Patrones de resistencia a antibióticos de enterococos aislados de aguas estuarinas

M. Baldini*, P. Selzer

Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur. San Juan 670 (8000) Bahía Blanca, Argentina

* Correspondencia. E-mail: mbaldini@criba.edu.ar

RESUMEN

La llegada al ambiente de bacterias antibiótico-resistentes compromete su calidad higiénico sanitaria. Se analizó la prevalencia de diferentes especies de Enterococcus en aguas del estuario de Bahía Blanca y sus patrones de resistencia a los antibióticos. Se identificaron bioquímicamente 103 aislamientos . Para evaluar la resistencia a antibióticos se implementó la técnica de difusión en agar utilizando discos de vancomicina (Van 30 µg), gentamicina (GenH 120 µg), estreptomicina (StrH 300 µg), teicoplanina (T 30 µg), ampicilina (Am 10 µg) y ciprofloxacina (CIP 5 µg), según normas del Clinical and Laboratory Standards Institute. Se identificaron siete especies de Enterococcus; Enterococcus faecium y Enterococcus faecalis resultaron ser las más frecuentes. El 1,9% de los enterococos presentó resistencia de alto nivel a los aminoglucósidos y no hubo aislamientos con resistencia simultánea a StrH y GenH. El 12,6% de los aislamientos resultó resistente a CIP. No se detectaron resistencias a los glucopéptidos, ni a la Am. El 34% de los aislamientos fue sensible a todos los antibióticos probados. Tradicionalmente, la vigilancia de la dispersión de resistencias bacterianas se realiza con microorganismos de muestras clínicas. Los hallazgos de este trabajo constituyen un dato relevante para el control de cepas resistentes, las que se creían circunscriptas al ámbito hospitalario y que, sin embargo, se encuentran circulando en el ambiente.

Palabras clave: Resistencia a los antibióticos; Enterococcus spp.; Aguas estuarinas

ABSTRACT

Antibiotic resistance patterns of enterococci isolated from estuarine waters. The introduction of antibioticresistant bacteria to the environment, affects its hygienic-sanitary quality. The objective of this work is to study the prevalence and the antibiotic resistance patterns of enterococci species isolated from Bahía Blanca estuarine waters. One hundred and three isolates were biochemically identified as Enterococcus spp. The diffusion technique was implemented, by using disks of: vancomycin (Van 30 µg), gentamicin (GenH 120 µg), streptomycin (StrH 300 µg), teicoplanin (T 30 µg), ampicillin (Am 10 µg) and ciprofloxacin (CIP 5 µg) according to the Clinical and Laboratory Standards Institute. Seven Enterococcus species were identified, being Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis the most frequent. High level resistance to aminoglycosides was shown by 1.9% of the enterococci whereas 12.6% of the isolates were resistant to CIP. No isolates showed simultaneous resistance to StrH and GenH. Neither resistance to glycopeptides nor to Am was detected. Thirty four per cent of the isolates exhibited susceptibility to all antibiotics tested. Surveillance studies on antimicrobial resistance are usually based upon microorganisms isolated from clinical samples. The findings of this work constitute relevant data for the control of resistant strains, which were believed to be circumscribed to the hospital environment, but are also widespread in the natural sites.

Key words: Antibiotic-resistance; Enterococcus spp.; Estuarine waters

Desde la introducción de los antibióticos para el tratamiento de las enfermedades infecciosas, el número de bacterias resistentes ha aumentado en forma notable. Dado que la vigilancia de la resistencia a los antibióticos se ha realizado, en la mayoría de los casos, con microorganismos aislados de muestras clínicas, se deberían estudiar las bacterias de origen ambiental, a fin de conocer su posible papel como reservorio de genes codificadores de resistencia y su capacidad para transferirlos horizontalmente a los microorganismos patógenos humanos que compartieran el mismo hábitat ⁽¹⁴⁾. Estas bacterias resistentes pueden ser transportadas bajo ciertas circunstancias al alimento, agua de bebida o de baño, etc., lo cual conduce a su recirculación ⁽¹⁵⁾.
En los últimos años los enterococos han recibido una creciente atención, ya que se ha observado un incremento notable de las infecciones en las que estos microorganismos se presentan como microbiota única ⁽¹⁴⁾. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la prevalencia de diferentes especies de enterococos en aguas del estuario de Bahía Blanca y conocer sus patrones de resistencia a los antibióticos, ya que éstos podrían ser buenos indicadores de las consecuencias ambientales del uso intensivo y extensivo de antibióticos en medicina humana y veterinaria ⁽³⁾.
La zona de estudio fue el estuario de Bahía Blanca, ubicado al sudoeste de la provincia de Buenos Aires. Este recibe los efluentes cloacales, insuficientemente tratados, de Bahía Blanca y otras poblaciones menores. Asimismo, estas aguas se utilizan con fines recreativos como baño, pesca y deportes náuticos.
Entre abril de 2005 y mayo de 2006 se recolectaron 40 muestras de agua subsuperficial (30 cm de profundidad). El tiempo transcurrido entre la recolección y el análisis bacteriológico nunca excedió las 6 horas ⁽¹⁾. Se obtuvieron 103 aislamientos utilizando la técnica de filtración por membrana ⁽¹⁾ y el medio de cultivo KF (Biokar Diagnostics Beauvais, Francia), luego de 48 horas de incubación a 35 °C. De las colonias típicas se hicieron coloraciones de Gram. Los aislamientos que presuntivamente resultaron enterococos se reaislaron en PCA (Merck, Alemania) y se sometieron a las siguientes pruebas bioquímicas: catalasa, Pyr- A- Enterococos (Laboratorios Britania, Buenos Aires, Argentina) ⁽¹⁰⁾, habilidad de crecer en 6,5% de NaCl ⁽¹⁾, hidrólisis de esculina en presencia de sales biliares ⁽⁴⁾, LAP (Laboratorios Britania) y observación de cadenas en caldo tioglicolato ⁽¹⁰⁾.
Se estudió la sensibilidad a los antibióticos por el método de difusión con discos (Laboratorios Britania) de: vancomicina (Van 30 µg), gentamicina de alta carga (GenH 120 µg), estreptomicina de alta carga (StrH 300 µg), teicoplanina (T 30 µg), ampicilina (Am 10 µg) y ciprofloxacina (CIP 5 µg). Se siguieron las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute ⁽⁵⁾. La identificación específica de los enterococos se realizó de acuerdo con lo descrito por Manero y Blanch ⁽⁹⁾, con las actualizaciones presentadas por Martins Teixeira y Facklam ⁽¹⁰⁾.
No se aislaron enterococos resistentes a Van (ERV), los valores de los halos de inhibición fueron muy superiores al punto de corte de sensibilidad, de 17 mm. Estos resultados coinciden con datos obtenidos para cepas aisladas de muestras clínicas en nuestra ciudad (Dr. Maurizzi, comunicación personal). Sin embargo, difieren de lo hallado en el país en los períodos 1996-2000 y 2001-2005, donde el porcentaje de ERV fue 3% para E. faecalis y 70% para E. faecium ⁽¹³⁾. Se identificó una cepa de Enterococcus gallinarum sensible a Van. Si bien es conocido que se trata de una especie intrínsecamente resistente a este antibiótico, suele desarrollar como sensible en las pruebas de difusión en agar ⁽¹²⁾. Ninguna de las cepas estudiadas presentó resistencia a T y su promedio de halo de inhibición fue de 18,5 mm, superior al valor límite de sensibilidad de 14 mm.
Se aisló una cepa resistente (1%) y otra con resistencia intermedia (1%) a la GenH, ambas fueron identificadas como E. faecalis. Se detectó una cepa (1%) de Enterococcus durans resistente y otra de E. faecium (1%) con resistencia intermedia a la StrH (Tabla 1). No se aislaron cepas con resistencia simultánea a ambos antibióticos. El 12,6% de los enterococos aislados fue resistente a CIP y el 58,2% fue clasificado como intermedio. Sólo un 29,1% de las cepas fue sensible a este antibiótico. Estos porcentajes son similares a los obtenidos en cepas de origen clínico en nuestra ciudad durante 2006 (Dra. Pérez, comunicación personal). Los aislamientos resistentes fueron identificados como E. faecium, E. faecalis, E. durans, Enterococcus raffinosus y Enterococcus hirae. Las cepas de E. faecium presentaron mayores porcentajes de resistencia y resistencia intermedia a CIP que las de E. faecalis (Tabla 1).

Tabla 1. Perfiles de resistencia a antibióticos de Enterococcus spp. aislados de aguas del estuario de Bahía Blanca

No se aislaron cepas con resistencia a Am, en coincidencia con lo hallado clínicamente en nuestra ciudad y con lo informado por el Sistema Informático de Resistencia durante 2002 y 2003 para cepas de E. faecalis y E. faecium de origen extra e intrahospitalario. El valor promedio del halo de inhibición para Am fue 24,7 mm, muy superior al punto de corte de sensibilidad.
Uno de los principales problemas de los enterococos ha sido la aparición de cepas multirresistentes ⁽⁸⁾. En este estudio, sólo en uno de los aislamientos se observó resistencia intermedia simultánea a GenH y CIP, éste se identificó como E. faecalis. Del total de cepas estudiadas, el 34% fue sensible a todas las drogas probadas.
Las especies más frecuentes fueron E. faecium y E. faecalis, y juntas se aproximaron al 70% de los aislamientos. En menor porcentaje se hallaron E. durans, E. hirae, E. raffinosus, Enterococcus dispar y E. gallinarum (Tabla 1). Una de las cepas dio las pruebas bioquímicas como Enterococcus solitarius, pero estudios recientes han demostrado que este microorganismo está más relacionado filogenéticamente con el género Tetragenococcus que con los enterococos. Ennahar y Cai ⁽⁶⁾ proponen reclasificarlo como Tetragenococcus solitarius comb. nov. Siete cepas aún no pudieron ser identificadas a nivel de especie.
En relación con las especies de enterococos aisladas, estos resultados concuerdan ampliamente con lo hallado por otros autores en muestras de lechuga ⁽¹⁴⁾, si bien difieren los porcentajes de cada una de ellas. Esto podría deberse, entre otros factores, a los esquemas de clasificación utilizados -la taxonomía del género está en permanente revisión- o a la metodología empleada, debido a que se registran discrepancias de resultados entre los sistemas bioquímicos convencionales y los comerciales. El predominio de E. faecium sobre E. faecalis coincidió con lo comunicado en aguas marinas recreacionales de Grecia ⁽²⁾. En el resto de la bibliografía consultada, E. faecalis aparece como la especie más frecuente.
La selección y diseminación de bacterias con resistencias a drogas es un problema creciente que limita la eficacia de la terapéutica antibiótica. Tradicionalmente, la vigilancia de la dispersión de estas bacterias se realiza con microorganismos aislados de muestras clínicas. En el presente trabajo se puso en evidencia que los porcentajes de resistencias hallados en el ambiente estuarino reflejan lo que ocurre en el ámbito clínico ligado a la población de la ciudad de Bahía Blanca.
En este trabajo, además de E. faecium y E. faecalis, se identificaron especies de enterococos que son menos frecuentes en infecciones humanas, pero deben ser consideradas debido a su posible participación como reservorio de genes de resistencia.
Los hallazgos de este trabajo constituyen un dato relevante para tener en cuenta en el control de cepas resistentes, las que se creían circunscriptas al ámbito hospitalario y que, sin embargo, se encuentran circulando en el ambiente.
La incidencia de ERV es aún baja en nuestra región, tanto en el ámbito clínico como ambiental. Esto indica que la Van sigue constituyendo una herramienta útil en manos del médico para enfrentar las sepsis graves producidas por enterococos. Este resultado contrasta con los comunicados en países europeos (7, 11) y en Cuba (8), en los que se encontró una alta prevalencia de ERV en muestras ambientales.
Finalmente, los resultados deberían alertar sobre la posibilidad de que se produzca un ciclo epidemiológico que incluya la dispersión de bacterias resistentes en el ambiente acuático, el cual se constituiría en un reservorio de este tipo de bacterias desde donde sería posible su diseminación a la población en general, a través del uso con fines recreativos de aguas afectadas por efluentes cloacales crudos.

BIBLIOGRAFÍA

1. American Health Association (APHA), American Water Works Association (AWWA) and Water Environment Federation. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 20^th ed. Clesceri LS, Greenberg AE, Eaton AD editores. Washington D.C., 1998.        [ Links ]

2. Arvanitidou M, Katsouyannopoulos V, Tsakris A. Antibiotic resistance patterns of enterococci isolated from coastal bathing waters. J Med Microbiol 2001; 50: 1001-5.        [ Links ]

3. Baldini M, Cabezalí C. Occurrence of antibiotic-resistant Escherichia coli isolated from environmental samples. Mar Pollut Bull 1991; 22: 500-3.        [ Links ]

4. Chuard C, Reller LB. Bile-esculin test for presumptive identification enterococci and streptococci: effects of bile concentration, inoculation technique, and incubation time. J Clin Microbiol 1998; 36: 1135-6.        [ Links ]

5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 15th. informational supplement, 2005; M100-S15. Wayne, Pa, USA.        [ Links ]

6. Ennahar S, Cai Y. Biochemical and genetic evidence for the transfer of Enterococcus solitarius Collins et al. 1989 to the genus Tetragenococcus as Tetragenococcus solitarius comb. nov. Int J Syst Evolut Microbiol 2005; 55: 589-92.        [ Links ]

7. Iversen A, Kühn I, Franklin A, Möllby R. High prevalence of vancomycin-resistant enterococci in Swedish sewage. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 2838-42.        [ Links ]

8. Junco Díaz RA, Suárez Pita MT, Weng Alemán Z, Chiroles Rubalcaba S, González González MI, Díaz Rosa OE, et al. Sensibilidad antimicrobiana en bacterias de origen ambiental. Hig Sanid Ambient 2006; 6: 150-9.        [ Links ]

9. Manero A, Blanch A. Identification of Enterococcus spp. with a biochemical key. Appl Environ Microbiol 1999; 65: 4425-30.        [ Links ]

10. Martins Teixeira L, Facklam R. Enterococci. En: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH, editors. Manual of Clinical Microbiology, Washington, D.C., ASM Press, 2003, p. 422-33.        [ Links ]

11. Novais C, Coque TM, Ferreira H, Sousa JC, Peixe L. Environmental contamination with vancomycin-resistant enterococci from hospital sewage in Portugal. Appl Environ Microbiol 2005; 71: 3364-8.        [ Links ]

12. Palavecino E. Puesta al día en enterococos - año 2001: Identificación de especies y estudio de susceptibilidad antimicrobiana. Rev Chil Infect 2001; 18: 95-100.        [ Links ]

13. Quinteros M, Radice M, Famiglietti A, Giovanakis M, Nicola, F, Casellas JM, et al., Grupo SIR. 10 años de vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos en nuestro país mediante el programa SIR (SADEBAC-AAM). Congreso SADEBAC- 25 Aniversario, 2006, Resumen 16597, p. 17, Buenos Aires, Argentina.        [ Links ]

14. Ronconi M, Merino LA, Fernández G. Caracterización del perfil de susceptibilidad antibiótica de cepas de Enterococcus aisladas de Lactuca sativa (lechuga). Instituto de Medicina Regional UNNE. Comunicación Científico- Tecnológica M030 2002 Sitio de Internet. Disponible en URL: http:/www.unne.edu.ar/Web/cyt/cyt/2002/cyt.htm.        [ Links ]

15. Tschäpe H, Tietze E, Prager R, Heier H. Occurrence in water and waste water of E. coli and coliform bacteria carrying R-plasmids. Part 3: Plasmids encoding gentamicin, trimethoprim or streptomycin resistance. Acta Hydrochim Hidrobiol 1986; 14: 167-74.        [ Links ]

Recibido: 28/12/06
Aceptado: 30/10/07