SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.41 issue3Ante la predictibilidad de la pandemia, lo impredecible: el virus pandémicoBluetongue virus infection: signaling pathway activated during apoptosis author indexsubject indexarticles search
Home Pagealphabetic serial listing  

Services on Demand

Journal

Article

Indicators

  • Have no cited articlesCited by SciELO

Related links

Share


Revista argentina de microbiología

Print version ISSN 0325-7541On-line version ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. vol.41 no.3 Ciudad Autónoma de Buenos Aires July/Sept. 2009

 

Identificación de antígenos inmunorreactivos de Leptospira interrogans

A. Carrizo1, B. Brihuega2, I. Etchechoury3, A. Arese3, S. Romero4, A. Gioffré3, M. I. Romano3, K. Caimi3*

1Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Jujuy. Alberdi Nº 47, (4600) San Salvador de Jujuy,
2Instituto de Patobiología e
3
Instituto de Biotecnología, Centro de Investigaciones Veterinarias y Agronómicas (CICVyA), Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Los Reseros y Nicolás Repetto s/n, (1712) Castelar, Buenos Aires,
4Estación Experimental INTA, Abra Pampa. Ruta Prov.11, km 17, (4640) Departamento de Cochinoca, Abra Pampa, Jujuy,.Argentina.

*Correspondencia. E-mail: kcaimi@cnia.inta.gov.ar

RESUMEN

Se estudió un lote de 28 sueros de llama (Lama gama) de la provincia de Jujuy, Argentina, a fin de identificar antígenos inmunorreactivos contra Leptospira interrogans. Se utilizaron distintas preparaciones antigénicas de la bacteria para estudiar la inmunorreactividad mediante microaglutinación (MAT), ELISA y Western inmunoblot. Un pool de sueros bovinos positivos a la MAT fue empleado como control. Todos los sueros de llama fueron negativos mediante MAT e igual resultado se observó mediante ELISA. Dos de los 28 sueros de llama y el pool de sueros bovinos positivos, al ser evaluados por Western inmunoblot, arrojaron resultados positivos y permitieron identificar proteínas inmunorreactivas. Por MALDI-TOF se logró establecer que la proteína asociada a los dos sueros de llama inmunorreactivos era una flagelina periplásmica de Leptospira interrogans serovar Lai STR, mientras que la asociada al pool de sueros bovinos positivos a Leptospira sp. se trataba de una lipoproteína de la membrana externa de Leptospira interrogans serovar Ballum, LipL21. Estas proteínas podrían ser utilizadas en el diseño de un nuevo ELISA aplicado al diagnóstico temprano de leptospirosis, ya sea en distintos tipos de ganado como así también en reservorios silvestres.

Palabras clave: Leptospira interrogans; Antígenos; MALDI-TOF

ABSTRACT

Identification of immunoreactive antigens of Leptospira interrogans. A batch of 28 llama (Lama gama) sera from Jujuy province in Argentina was studied in order to identify immune reactive antigens to Leptospira interrogans. Different antigenic preparations from the bacterium were used to study the immune reactivity by the microagglutinattion (MAT), ELISA and Western immunoblot tests. A control pool of positive bovine sera was used. All the llama sera were negative to MAT as well as to ELISA. Two of the llama sera and the positive bovine sera pool rendered positive results when evaluated by Western immunoblot, allowing the identification of immune reactive proteins. These proteins were identified by MALDI-TOF. A periplasmic flagellin of Leptospira interrogans serovar Lai STR called FlaB1 was identified from the reactive llama sera, and an external membrane lipoprotein of Leptospira interrogans serovar Ballum called LipL21 was identified from the pool of bovine positive sera. These proteins could be used in a new ELISA applied to the early diagnosis of leptospirosis in different kind of cattle or wild reservoirs.

Key words: Leptospira interrogans; Antigens; MALDI-TOF

INTRODUCCIÓN

La leptospirosis es una de las enfermedades infecciosas que pueden afectar la reproducción animal, además de tener potencial zoonótico (22). Esta enfermedad está ocasionada, generalmente, por dos especies patógenas principales, Leptospira interrogans y Leptospira borgpetersenii. Estos microorganismos tienen una amplia distribución mundial y la enfermedad que ocasionan es de gran impacto económico, tanto en los rodeos cárnicos como en los lecheros, ya sea por la pérdida de terneros a causa de abortos y mortalidad perinatal como por la disminución de la producción láctea (9, 10). El género Leptospira fue dividido inicialmente en dos especies, L. interrogans y Leptospira biflexa; la primera comprendía las cepas patógenas y la segunda las saprófitas o ambientales. Ambas especies incluyen numerosos serovares definidos por aglutinación luego de la adsorción cruzada con antígenos homólogos (13). Se han identificado más de 60 serovares de L. biflexa y más de 200 de L. interrogans.
En un análisis serológico realizado por Brihuega et al., se demostró que el 60% de las llamas de diferentes regiones de Jujuy eran seropositivas y que los principales serovares reaccionantes eran Icterohaemorrhagiae, Pomona y Grippotyphosa (3). En un estudio posterior en camélidos sudamericanos representados por llamas, vicuñas y guanacos, los serovares más frecuentemente reaccionantes por microaglutinación (MAT) fueron Copenhageni (91%), Castellonis (20,2%) y Canícola (14%) (16). En ese estudio, que abarcó diferentes zonas de Argentina, se aplicó la técnica serovar específica de MAT y se utilizaron los serovares Canicola, Copenhageni, Grippotyphosa, Pomona, Pyrogenes y Wolffi de L. Interrrogans, y Castellonis, Tarassovi y Hardjobovis de L. borgpetersenii.
La leptospirosis tiene un sistema cíclico de diseminación. Los animales silvestres cumplen un papel relevante en la cadena epidemiológica; entre ellos, las ratas se destacan como reservorios y pueden diseminar leptospiras virulentas en el ambiente (1, 14). Los diseminadores pueden ser huéspedes temporarios o fortuitos, o bien portadores crónicos y persistentes. Las llamas podrían ocupar un lugar de preponderancia en la cadena de transmisión, especialmente con respecto a otros animales de producción, como los bovinos.
Se ha observado que leptospira posee varios antí-genos expresados en su superficie, predominantemente lipopolisacáridos (LPS) y proteínas de la membrana externa (OMPs). La gran diversidad de serovariedades ha sido atribuida a las diferencias en la estructura y composición de los LPS (8). Muchos trabajos se han centrado en el papel que cumplen los LPS en la inmunidad y las bases genéticas de su biosíntesis. Al respecto, se demostró que preparaciones de LPS otorgan inmunidad, pero ésta es específica para cada serovariedad. Debido a ello, las investigaciones en antígenos han conducido a las OMPs, que son capaces de estimular una respuesta inmune heteróloga. Se identificaron proteínas como OmpL1 y LipL41, las que en términos antigénicos se encuentran conservadas entre las distintas especies patógenas. Estas OMPs podrían utilizarse para desarrollar productos recombinantes que permitan realizar serodiagnósticos, como así también para elaborar vacunas dirigidas a la prevención de la leptospirosis (2, 5).
En este trabajo se estudió la serología a leptospirosis de un lote de llamas de la Estación Experimental de INTA Abra Pampa, en la provincia de Jujuy. El objetivo fue evaluar en los sueros de dichos animales la reactividad a leptospira, identificar de qué antígenos inmunorreactivos se trataría y, finalmente, establecer si esos antígenos son reconocidos por los sueros de bovinos positivos, con el fin de evaluar posibles reactivos para el diagnóstico de leptospirosis en el futuro.

MATERIALES Y MÉTODOS

Origen de las muestras
Se obtuvo sangre mediante venopunción de 28 llamas (Lama glama) ubicadas en la localidad de Abra Pampa, Departamento de Cochinoca, provincia de Jujuy. Se trataba de 7 crías, 11 hembras adultas y 10 hembras viejas o capones. Si bien los animales no presentaban ninguna signología clínica, el rodeo se halla en una zona de alta incidencia de leptopsirosis en el ganado bovino. A partir de dichas muestras se procedió a la obtención de suero. Como control positivo se utilizó un pool de sueros de bovinos positivos a L. interrogans serovar Pomona, L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae y L. interrogans serovar Hardjo, y como controles negativos se utilizaron cuatro sueros bovinos negativos.

Técnicas para la evaluación de la serorreactividad
1. Microaglutinación (MAT). Técnica de referencia internacional para el diagnóstico de leptospirosis. Se trabajó con una dilución inicial de los sueros de 1 en 100. Las serovariedades de L. interrogans utilizadas en esta técnica fueron Canicola, Copenhageni, Grippotyphosa, Pomona, Pyrogenes, Hardjo y Wolffi. Las de L. borgpetersenii fueron Castellonis y Tarassovi.
2. ELISA. Se desarrolló con antígeno producido en el laboratorio, como se indica a continuación.
3. Western inmunoblot. Se empleó para determinar la presencia de anticuerpos contra la leptospirosis, tanto en los sueros de las llamas como en el grupo de sueros de bovinos positivos y negativos.

Preparaciones antigénicas
Las muestras antigénicas utilizadas fueron obtenidas realizando algunas modificaciones al protocolo descrito por Biswas et al. (2). Se prepararon tres muestras diferentes. La muestra antigénica 1 se obtuvo a partir de un extracto de células de L. interrogans serovar Pomona crecidas en medio líquido EMJH (Difco, EE.UU.). Se trabajó con una densidad óptica (DO420) de 0,35, equivalente a aproximadamente una concentración de 7x108 leptospiras/ml (19). La inactivación de la bacteria se realizó en formol al 10%. Se centrifugó a 5000 g 20 min. El precipitado se lavó dos veces con PBS (solución salina buffer fosfato) 1X. Luego se llevó a ebullición a 100 °C durante 30 min, se conservó en heladera durante 48 h y nuevamente se llevó a ebullición a 100 °C durante 30 min. La muestra antigénica 2 se obtuvo a partir de un extracto de células de L. interrogans serovar Pomona tratadas con detergente [Tritón X-100 al 4% en PBS (Sigma, MO, EE.UU.)]. A 200 µl del precipitado hervido obtenido como se describió anteriormente (muestra 1) se le agregó una proporción 1:1 de Tritón X-100 al 4% en PBS. Se colocó en baño maría a 45 °C durante 4 h. Se centrifugó a 5000 g durante 30 min. Se reservó el precipitado y el sobrenadante. La muestra antigénica 3 se obtuvo a partir de un extracto de células de L. interrogans serovar Pomona sonicado. Una alícuota de 200 µl del precipitado hervido obtenido como se describió con anterioridad (muestra 1) fue procesada en homogeneizador Bio 101 Savant FastPrep FP120 (Lab Centraal, Haarlem, Holanda) con perlas de vidrio (6,5 M/S, 20 seg) tres veces. Posteriormente, se colocó la muestra en hielo durante 5 min y se sonicó en 2 ciclos de 2 min c/u con un sonicador Branson Sonifier 250 (VWR Scientific, CA, EE.UU.). Luego se centrifugó a 5000 g durante 30 min. También en este caso se reservó el precipitado y el sobrenadante.

Protocolo de ELISA
Se utilizaron los sobrenadantes de las preparaciones antigénicas 2 y 3. Estos antígenos se prepararon resuspendiendo 60 µl de sobrenadante tratado con detergente en 4 ml de buffer carbonato y 130 µl de sobrenadante obtenido por sonicación en 6 ml de buffer carbonato. Se agregaron 100 µl de estas preparaciones por pocillo en una placa de 96 pocillos. La fijación del antígeno a los pocillos de las placas de polietileno de fondo plano (Brad-Fordâ) se efectuó durante toda la noche a 4 °C. Al día siguiente se realizaron tres lavados con 300 µl de solución salina por pocillo. Los sueros que serían evaluados fueron adsorbidos con una solución de Mycobacterium phlei en relación 1/1 durante toda la noche a 4 ºC con agitación. A continuación se dispensaron 100 µl del suero a una dilución final de 1/100 en PBS-Tween Gelatina (TG) en cada pocillo. Se colocaron en las placas el grupo de sueros controles positivos y los sueros de bovinos negativos; también se utilizó como control negativo de la reacción buffer carbonato solo. Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en una cámara húmeda, posteriormente se procedió a realizar 3 lavados con 300 µl/pocillo de PBS-TG. A continuación se añadieron 100 µl/pocillo de suero anti-llama marcado con peroxidasa de rábano picante (Bethyl Laboratories, TX, EE.UU.) en una dilución 1/2000 en PBS-TG; los sueros bovinos fueron enfrentados con la proteína G marcada con peroxidasa de rábano (Bio-Rad, CA, EE.UU.) y se incubaron 2 horas en las mismas condiciones antes mencionadas.
Tras 3 lavados con 300 µl de PBS-TG por pocillo, se añadieron 100 µl/pocillo de sustrato PPA (Paratuberculosis Proto-plasmatic Antigen, Allied Monitor, MO, EE.UU.) preparado en el mismo momento de uso y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente en cámara húmeda, en oscuridad y agitación. Finalmente, se procedió a efectuar la lectura de las correspondientes placas con un filtro de 405 nm en un espectrofotómetro ICN Flow Titertek Multiskan PLUS Mk II (ICN, CA, EE.UU.).
Se consideró como serorreactivo al suero cuyo valor de absorbancia (DO) fue mayor o igual que el de los sueros controles positivos.

Geles de SDS-PAGE
Se prepararon por duplicado geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 12%. Uno de los geles fue utilizado para tinción con Coomassie coloidal y el otro para Western inmunoblot. Los geles se prepararon mediante el sistema de minigeles Mini-Protean 3 (Bio-Rad, CA). Para ensayar la preparación antigénica 1, se mezclaron 200 µl de muestra con 100 µl de buffer de siembra 5X y se sembraron 150 µl; de la preparación antigénica 2 (muestra tratada con detergente Tritón X-100 al 4% en PBS), se sembraron 10 y 15 µl de sobrenadante y 10 y 15 µl de precipitado por pocillo. De la preparación antigénica 3 (muestra sonicada) se sembraron 10 y 15 µl de sobrenadante y 10 y 15 µl de precipitado por pocillo. En todos los casos, las muestras se llevaron a una dilución final 4:1 de buffer de craqueo 5X.

Western inmunoblot
Una vez realizada la corrida electroforética de ambos geles, uno de ellos fue teñido con Coomassie coloidal y el otro fue utilizado para la realización del Western inmunoblot. Las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa Hybond-ECL (GE, Buckinghamshire, Inglaterra). La transferencia se realizó a un voltaje constante de 200V durante 1 h utilizando una fuente de poder Power Pac 300 (BioRad). Para verificar que las proteínas se adhirieron a la membrana se tiñó con Rojo Ponceau.
Luego del lavado del Rojo Ponceau, se efectuó el bloqueo de la membrana con leche al 5% en TBS-Tween 0,05% durante 1 hora a temperatura ambiente en agitador. A continuación, la membrana se dividió en tiras para ser enfrentadas a cada uno de los distintos sueros de llama. Se realizó la incubación con una dilución de los sueros 1/50 en solución de bloqueo. Se lavó 3 veces con TBS-Tween 0,05%; cada lavado fue de 10 min en agitador. Posteriormente se incubó con el suero anti-llama marcado con peroxidasa de rábano picante (Bethyl Laboratories) en una dilución 1/2000 en TBS-Tween 0,05%. Se realizaron 3 nuevos lavados de 10 min utilizando la misma solución de lavado en agitador. Se reveló mediante un equipo Pierce ECL Western Blotting Substrate (GE) y se utilizaron Hypercasette Amersham e Hyperfilm Amersham ECL High Performance Chemilumi-nesence (GE) para la exposición.
A fin de evaluar el grupo de sueros bovinos positivos, una vez realizado el inmunoblot con los sueros de las llamas, los anticuerpos se removieron de las membranas. Las membranas se colocaron en un tubo con tapa a rosca que contenía 200 ml de buffer de lavado (100 mM 2-mercaptoetanol; 2% SDS; 62,5 mM Tris-HCl pH 6,7) y se incubó a 50 °C en agitación durante 30 min. Se realizaron dos lavados de 10 min en TBS-T a temperatura ambiente usando grandes volúmenes de buffer. Luego se procedió a bloquear y reiniciar la inmunodetección utilizando el grupo de sueros bovinos positivos. Se repitió el procedimiento descrito anteriormente, pero en este caso el revelado se realizó utilizando como segundo anticuerpo la proteína G marcada con peroxidasa (Bio-Rad).

Identificación de proteínas inmunorreactivas por MALDI-TOF
Luego de identificar las bandas correspondientes a las proteínas reactivas en el inmunoblot, se procedió a ubicar esas mismas bandas en los geles usados para la tinción con Coomassie coloidal (Figura 1). Estas se cortaron de los geles utilizando un bisturí estéril y se enviaron a analizar al Centro de Estudios Químicos y Biológicos por Espectrometría MALDI-TOF (CEQUIBIEM) del Departamento de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA. La digestión con tripsina se llevó a cabo según se describió previamente (12). Se utilizó un equipo Bruker modelo Ultraflex II y la matriz ácido a-ciano-4-hidroxicinámico, la cual se preparó como una solución saturada en 50% de acetonitrilo, 0,1% de ácido trifluo-roacético. Para determinar la identidad de las proteínas se utilizó el programa MASCOT y los hits se consideraron significativos si su evaluación era mayor de 55 (p < 0,05).

Fig1
Figura 1.
Identificación de bandas reactivas a los distintos inmunosueros en SDS-PAGE. Las muestras enviadas a análisis por MALDI-TOF se identificaron como  2.1 (a); 2.2 (b); 3.1 (c); y 3.2 (d).

RESULTADOS

Mediante la aplicación de la técnica de MAP y utilizando los serovares Canicola, Copenhageni, Grippo-typhosa, Pomona, Pyrogenes, Hardjo, y Wolffi de L. interrogans y los serovares Castellonis y Tarassovi de L. borgpetersenii, todos los sueros de llama evaluados fueron negativos. Por esta razón se decidió aplicar otras dos técnicas serológicas que permitieran incrementar la sensibilidad y la especificidad, además de probar tres mezclas antigénicas obtenidas de distinto modo. Se ensayó un extracto crudo de L. interrogans serovar Pomona y dos preparaciones antigénicas más, las preparaciones 2 y 3, obtenidas según se describe en materiales y métodos. De cada una de ellas se utilizó el precipitado y el sobrenadante. Las muestras antigénicas 2 y 3 se ensayaron mediante un ELISA diseñado como se describió antes. Los resultados mostraron que los sueros de las llamas no fueron reactivos a dichos ELISA. Solamente el grupo de sueros de bovinos positivos dio positivo a esta prueba cuando se utilizó como antígeno la muestra antigénica 3 (extracto de L. interrogans serovar Pomona sonicado).
Los sueros de las llamas reaccionaron inespecí-ficamente en los ensayos de inmunoblot, empleando las distintas muestras antigénicas, con un intenso ruido de fondo, particularmente en el caso del precipitado. Sin embargo, los sueros de dos de estos animales (llama 22 y llama 25) reconocieron en el Western inmunoblot una proteína inmunorreactiva al tomar contacto con el sobrenadante de la preparación antigénica 3 (extracto sonicado). Por otra parte, los sueros de bovinos positivos reconocieron otra proteína en dicha preparación. Con el objeto de identificar dichas proteínas inmunorreactivas, se cortaron del gel SDS-PAGE teñido con Comassie coloidal las bandas correspondientes y se procesaron para el análisis de secuenciación por MALDI-TOF (Figura 1). A aquellas provenientes del suero de las llamas 22 y 25 se las identificó como muestras 2.1 y 2.2, y les correspondió un peso molecular entre 30 y 45 kDa; mientras que a las provenientes del grupo de sueros bovinos, asociadas a un peso molecular entre 21 y 30 kDa, se las identificó como muestras 3.1 y 3.2. 
A partir de las muestras identificadas como 2.1 y 2.2, de igual peso molecular, se obtuvo un resultado similar. El patrón de péptidos obtenido arrojó un puntaje de 82 y 67, respectivamente, y un porcentaje de cobertura de la secuencia total del 35% y 33% de una proteína denominada flagelina periplásmica de L. interrogans serovar Lai STR (LA2017, FlaB1) (17), que corresponde a la cepa de L. interrogans completamente secuenciada. Esta proteína tiene una homología del 71% con la proteína perteneciente a la cepa L. interrogans serovar Pomona a partir de la cual se obtuvieron las muestras.
A partir de las muestras identificadas como 3.1 y 3.2 del grupo de sueros bovinos positivos, se obtuvo un puntaje de 126 y 109 respectivamente, asociado a una lipoproteína de la membrana externa de L. interrogans serovar Ballum denominada LipL21 (5), que tiene una homología con L. interrogans serovar Pomona del 98%.

DISCUSIÓN

Con el objeto de identificar antígenos que permitan evaluar la serorreactividad como método de diagnóstico de leptospirosis, se estudiaron sueros provenientes de un lote de llamas del norte de nuestro país y diferentes sueros controles bovinos.
Se aplicó en primera instancia la técnica de MAT y se evaluaron los sueros contra distintos serovares. Dicha técnica arrojó resultados negativos en todos los sueros estudiados. Si bien la MAT es el método de referencia para el diagnóstico serológico de leptospirosis, esta técnica es compleja de realizar debido a que requiere el mantenimiento del cultivo de los distintos serovares que se van a evaluar, con el consecuente riesgo de contaminación cruzada entre distintos serogrupos (17). Por otra parte, presenta una baja sensibilidad, especialmente en la fase convaleciente de la enfermedad, donde la seroconversión ya ocurrió (14). Los resultados aquí obtenidos demuestran que esta técnica no fue efectiva en el diagnóstico de leptospirosis en el lote de llamas evaluado, probablemente debido a que la fase de infección en la que se encontraban los animales al momento de la toma de muestras estaba por fuera del rango de detección, el que se ubica específicamente en la fase aguda de la enfermedad, entre la primera y segunda semana de infección.
Por estos motivos se decidió evaluar estos mismos sueros y sueros controles bovinos mediante la aplicación de un ELISA desarrollado en el laboratorio y luego mediante Western inmunoblot, a fin de identificar posibles antígenos que permitan mejorar el diagnóstico. En el ELISA se emplearon dos tipos de antígenos preparados a partir de extractos de la bacteria tratados de distinta forma: las muestras antigénicas 2 y 3, constituidas por extractos de L. interrogans serovar Pomona tratados con detergente o sonicados, respectivamente. Los tratamientos utilizados para la preparación de las muestras antigénicas fueron elegidos en virtud de la facilidad para su obtención, ya que este es un aspecto práctico central si estas técnicas logran implementarse en los laboratorios veterinarios (2).
Ni con la técnica de MAT ni con la de ELISA fue posible obtener un resultado positivo para los distintos sueros de llama evaluados al utilizar como punto de corte el valor obtenido en los sueros de bovinos positivos. Si bien el ELISA es un método que se emplea en el diagnóstico de leptospirosis, es probable que las mezclas antigénicas no permitieran obtener la sensibilidad necesaria para la detección positiva. Asimismo este resultado, conjuntamente con los resultados obtenidos por MAT, indica que la leptospirosis tendría una incidencia muy baja en este rodeo de llamas. Sin embargo, dos de los sueros de estos animales fueron capaces de reconocer algunas proteínas presentes en el extracto de leptospira al realizar el ensayo de inmunoblot. Esto podría deberse a que la sensibilidad en el reconocimiento antígeno-anticuerpo que se produce en Western inmunoblot es mucho mayor que la que ocurre en la prueba de ELISA. A partir de estos resultados y como objetivo de este trabajo, dichas proteínas fueron secuenciadas con el objeto de establecer su identidad. Lo mismo se realizó con las proteínas reconocidas a partir de los sueros de bovinos positivos.
Los resultados obtenidos por MALDI-TOF permitieron identificar proteínas de Leptospira sp., posiblemente involucradas en la respuesta inmune contra esta bacteria (21, 20).
La proteína FlaB1, reconocida por dos de los sueros de llama estudiados, fue caracterizada previamente por Lin et al. a partir de un tamizaje de una genoteca de anticuerpos monoclonales, donde uno de ellos presentó inmunorreactividad frente a este antígeno (15). Asimismo, esta proteína forma parte del proteoma de superficie de Leptospira sp. (6), y si bien no es una de las proteínas mayoritarias de superficie, podría ser considerada como posible inmunógeno.
La proteína LipL21 es la segunda proteína en preponderancia relativa en la superficie celular de Leptospira sp. (6), motivo por el cual su reconocimiento por sueros de animales positivos a leptospira fue un resultado básicamente confirmatorio respecto del empleo de este antígeno como herramienta diagnóstica para la detección de esta enfermedad (20). LipL21 pertenece a la familia de lipoproteínas preponderantes de leptospira, como por ejemplo LipL32, principal proteína de la superficie celular (11, 6). Estas lipoproteínas se utilizan en la actualidad para el diagnóstico. LipL32 ha sido propuesta recientemente como alternativa a la técnica de MAT en el diagnóstico serológico bovino (4).
De acuerdo a los resultados obtenidos en este trabajo, que confirman lo observado en trabajos previos, la inclusión tanto de LipL21 como de LipL32 en un nuevo ELISA aplicado al diagnóstico veterinario podría incrementar la sensibilidad y especificidad lograda actualmente por la MAT. Esto sería de gran importancia para el control de esta enfermedad, especialmente en animales de producción. Asimismo, conforme con el resultado obtenido respecto de la proteína FlaB1 en los sueros de llama, sería de sumo interés su producción como proteína recombinante para el análisis de sueros derivados de distintos animales, a fin de comprobar su utilidad diagnóstica respecto de esta enfermedad.

BIBLIOGRAFÍA

1. Babudieri B. Animal reservoirs of leptospirosis. Ann N Y Acad Sci 1958; 70: 393-413.        [ Links ]

2. Biswas D, Roy S, Vijayachari P, Sugunan A, Natarajaseenivasan K, Sehgal SC. Comparison of immune reactive proteins of commonly circulating serogroups of Leptospira in Andaman Islands, India. Indian J Med Res 2005; 121: 151-8.        [ Links ]

3. Brihuega B, Leoni L, Martínez Vivot M. Leptospirosis en llamas (Lama glama): estudio serológico. Rev Argent Prod Anim 1996; 16: 393-6.        [ Links ]

4. Bomfim MR, Ko A, Koury MC. Evaluation of the recombinant LipL32 in enzyme-linked immunosorbent assay for the serodiagnosis of bovine leptospirosis. Vet Microbiol 2005; 109: 89-94.        [ Links ]

5. Cullen PA, Haake DA, Bulach DM, Zuerner RL, Adler B. LipL21 is a novel surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species. Infect Immun 2003; 71: 2414-21.        [ Links ]

6. Cullen PA, Xu X, Matsunaga J, Sanchez Y, Ko AI, Haake DA, et al. Surfaceome of Leptospira spp. Infect Immun 2005; 73: 4853-63.        [ Links ]

7. de la Peña-Moctezuma A, Bulach DM, Adler B. Genetic differences among the LPS biosynthetic loci of serovars of Leptospira interrogans and Leptospira borgpetersenii. FEMS Immunol Med Microbiol 2001; 31: 73-81.        [ Links ]

8. Faine S. Guidelines for the control of leptospirosis. World Health Organization, Geneva, Switzerland, 1982; 67: 59.        [ Links ]

9. Galton M. Leptospirosis: epidemiology, clinical manifestation in man and animals, and methods in laboratory diagnosis. U. S. Public Health Service Publication 1962; 951: 70.        [ Links ]

10. Gigles C, Thoen Ch O. Pathogenesis of bacteria infection in animals. lowa State University Press, Ames, 1986, p. 227.        [ Links ]

11. Haake DA, Chao G, Zuerner RL, Barnett JK, Barnett D, Mazel M, et al. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infect Immun 2000; 68: 2276-85.        [ Links ]

12. Hunter TC, Yang L, Zhu H, Majidi V, Bradbury EM, Chen X. Peptide mass mapping constrained with stable isotope-tagged peptides for identification of protein mixtures. Anal Chem 2001; 73: 4891-902.        [ Links ]

13. Kmety E, Dikken H. Classification of the species Leptospira interrogans and history of its serovars. University Press Groningen, Groningen, The Netherlands, 1993, p. 104.        [ Links ]

14. Levett, PN. Leptospirosis: re-emerging or re-discovered disease? J Med Microbiol 1999; 48: 417-8.        [ Links ]

15. Lin M, Surujballi O, Nielsen K, Nadin-Davis S, Randall G. Identification of a 35-kilodalton serovar-cross-reactive flagellar protein, FlaB, from Leptospira interrogans by N-terminal sequencing, gene cloning, and sequence analysis. Infect Immun 1997; 65: 4355-9.        [ Links ]

16. Llorente P, Leoni L, Martínez Vivot M. Leptospirosis en camélidos sudamericanos. Estudio de prevalencia serológica en distintas regiones de la Argentina. Arch Med Vet 2002; 34: 59-68.        [ Links ]

17. Martin L, Pettit A. Sero-diagnostic de la spirochaetose icterohaemorrhagique. Bull Mem Soc Med Hop Paris 1918; 42: 672-5.        [ Links ]

18. Mitchison M, Rood JI, Faine S, Adler B. Molecular analysis of a Leptospira borgpetersenii gene encoding an endoflagellar subunit protein. J Gen Microbiol 1991; 137: 1529-36.        [ Links ]

19. Louvel H, Picardeau M. Genetic manipulation of Leptospira biflexa. Curr Protoc Microbiol 2007; Chapter 12: Unit 12E.4.        [ Links ]

20. Qiu XF, Xu HF, Guo ZQ, Wang J, Yan J. Establishment and application of ELISAs based on rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2 fusion antigen of Leptospira interrogans. Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 2008; 37: 592-8.         [ Links ]

21. Sakolvaree Y, Maneewatch S, Jiemsup S, Klaysing B, Tongtawe P, Srimanote P, et al. Proteome and immunome of pathogenic Leptospira spp. revealed by 2DE and 2DE-immunoblotting with immune serum. Asian Pac J Allergy Immunol 2007; 25: 53-73.         [ Links ]

22. World Health Organization. Leptospirosis worldwide. Wkly Epidemiol Res 1999; 74: 237-42.        [ Links ]

Recibido: 31/03/09
Aceptado: 07/08/09

Creative Commons License All the contents of this journal, except where otherwise noted, is licensed under a Creative Commons Attribution License