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Revista argentina de microbiología

versión impresa ISSN 0325-7541versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.40 n.3 Ciudad Autónoma de Buenos Aires jul./sep. 2008

 

Evaluación de dos equipos inmunocromatográficos comerciales para el diagnóstico rápido de la infección por rotavirus

C. J. Téllez 1,2, R. Montava1, Juan M. Ribes1, M. D. Tirado2, J. Buesa1*

1 Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Valencia, Hospital Clínico Universitario de Valencia, Avda. Blasco Ibáñez, 17; 46010 Valencia, España.
2 Servicio de Microbiología, Hospital General de Castellón, Avda. Benicassim, s/n; 12004 Castellón, España.

*Correspondencia. E-mail: Javier.Buesa@uv.es

RESUMEN

Se realizó un estudio prospectivo para evaluar dos equipos comerciales inmunocromatográficos para el diagnóstico rápido de infección por rotavirus a partir de muestras fecales: VIKIA® Rota-Adeno, de bioMérieux, y Simple Rota- Adeno, de Operon. Como método de referencia se utilizó la transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) con cebadores específicos del gen de la proteína VP7 de rotavirus del grupo A. La sensibilidad y la especificidad respecto de la RT-PCR fueron del 98,4% y 84,8% para el Simple Rota-Adeno, y del 100% y 24,2% para el VIKIA® Rota-Adeno. Es de destacar la baja especificidad de este último equipo diagnóstico, que presentó un elevado número de falsos positivos, por lo que el valor predictivo de un resultado positivo es sólo del 71,6%. Asimismo, se identificaron los genotipos de las cepas de rotavirus detectadas; la mayoría de ellas correspondieron al genotipo G9P(8) (65%), seguido de los genotipos G1P(8) (25,4%) y G2P(8) (3,2%).

Palabras clave: Rotavirus; Inmunocromatografía; Diagnóstico rápido; RT-PCR

ABSTRACT

Evaluation of two immunochromatography kits for rapid diagnosis of rotavirus infections. A prospective study was conducted to evaluate two immunochromatography (ICG) commercial kits for diagnosis of rotavirus infection, VIKIA® Rota-Adeno (bioMérieux) and Simple Rota-Adeno (Operon). Reverse transcriptase and polymerase chain reaction (RT-PCR) with specific primers for the VP7 gene of group A rotavirus was used as the reference method. The sensitivity and specificity of the ICG tests compared with those of the reference method were 98.4% and 84.8%, respectively, for Simple Rota-Adeno (Operon), and 100% and 24.2% for VIKIA® Rota-Adeno (bioMérieux). It is remarkable the low specificity of the latter method, which yields a high number of false positive results. The predictive value of a positive result by this method was only 71.6%. Most of the detected rotavirus strains corresponded to genotype G9P(8) (65%), followed by G1P(8) (25.4%) and G2P(8) (3.2%).

Key words: Rotavirus; Immunochromatography; Rapid diagnosis; RT-PCR

Las infecciones por rotavirus son la causa más común de diarrea grave en niños menores de 5 años y se producen en todas las regiones del mundo. Se calcula que estos virus ocasionan más de 125 millones de casos de gastroenteritis aguda y 611.000 fallecimientos anuales (12).
El diagnóstico rápido de las infecciones por rotavirus permite tanto instaurar el tratamiento adecuado y evitar el uso innecesario de antibióticos, como implantar medidas preventivas para evitar la transmisión comunitaria o nosocomial, además de disminuir el número de casos de diarrea de etiología no filiada (13).
Aunque existen distintos métodos para detectar rotavirus en las heces, los más habituales en la práctica clínica son las técnicas inmunológicas (enzimoinmunoensayo, aglutinación con látex e inmunocromatografía), que detectan antígeno de rotavirus del grupo A. Entre estos métodos inmunológicos, el enzimoinmunoensayo es el considerado de referencia por su elevada sensibilidad y especificidad (6). La inmunocromatografía es una técnica introducida más recientemente, y numerosas casas comerciales han desarrollado pruebas para el diagnóstico de rotavirus basados en este método (2). Se trata de métodos diagnósticos sencillos, rápidos, que no requieren instrumental especial y que presentan valores de sensibilidad y especificidad muy similares a los mostrados por el enzimoinmunoensayo (13).
Existen otros métodos para detectar rotavirus pero no están disponibles en muchos laboratorios, como la microscopía electrónica, la inmunomicroscopía electrónica, la electroforesis en gel de poliacrilamida y la transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (RTPCR), tanto convencional como en tiempo real. La RT PCR es la técnica más sensible, aunque de realización más compleja que las técnicas inmunológicas (3).
El objetivo de este estudio fue evaluar y comparar dos de estos equipos diagnósticos inmunocromatográficos que detectan simultáneamente antígenos de rotavirus y de adenovirus, tomando como método de referencia la RT-PCR convencional con cebadores específicos del gen de la proteína VP7 de rotavirus del grupo A.
Se estudiaron 96 muestras de heces correspondientes a otros tantos pacientes que presentaban clínica compatible con gastroenteritis aguda vírica y que procedían de las áreas de salud 2 y 4 de la Comunidad Valenciana (España). Las muestras fueron recogidas durante los meses de invierno de 2006-2007, período con elevada prevalencia de infecciones por rotavirus, especialmente en niños menores de 5 años.
Se utilizaron dos ensayos de inmunocromatografía: VIKIA® Rota-Adeno (bioMérieux) y Simple Rota-Adeno (Operon) para detectar antígeno de rotavirus del grupo A en las heces. Todas las muestras fueron además procesadas por RT-PCR para investigar la presencia de ARN vírico, siendo este método considerado en nuestro estudio como el de referencia.
VIKIA® Rota-Adeno es una técnica inmunocromatográfica que se utiliza para la doble detección cualitativa de rotavirus del grupo A y adenovirus (antígeno de género). La prueba se realiza mediante un dispositivo que contiene un pocillo para dispensar la muestra, donde se mezcla con un conjugado constituido por microesferas de poliestireno de colores azul y rojo, unidas respectivamente a anticuerpos monoclonales anti-rotavirus y antiadenovirus; una zona de prueba con una membrana de cromatografía con un anticuerpo monoclonal anti-rotavirus y un anticuerpo monoclonal anti-adenovirus fijados, y una zona de control con un anticuerpo policlonal anti-IgG de ratón. La muestra migra a lo largo de la membrana durante diez minutos (tiempo de la prueba). La zona de control sirve para comprobar que el procedimiento se ha llevado a cabo correctamente. Si las heces contienen rotavirus se forman complejos antígeno-anticuerpo con anticuerpos monoclonales anti-rotavirus unidos a microesferas de poliestireno que se fijan a los anticuerpos anti-rotavirus de la zona de prueba, visualizándose una línea azul.
La única diferencia entre la técnica anterior y la prueba de Simple Rota-Adeno de Operon es que en esta última los anticuerpos monoclonales contra el antígeno de rotavirus están conjugados a partículas de látex de color rojo. El fundamento y procesamiento de ambas es prácticamente idéntico.
Para la RT-PCR, a partir de suspensiones de las muestras de heces al 10% en tampón fosfato salino (PBS) se efectuó la extracción del ARN bicatenario vírico mediante fenol-cloroformo y purificación con celulosa CF11.
Posteriormente se sintetizó el ADN complementario mediante la reacción de transcripción reversa y amplificación ótidos descritos por Gouvea et al. (9).
Los amplificados de PCR de 1.062 pb de longitud se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1,2% en tampón Tris-borato y se observaron trastinción con bromuro de etidio en un transiluminador de luz UV. Además, se procedió a determinar los genotipos G (VP7) y P (VP4) de las cepas detectadas en este estudio, para analizar si existía alguna correlación entre los resultados obtenidos por ambos métodos inmunocromatográficos y los genotipos de las cepas encontradas. El análisis de los genotipos G y P se realizó por RT-PCR utilizando los cebadores descritos por Gouvea et al. (9) y Gentsch et al. (8). No se óla detección de adenovirus.
Para determinar la sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos de los equipos comerciales, sus resultados se consideraron verdaderos positivos o verdaderos negativos según su concordancia con los resultados de la RT-PCR. Para estudiar dicha concordancia se utilizó la prueba de Kappa (5).
De las 96 muestras estudiadas, 62 (64,5%) resultaron positivas para rotavirus por las tres técnicas. El equipo Simple Rota-Adeno presentó 5 falsos positivos y un solo falso negativo, frente a VIKIA® Rota-Adeno que ofreció 25 falsos positivos y ningún falso negativo (Tabla 1). La sensibilidad y la especificidad respecto de la RT-PCR fueron del 98,4% y del 84,8%, respectivamente, para el Simple Rota-Adeno; y del 100% y del 24,2% para VIKIA® Rota-Adeno (Tabla 2).

Tabla 1. Resultados del diagnóstico de infección por rotavirus mediante el uso de dos equipos comerciales basados en técnicas inmunocromatográficas. Método de referencia: RT-PCR.

Tabla 2. Análisis comparativo de dos equipos inmunocromatográficos comerciales para el diagnóstico de infección por rotavirus

La prueba de Kappa mostró una concordancia del 30% entre el equipo VIKIA® Rota-Adeno y la RT-PCR; y del 88% entre el equipo Simple Rota-Adeno y la RT-PCR. En la Tabla 3 se muestran las combinaciones de genotipos G/P detectadas en este estudio. Se logró determinar el genotipo G y P de las 63 cepas diagnosticadas, y se encontró que el 65% correspondió a la combinación G9P[8]. No se ha encontrado una relación significativa entre los resultados negativos obtenidos por los métodos inmunocromatográficos y los genotipos encontrados en esas muestras.

Tabla 3. Combinaciones de genotipos G y P de las cepas de rotavirus detectadas en las muestras de heces analizadas.

La necesidad de realizar un diagnóstico rápido de las gastroenteritis por rotavirus y de instaurar un tratamiento eficaz de la diarrea ha impulsado el desarrollo de técnicas diagnósticas que disminuyan el tiempo necesario para la obtención de los resultados y que tengan altos niveles de fiabilidad, para orientar el tratamiento de las gastroenteritis y restringir la transmisión de los virus. Las técnicas de aglutinación de látex sensibilizado y, más recientemente, los métodos inmunocromatográficos cumplen estos requerimientos y, por tanto, tienen utilidad en el diagnóstico de las infecciones por rotavirus. En este estudio se llevó a cabo el análisis de los genotipos G y P de las cepas víricas mediante técnicas de PCR multiplex semianidada (8, 9), que han servido, además, para confirmar los resultados positivos de la PCR inicial. Las técnicas de PCR anidada o incluso la PCR en tiempo real pueden actualmente incrementar la sensibilidad de la PCR como método diagnóstico (7).
No hemos encontrado en la bibliografía estudios que evalúen alguna de estas dos técnicas inmunocromatográficas utilizando la RT-PCR como técnica de referencia. Existen estudios en los que se comparan otros métodos inmunocromatográficos comerciales para la detección de rotavirus en heces con técnicas de PCR. Nguyen et al. (10) observaron una sensibilidad y una especificidad del 87,8% y 93,3%, respectivamente, para Dipstick "Eiken" Rota kit, de SA Scientific (8); y Wilhelmi et al. del 98,5% y 96,2%, respectivamente, para Rota- Strip, de Coris BioConcept (13). La sensibilidad encontrada para VIKIA® Rota-Adeno de bioMérieux fue del 100% y superó tanto las cifras anteriores como la hallada para Simple Rota-Adeno de Operon, (98,4%). Sin embargo, la especificidad de VIKIA® Rota-Adeno fue muy baja (24,2%) y, aunque la de Simple Rota-Adeno de Operon fue mucho mejor (84,8%), tampoco alcanza los Bon et al. compararon el test VIKIA® Rota-Adeno con una técnica de enzimoinmunoensayo (Argene, Varilhes, Francia), y encontraron una sensibilidad del 92,5% y una especificidad del 100% (2). Estos resultados difieren mucho de los encontrados por nosotros al comparar dicha técnica con la RT-PCR. En ese estudio se compararon siete ensayos inmunocromatográficos comerciales con un método de ELISA (Argene) y, curiosamente, con ninguno de ellos detectaron falsos positivos. Las técnicas inmunocromatográficas detectan antígenos de la cápside del virus, mientras que la RT-PCR identifica el ARN viral. En principio, las técnicas inmunológicas son menos sensibles que la RT-PCR (11), pero también depende de los métodos de extracción de los ácidos nucleicos, de los cebadores utilizados, de la ausencia de inhibidores inespecíficos de las reacciones enzimáticas y de la estabilidad de los ácidos nucleicos víricos de la muestra (3). Los resultados falsos positivos obtenidos por inmunocromatografía, especialmente con el método Vikia® Rota-Adeno, fueron detectados al realizar la RT-PCR, debido a la mayor especificidad de esta técnica. No se ha podido relacionar la aparición de un resultado positivo con ninguno de los parámetros de las muestras analizadas ni de los datos clínicos de los pacientes. Se ha señalado que la presencia de sangre en las heces puede originar resultados falsos positivos con los métodos inmunocromatográficos (Dr. Pierre Pothier, Universidad de Dijon, Francia, comunicación personal). Otra posibilidad es que se produzca una reacción cruzada de alguno de los anticuerpos con antígenos distintos de los de rotavirus presentes en la muestra.
En el periodo en que se llevó a cabo este estudio, la prevalencia de cepas de genotipo G9 ha sido muy elevada, como queda reflejado en el hecho de que el 65% de las cepas de este ensayo fueron G9P(8). La alta prevalencia del serotipo G9 en nuestra zona geográfica en el periodo estudiado es un dato ya observado (1), y contrasta con la ausencia de este genotipo antes del año 2004 (4).
En conclusión, los métodos inmunocromatográficos pueden ser de gran utilidad en el diagnóstico rápido de las infecciones por rotavirus, si bien es necesario valorar la sensibilidad y la especificidad de los métodos comerciales disponibles, pues pueden existir variaciones importantes entre ellos. Son aplicables como métodos de cribado por su elevada sensibilidad, pero las muestras positivas deberían ser confirmadas con un ELISA de captura o una técnica de RT-PCR.

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Recibido: 06/05/08
Aceptado: 08/08/08

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