (6, 11, 13), los ensayos de asimilación de azúcares, como trehalosa y sacarosa, y las características micromorfológicas en agar leche-tween 80 al 1% (5) o en agar harina de maíz, permiten la observación de levaduras con diferentes morfologías y resultan útiles en la identificación al sumarlos a criterios bioquímicos o a la observación del color y aspecto de la colonia en el medio CHROMagar Candida (5, 6, 8, 14).
La especie Candida guilliermondii es una levadura emergente (3) que produce fungemia, osteomielitis y peritonitis, y tiene baja sensibilidad al fluconazol y a la anfotericina B (4, 9, 10, 15). Presenta dos variedades: C. guilliermondii var. guilliermondii y C. guilliermondii var. membranifaciens (2).
Nuestro objetivo fue evaluar la utilidad del medio cromogénico comercial CHROMagar Candida, de la observación de la micromorfología en agar leche-tween 80 al 1% y del estudio del perfil bioquímico frente a trehalosa y sacarosa para obtener un algoritmo económico y confiable que permita la identificación de C. guilliermondii.
Se estudió un total de 45 levaduras, de las cuales 35 correspondían a la especie C. guilliermondii y eran provenientes de uñas (n=25), sangre (n=5), boca (n=3), piel (n=1) y orina (n=1). Las restantes correspondían a las especies Candida famata (n=5) y Candida glabrata (n=5), las que comparten características fenotípicas con C. guilliermondii. Las identificaciones se realizaron mediante el estudio del perfil bioquímico determinado por dos métodos comerciales, el ID32C (bioMérieux SA, Marcy L´Étoile France) y el Yeast Biochemical Card (YBC) (bioMérieux Vitek, Inc., Hazelwood, Mo.) (1, 7).
El algoritmo propuesto para la identificación de C. guilliermondii se llevó a cabo mediante el aislamiento primario en CHROMagar Candida (CHROMagar Company, Paris, France) a 37 °C, registrándose a las 48 h el aspecto y el color del desarrollo fúngico. Posteriormente, con las levaduras aisladas del medio cromogénico se realizó el estudio micromorfológico, para lo cual se utilizó agar leche-tween 80 al 1%, que se incubó a 28 °C (5). Se realizaron diariamente observaciones microscópicas con aumentos de 200X y 400X hasta completar las 96 h. Se registró el tamaño y la forma de las levaduras, la presencia de blastoconidios y su disposición en el seudomicelio (14). Se evaluó también la asimilación de trehalosa y sacarosa mediante tabletas de diagnóstico (Rosco Diagnostica A/S, Dk 2630 Taastrup), como fue descrito para C. glabrata (8).
El medio CHROMagar Candida ha sido mencionado por diferentes autores por su utilidad en la identificación de Candida (6, 13). El desarrollo en CHROMagar Candida, tanto de C. glabrata como de C. guilliermondii y de C. famata, mostró un color rosado-púrpura que no resultó útil para la diferenciación de estas especies. Este color también es observado en Candida parapsilosis, Candida lusitaniae, Saccharomyces cerevisiae, Prototheca wickerhamii y Cryptococcus neoformans (6).
La observación microscópica de C. guilliermondii a 200X a las 48 h mostró levaduras pequeñas, ovoides y brotantes, de 3 a 5 µm, que no formaron seudomicelio. Posteriormente se comenzó a observar un conglomerado característico de seudohifas con disposición radiada, las cuales se encontraban bien desarrolladas a las 96 h de incubación (Figura 1). Las cepas de C. glabrata y C. famata se mostraron siempre como levaduras pequeñas, brotadas y sin seudohifas, lo que nos llevó a realizar los ensayos de asimilación de trehalosa y sacarosa. Todos los aislamientos de C. glabrata dieron positiva la prueba de utilización de trehalosa y negativa la de sacarosa (8); por el contrario, los aislamientos de C. guilliermondii y de C. famata fueron positivos para utilización de sacarosa y negativos para utilización de trehalosa (8). La diferenciación de las variedades de C. guilliermondii es sólo posible con el uso de las tradicionales pruebas de fermentación y de asimilación, que son laboriosas y actualmente sólo se emplean en los laboratorios de referencia (2).

Figura 1. Aspecto microscópico de C. guilliermondii sobre agar leche-tween 80 al 1%. Observación a 200X (96 h de incubación a 28 °C).

Las identificaciones realizadas fueron validadas mediante el análisis del perfil bioquímico establecido por dos métodos comerciales, el ID32C y el YBC, y resultaron concordantes en el 100% de los casos. Con el primero de los equipos comerciales, la identificación de C. guilliermondii mostró que en el 75% de los casos daba como segunda opción a C. famata, con porcentajes de confianza inferiores al 10%. Los mismos estudios realizados con el YBC nos permitieron identificar a las 48 h a C. guilliermondii, con porcentajes de confianza mayores del 90%, y en el 64% de los casos mostraron como segunda opción a C. famata, con una confianza que osciló entre el 1 y el 9%. Estos datos nos indican que los estudios bioquímicos siempre deben estar acompañados de las observaciones micromorfológicas, en especial si se debe diferenciar entre C. guilliermondii y C. famata.
De acuerdo con nuestro algoritmo (Figura 2), el color rosado-púrpura de las colonias en CHROMagar Candida, la observación de levaduras pequeñas, ovoides y brotantes, de 3 a 5 µm, que no formaban seudomicelio a las 48 h para posteriormente (a las 96 h) formar un conglomerado de seudohifas y el resultado positivo para asimilación de sacarosa y negativo para asimilación de trehalosa nos permitieron concluir que la levadura en estudio se trataba de C. guilliermondii.

Figura 2. Algoritmo para la identificación de C. guilliermondii

Agradecimientos: se agradecen los valiosos aportes de los Dres. Ricardo Negroni y C. Iovannitti en la revisión de este trabajo. El trabajo ha sido subvencionado por el proyecto UBACyT M-087.

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Recibido: 5/06/06
Aceptado: 26/03/07