ARTÍCULO ESPECIAL

Toxinas de Clostridium perfringens

W. E. Morris*, M. E. Fernández-Miyakawa

Instituto de Patobiología, Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Los Reseros y Las Cabañas, (1712) Castelar, Pcia. Buenos Aires, Argentina

*Correspondencia. E-mail: wmorris@cnia.inta.gov.ar

RESUMEN

Clostridium perfringens es un bacilo grampositivo anaerobio con capacidad de formar esporas. Es uno de los patógenos bacterianos con mayor distribución en el medio ambiente, ya que puede ser aislado de muestras de suelo y de agua y además forma parte de la microbiota intestinal de animales y humanos. Sin embargo, en ciertas ocasiones puede actuar como patógeno oportunista y causar enfermedades como la gangrena gaseosa, la enterotoxemia del ovino y del caprino y la disentería del cordero, entre otras. En humanos, está asociado a enfermedades como la intoxicación por alimentos, la enterocolitis necrotizante en niños y la enteritis necrótica o pigbel de las tribus de Papúa-Nueva Guinea. El renovado interés que existe actualmente en el estudio de C. perfringens como patógeno veterinario y humano, junto con el avance de la biología molecular, han hecho posible que la ciencia tenga hoy un conocimiento más profundo sobre la biología y la patogenia de esta bacteria. En esta revisión bibliográfica se discuten y actualizan los principales aspectos de la patogenia intestinal de C. perfringens teniendo en cuenta las toxinas con mayor importancia médica descritas hasta el presente.

Palabras claves: Clostridium perfringens; Toxinas; Enterotoxemia.

ABSTRACT

Toxins of Clostridium perfringens. Clostridium perfringens is an anaerobic gram-positive spore-forming bacillus. It is one of the pathogens with larger distribution in the environment; it can be isolated from soil and water samples, which also belongs to the intestinal flora of animals and humans. However, on some occasions it can act as an opportunistic pathogen, causing diseases such as gas gangrene, enterotoxemia in sheep and goats and lamb dysentery, among others. In human beings, it is associated to diseases such as food poisoning, necrotic enterocolitis of the infant and necrotic enteritis or pigbel in Papua-New Guinea tribes. The renewed interest existing nowadays in the study of C. perfringens as a veterinarian and human pathogen, together with the advance of molecular biology, had enabled science to have deeper knowledge of the biology and pathology of these bacteria. In this review, we discuss and update the principal aspects of C. perfringens intestinal pathology, in terms of the toxins with major medical relevance at present.

Key words: Clostridium perfringens; Toxins; Enterotoxemia.

INTRODUCCIÓN

Clostridium perfringens es un bacilo grampositivo anaerobio con capacidad de formar esporas ⁽¹²⁴⁾. Pertenece al género Clostridium, el cual está compuesto por aproximadamente 150 especies, filogenéticamente heterogéneas, que no representan un taxón coherente ⁽¹¹⁴⁾. Algunos clostridios son patógenos y causan enfermedades, principalmente por efecto de potentes toxinas extracelulares. Entre las especies patógenas más conocidas se encuentran Clostridium botulinum, C. tetani y C. difficile ⁽¹¹⁰⁾.
En la última década, el uso generalizado de la PCR y el secuenciamiento genómico han producido importantes avances en el aislamiento, la identificación y la caracterización de distintas bacterias, incluyendo a los clostridios ⁽¹³¹⁾. Además, la posible utilización de estos microorganismos como armas biológicas en acciones de bioterrorismo ha incrementado el interés de muchos gobiernos en su estudio ^{(93, 107)}. Tal es el caso de algunas especies de Clostridium como C. botulinum, considerado clase A por el Centers for Disease Control de EE. UU. (CDC), y de la toxina épsilon de C. perfringens tipos B y D, que es considerada clase B por el citado organismo ^{(61, 93, 108)}.
C. perfringens, previamente denominado Clostridium welchii ⁽⁷⁴⁾, es uno de los miembros del género Clostridium que ha sido objeto de renovado interés en el campo científico por sus características biológicas y su importancia biomédica. C. perfringens es uno de los patógenos bacterianos más ampliamente distribuidos en el medio ambiente ⁽¹²⁸⁾. Puede ser aislado de muestras de suelo y de agua y forma parte de la flora intestinal de animales y humanos ⁽⁸¹⁾. Sin embargo, C. perfringens puede en ciertas ocasiones comportarse como un patógeno oportunista. En la producción ganadera este hecho reviste gran importancia por ser el agente causal de enfermedades como la gangrena gaseosa, la enterotoxemia del ovino y del caprino, y la disentería del cordero, entre otras ^{(11, 66, 109, 121)}. En humanos, por su parte, está asociado a enfermedades como la intoxicación por alimentos, la enterocolitis necrotizante en niños y la enteritis necrótica o pigbel de las tribus de Papúa-Nueva Guinea ^{(63, 109)}.

La bacteria
C. perfringens no presenta motilidad y forma esporas in vitro sólo en medios de cultivo especiales ⁽⁹¹⁾. Crece rápidamente en medios ricos en carbohidratos en los que produce, mediante la fermentación de éstos, grandes cantidades de hidrógeno y dióxido de carbono, que ayudan a mantener el ambiente anaeróbico. Sin embargo, C. perfringens es relativamente aerotolerante ⁽⁶⁶⁾. Ha sido, además, la primera bacteria grampositiva de la cual fue posible obtener el mapa genómico completo ⁽¹⁵⁾. Este hecho fue facilitado por su relativa tolerancia al oxígeno, rápido crecimiento y, sobre todo, por su capacidad para ser manipulado genéticamente ⁽⁹¹⁾.
Las cepas de C. perfringens pueden poseer una cápsula cuya composición en carbohidratos varía entre aislamientos; esto permite su serotipificación capsular ⁽¹¹⁷⁾. Este método de clasificación fue empleado con éxito entre los años 1950 y 1980 para investigar los brotes de intoxicación por alimentos asociados a C. perfringens en Inglaterra ⁽¹¹⁷⁾. Sin embargo, la técnica no fue tan efectiva durante la investigación de brotes ocurridos en EE.UU. y Japón. En la actualidad, la toxinotipificación es el método más difundido de clasificación de C. perfringens. Este método tipifica a la bacteria en cinco tipos (A, B, C, D y E) según la producción de las toxinas alfa, beta, épsilon y iota (Tabla 1). Sin embargo, la virulencia de C. perfringens se debe no solo a estas cinco toxinas, sino también a un repertorio compuesto, hasta el momento, de 15 toxinas proteicas ^{(91, 110)}. Dentro del resto de las toxinas no utilizadas en la clasificación, pero importantes desde el punto de vista patológico, se encuentra la enterotoxina de C. perfringens o CPE, responsable de diarreas en humanos y animales; la recientemente descubierta toxina NetB, relacionada con la enteritis necrótica en aves ⁽⁵³⁾; y la toxina beta-2, aparentemente asociada a ciertos cuadros de enteritis ⁽¹¹⁰⁾.

Tabla 1. Clasificación de C. perfringens basada en la producción de toxinas

Clostridium perfringens es un microorganismo con alto grado de intercambio genético; esto le permite la transferencia de factores de virulencia y le otorga la capacidad de producir las diferentes toxinas como resultado de la pérdida o la ganancia de los genes específicos ^{(15, 44)}. Es decir que no existen grandes diferencias entre los diferentes tipos de C. perfringens, a no ser el acarreo de ciertos genes de virulencia. Por otro lado, cierta evidencia indica que algunos de estos factores de virulencia, codificados en plásmidos, pueden ser transferidos horizontalmente ^{(7, 44, 83)}. El movimiento genético horizontal también está facilitado por transposones ⁽¹²⁾. En definitiva, la universalidad de C. perfringens sumada a la independencia de los factores de virulencia denota el potencial patogénico de esta bacteria, especialmente si se tiene en cuenta que es parte de la microbiota del intestino.

La enterotoxina
La enterotoxina de C. perfringens -conocida como CPE según su sigla en inglés- fue purificada y caracterizada en la década de 1970 ^{(41, 115)}. Desde entonces, se ha acumulado suficiente evidencia para proponer a esta toxina como causante principal de la intoxicación por alimentos producida por C. perfringens tipo A, una de las enfermedades más comunes relacionadas con la ingesta de comida. En Estados Unidos, la intoxicación alimentaria por C. perfringens tipo A se encuentra entre la 2^a y 3^a causa de intoxicación por alimentos en humanos ^{(103, 126)}. Asimismo, esta toxina se asocia con el 5-15% de las enfermedades gastrointestinales humanas distintas de las intoxicaciones alimentarias; como por ejemplo la diarrea producida por antibióticos ⁽⁹⁾. Por otro lado, la enterotoxina tiene importancia en la medicina veterinaria por ser la causa de diarreas en diversas especies animales como los porcinos, los ovinos, los bovinos, los equinos, las aves y los cánidos ^{(21, 48, 56, 75, 80, 110, 128, 129)}.
Las cepas de C. perfringens que llevan el gen cpe son en su mayoría del tipo A, aunque todos los toxinotipos pueden codificarla ⁽⁶⁶⁾. La presencia del gen cpe es poco común: alrededor del 5% de los aislamientos globales de C. perfringens tipo A son positivos para cpe ⁽²³⁾. El gen cpe puede encontrarse tanto en el cromosoma como en un plásmido de gran tamaño ^{(20, 22)}, y se cree que la ubicación de este gen podría definir el tipo de enfermedad producida. Por ejemplo, las cepas de C. perfringens tipo A responsables de la intoxicación por alimentos usualmente presentan este gen en el cromosoma, mientras que las cepas de C. perfringens tipo A causantes de diarreas asociadas a antibióticos y diarreas esporádicas suelen presentarlo en un plásmido ^{(20, 22)}. Hasta el momento, no se han producido aislamientos de cepas que codifiquen simultáneamente el gen de la enterotoxina en forma cromosómica y plasmídica. La causa de esta diferencia en las enfermedades producidas podría deberse a que las cepas de C. perfringens que codifican la enterotoxina en el cromosoma presentan una mayor resistencia a las altas temperaturas durante la cocción ⁽¹²⁶⁾ que las cepas de C. perfringens con el gen cpe presente en plásmidos ⁽¹⁰²⁾. En este último caso, la asociación con enfermedades no relacionadas con alimentos podría deberse a la capacidad de transferencia del plásmido que contiene la secuencia codificante de la enterotoxina a diferentes cepas de C. perfringens presentes en el tracto intestinal ⁽¹⁰²⁾.
La enterotoxina tiene actividad letal, citotóxica y enterotóxica. En el intestino delgado de diferentes mamíferos produce daño morfológico y fisiológico, lo cual originaría la diarrea observada en humanos y otras especies animales ^{(25, 79)}. El mecanismo de acción de esta toxina se inicia con la unión a un receptor celular proteico -o a varios- ⁽⁶⁵⁾, que podría incluir ciertas proteínas de la familia de las claudinas. Estas proteínas tienen un importante papel en la formación de la unión estrecha de las células epiteliales ^{(33, 49, 50)}. Luego de esta unión, la enterotoxina se localiza en un complejo de proteínas (~90 kDa), el cual es necesario, pero no suficiente, para ejercer toxicidad ⁽¹²⁷⁾. Este pequeño complejo proteico es el precursor de un par de complejos mayores, uno de ~155 kDa y otro de ~200 kDa que incluye a la ocludina, otra proteína de la unión estrecha, aparentemente removida desde esta ubicación ⁽¹⁰⁸⁾.
Hay evidencia que indica que la formación del complejo de 155 kDa forma poros en la membrana celular, lo que llevaría a un aumento de la permeabilidad celular con la consecuente citotoxicidad ^{(40, 54, 127)}. El mecanismo de muerte celular es dependiente de la concentración de toxina y de la concentración de ciertos iones extracelulares, como el calcio ⁽¹⁷⁾. La evidencia existente indica que la apoptosis sería el mecanismo predominante a bajas concentraciones y la necrosis a altas concentraciones ⁽¹⁷⁾. En ambos casos la enterotoxina produce daño histopatológico en el intestino in vivo ⁽⁶⁸⁾, lo que lleva a la pérdida de electrolitos y fluidos que se observa en modelos experimentales ^{(79, 105, 109)}. Sin embargo, no está claro si los cambios en la unión estrecha e incluso los procesos inflamatorios producidos por la toxina también podrían contribuir a estos cambios fisiológicos.
Estudios recientes han demostrado que el receptor para CPE se expresa en células neoplásicas, razón por la cual se investiga su posible uso en el tratamiento del cáncer ^{(55, 69, 100, 101)}.

La toxina alfa
La toxina alfa es el principal factor de virulencia de la gangrena gaseosa en humanos y animales ⁽⁶⁶⁾ y de la enteritis necrótica de bovinos, equinos y pollos ^{(3, 11, 58, 80, 129, 130)}. Todos los tipos de C. perfringens poseen los genes codificantes para esta toxina (plc); sin embargo, no todas las cepas la producen y existen grandes variaciones en las cantidades producidas ⁽²⁶⁾. Esta toxina tiene actividad enzimática, tanto de fosfolipasa (fosfolipasa-C o FLC) como de esfingomielinasa (SMasa) y, además, es hemolítica y dermonecrótica ⁽¹¹¹⁾.
El gen plc tiene ubicación cromosómica ⁽¹¹⁶⁾ y su expresión es estimulada por la disminución de la temperatura ⁽⁶⁴⁾. El significado biológico de esto sería que en condiciones adversas, como las que imperan en el suelo o en el ambiente externo, la bacteria necesitaría producir más FLC, para degradar membranas y otros lípidos del ambiente y generar así fuentes de carbono y energía. Esto no sucedería a la temperatura corporal.
La estructura cristalizada de la toxina alfa de C. perfringens muestra que la proteína madura está organizada en dos dominios, el amino terminal, que contiene la actividad FLC, y el carboxi terminal de unión que es dependiente de calcio. Los productos de la hidrólisis son grupos polares unidos a fosfatos solubles en agua y una cola unida a un esqueleto de glicerol insoluble en agua. La estructura del fosfolípido (el grupo de la cabeza polar) y el grado de insaturación y largo de la cola tienen profunda influencia en la eficiencia con la cual éstos son hidrolizados por ciertas FLC ⁽⁷⁷⁾. Dependiendo de la composición de los lípidos de la membrana celular, la toxina alfa puede ser hemolítica en presencia de calcio, como sucede en los eritrocitos humanos, de ratones y de ovejas. En cambio, esto no sucede en el caso de los eritrocitos de conejos o de caballos ⁽⁷⁷⁾.
La hidrólisis de fosfolípidos de membrana resulta en la acumulación de diacilglicerol, compuesto que puede activar vías celulares que contribuyen al efecto citotóxico observado, como la vía del ácido araquidónico ⁽⁷⁷⁾. Esta acumulación actúa como activador de la proteína-kinasa C, enzima que a su vez puede activar las fosfolipasas C y D de las células eucarióticas ^{(31, 32, 119)}. Asimismo, la activación de esta vía llevaría a la producción de tromboxano A2, un potente mediador de la respuesta inflamatoria. Parecería que la toxina alfa imita la acción de la FLC intracelular en la membrana de células eucariotas ⁽⁹⁹⁾.
C. perfringens tipo A produce enteritis necrótica en pollos ^{(3, 58, 80)}. Durante mucho tiempo la evidencia acumulada hizo suponer firmemente que la toxina alfa producida por este tipo de C. perfringens era la responsable de los principales signos de la enfermedad ^{(2, 34)}. Sin embargo, la búsqueda de vacunas eficaces muestra que otras toxinas o factores no descubiertos aún, además de la toxina alfa, serían necesarios para proveer protección contra la enfermedad ⁽¹¹⁸⁾. Un trabajo reciente en el cual a cepas de casos clínicos de C. perfringens se les suprimio el gen de la toxina alfa, pareceria aportar evidencia concluyente de que la toxina alfa no es esencial en el desarrollo de la enteritis necrótica ⁽⁵²⁾. Sin embargo, un trabajo posterior ⁽⁴⁾ puso en duda el modelo animal utilizado en los experimentos de Keyburn et al. ⁽⁵²⁾, argumentando que los animales en estudio podrían haber estado colonizados con cepas salvajes productoras de enteritis necrótica previo al ensayo.
La acción de la toxina alfa en el intestino de especies animales (con la excepción de los pollos) es poco conocida, como también lo es su acción como factor de virulencia en casos de enterotoxemia ^{(11, 77)}. Existe asociación entre la toxina alfa de C. perfringens tipo A y la abomasitis de los terneros ⁽⁹⁰⁾. También se considera a C. perfringens tipo A el agente causal de la enteritis necrotizante bovina; sin embargo, el papel que la toxina alfa juega en esta enfermedad de los bovinos es controvertido ⁽⁶⁰⁾. La toxina alfa inoculada en asas de intestino delgado de ratas in vivo causó influjo de neutrófilos en la mucosa, con incrementos en la actividad de la N-acetilbeta- glucosaminidasa intraluminal y en la permeabilidad, lo que indica daño de la mucosa ⁽⁸²⁾ y contracción del intestino delgado ⁽⁹⁸⁾. En explantes intestinales de conejo incubados in vitro con toxina alfa se observó daño en el epitelio ⁽⁴⁷⁾. En cerdos, ovinos y bovinos inyectados por vía endovenosa se observó enteritis, escaso daño del epitelio intestinal, diarrea transitoria, hemólisis intravascular y daño capilar ^{(78, 79)}. En ovinos, la toxina alfa causó daños morfológicos con alteración del transporte de agua en el intestino ⁽²⁵⁾.
Estudios recientes asocian a la toxina alfa y a cepas de C. perfringens tipo A no enterotoxigénico con enfermedades humanas diferentes de la gangrena gaseosa ^{(43, 45)}. Entre éstas se encuentran casos fatales de enteritis necrótica ⁽⁴⁵⁾ y el síndrome de muerte súbita del lactante ⁽⁴⁷⁾. El hecho de que sean escasos los reportes de enfermedades humanas asociadas a esta toxina puede deberse, al menos en parte, a la alta degradabilidad de la toxina en el intestino, lo cual dificulta su detección. A esto se suma el hecho de que hasta hace poco, el método más usado para la detección era la seroneutralización en ratón ⁽⁶⁶⁾. Con esta técnica, un resultado falso negativo puede darse por insuficiente material o material no fresco. Dado que los antisueros específicos para esta prueba no siempre están a disposición en el mercado y que esta toxina posee baja letalidad en ratones, el diagnóstico resulta aún más dificultoso ^{(66, 123)}. El empleo de los ELISA de captura para la detección de toxinas clostridiales no siempre resuelve el problema mencionado, ya que la alta sensibilidad de estas técnicas puede resultar en la obtención de falsos positivos ^{(67, 123)}.

La toxina beta
La toxina beta fue originalmente purificada y parcialmente caracterizada a fines de la década de 1970 ^{(92, 93)}. Trabajos posteriores determinaron que la toxina formaba poros (selectivos para cationes monovalentes) en bicapas lipídicas y en membranas de células sensibles ⁽¹⁰⁴⁾, lo que aporta evidencia de que la toxina podría funcionar como una neurotoxina y producir constricción arterial ^{(94, 95)}.
Uno de los principales factores de virulencia de C. perfringens tipos B y C es la toxina beta, que es muy sensible a la degradación por tripsina. Los animales recién nacidos o con deficiencias nutricionales son usualmente los más susceptibles de ser infectados por estos microorganismos ⁽¹¹⁾. Según estudios recientes, la toxina beta es el principal factor que contribuye a la letalidad de C. perfringens tipo B y C ^{(25, 30)}.
C. perfringens tipo B es responsable de algunas enfermedades de origen intestinal en rumiantes, principalmente ovejas, aunque también se han aislado cepas de este tipo de animales clínicamente sanos ⁽¹²²⁾. En ovinos, la disentería del cordero y la enteritis hemorrágica ocurren en animales de menos de 3 semanas de vida, si bien también pueden observarse en animales de mayor edad. El resultado de la infección es una enterotoxemia acompañada de enteritis, hemorragia profusa y ulceración del intestino delgado ⁽¹¹⁰⁾. También existe una asociación del tipo B con casos de enteritis hemorrágica en cabras, vacas y potrillos ⁽¹¹⁰⁾.
No se dispone de mucha información acerca de la patogénesis de las infecciones causadas por el tipo B, y no se conocen los efectos individuales o sinérgicos de las toxinas alfa, beta, épsilon u otras toxinas menores sobre los signos clínicos observados.
C. perfringens tipo C causa enteritis necrótica en corderos, terneros, potrillos y cerdos neonatos, aunque han sido reportados casos en perros, pollos y llamas. Los cerdos recién nacidos son comúnmente más afectados que otros animales. En los animales infectados se observa diarrea y disentería, con materia fecal sanguinolenta, y muerte. Esta bacteria también produce enterocolitis necrótica en humanos, una enfermedad potencialmente letal ^{(46, 57)}. Los primeros informes de esta enfermedad surgieron a fines de la Segunda Guerra Mundial durante un brote que afectó en Alemania a personas mal nutridas. El origen de la contaminación fue atribuido a carne de conejo enlatada. La enfermedad fue nombrada darmbrand (intestinos en llamas). En la literatura más reciente, los casos más reconocidos y estudiados de enteritis necrótica provienen de Papúa-Nueva Guinea, donde la enfermedad es conocida como pigbel. La ingesta de carne de cerdo obtenida en condiciones de higiene deficientes y cocida insuficientemente, consumida junto con la batata, dio origen al alto número de casos registrados. Esta costumbre tribal de ocasiones festivas, aportaba suficiente cantidad de bacterias con la carne y esto, sumado a los inhibidores de la tripsina aportados por la batata, evitaban la degradación de la toxina beta en el intestino del huésped. La introducción de una vacuna basada en toxoide beta redujo significativamente la incidencia de la enfermedad en esa zona geográfica. Además de estos pocos reportes relacionados con brotes, se han descrito varios casos esporádicos de enteritis necrótica que afectaron principalmente a personas con problemas pancreáticos o intestinales ⁽⁸⁹⁾. Una dieta pobre en proteínas y problemas en la motilidad intestinal pueden favorecer el desarrollo de la enfermedad. El principal síntoma es dolor abdominal ⁽⁴⁶⁾, también pueden aparecer vómitos y diarrea sanguinolenta. Los casos más complicados pueden desarrollar obstrucción intestinal por necrosis del intestino delgado. La muerte puede ocurrir también por toxemia, la que en algunos casos se produce muy rápidamente ⁽⁴⁶⁾.

La toxina épsilon
La toxina épsilon es la toxina clostridial más potente luego de las neurotoxinas tetánica y botulínica ^{(85, 86)}. Es producida y secretada como una prototoxina con un peso molecular de 32,7 kDa, que al sufrir un clivaje proteolítico específico adquiere su máxima actividad biológica ⁽⁹⁶⁾. Esta activación puede ser catalizada por proteasas como la tripsina, la quimotripsina y una zincmetaloproteasa producida por C. perfringens ⁽⁷⁰⁾ en el tracto gastrointestinal ⁽⁸⁵⁾. El gen de esta toxina (etx) está codificado en un elemento extracromosómico, un plásmido de gran tamaño ⁽⁵¹⁾.
La toxina épsilon es tóxica para células de la línea Madin-Darby canine kidney (MDCK) y, en menor medida, para la línea G-402 de células de leiomioblastoma humano ^{(84, 106)}. Diversos trabajos realizados con células MDCK muestran que la toxina épsilon induce hinchazón, formación de burbujas, fragmentación y lisis celular. Además, se demostró que en las células MDCK la toxina épsilon forma un complejo en la membrana citoplasmática, aunque su ingreso a la célula no es necesario para ejercer toxicidad ^{(87, 88)}. En estas células, la acción citotóxica se correlaciona con la formación de un gran complejo de membrana que causa una rápida pérdida de potasio con entrada de sodio y cloruro, mientras que la concentración de calcio se incrementa; esto da como resultado una pérdida de la viabilidad celular ⁽⁸⁸⁾. La toxina épsilon se une a microdominios de membrana resistentes a los detergentes (lipid raft) y se oligomeriza y forma un poro en membranas celulares tanto sinaptosomales como de células MDCK ^{(73, 87)}. El poro formado en la membrana celular permitiría el pasaje de solutos hidrofílicos de hasta una masa molecular de 1 kDa. Este canal estaría constituido por una heptamerización de la toxina que, sugestivamente, coincide con otras toxinas citolíticas como la toxina alfa de Staphylococcus aureus ⁽³⁸⁾, la aerolisina de Aeromonas hydrophila ^{(14, 87)} y la toxina citolítica ClyA de Escherichia coli ^{(59, 125)}. La estructura cristalizada de la toxina muestra que forma un poro barril â, el cual exhibe alguna similitud estructural con la aerolisina, otra toxina formadora de poro ⁽¹⁹⁾.
Una baja concentración de toxina épsilon puede detener la división celular sin matar inmediatamente a las células, y causar un descenso en su número y un significativo aumento de su volumen medio ⁽¹⁰⁾. La unión específica a este tipo de células se debe probablemente a la presencia de un receptor, el que sería necesario para la actividad biológica de la toxina ⁽⁸⁷⁾. En forma reciente se demostró que la línea de células epiteliales de túbulo colector distal de riñón de ratón mpkCCDcl4 es también sensible a la acción de la toxina épsilon ⁽¹⁸⁾. Estas células conservan ciertas características del transporte iónico de las células epiteliales, por lo que han sido útiles para caracterizar los efectos de la toxina épsilon en la homeostasis celular. En estas células, la toxina épsilon se une principalmente a las membranas del lado apical de las células y oligomeriza sobre esta superficie, sin difundir hacia el interior de la célula. Sobre la superficie apical existen proteasas que activarían a la prototoxina épsilon.
Aunque se desconoce el receptor de esta toxina, se sabe que es una proteína de superficie anclada por glucosilfosfatidilinositol. La toxina épsilon produjo una caída de la resistencia transepitelial y del potencial eléctrico en estas células crecidas en monocapa. Esto estimuló temporariamente la absorción de sodio e indujo una corriente iónica entrante con el consecuente aumento de la concentración de calcio intracelular ⁽²⁴⁾. Asimismo, la toxina ocasionó una rápida pérdida del ATP celular y activó a la proteína quinasa activada por AMP (que sensa el estado metabólico). La toxina también produjo permeabilización mitocondrial y translocación nuclear del factor inductor de apoptosis, un efector de muerte celular independiente de caspasas. Además, en las células mpkCCDcl4 la toxina épsilon indujo una necrosis caracterizada por la reducción en el tamaño del núcleo, pero sin fragmentación del ADN. Llamativamente, aunque la eliminación de los dominios ricos en colesterol de la membrana celular evitó la oligomerización de la toxina y redujo el influjo de sodio y calcio, no impidió la pérdida del ATP celular ni la muerte celular. Estos hallazgos indican que la toxina épsilon produce una rápida necrosis en estas células, y que la pérdida de ATP interviene en el proceso de muerte celular sin estar correlacionada con la permeabilización de la membrana celular y la difusión iónica causada por la toxina ⁽²⁴⁾.
La principal actividad biológica de la toxina épsilon es la generación de edema ⁽¹¹⁾. Esta toxina es letal y dermonecrótica, aunque no es hemolítica ⁽⁶⁶⁾. Se ha descrito que eleva la presión sanguínea, incrementa la permeabilidad vascular e intestinal y causa daño renal y contracción del íleon en ratas ^{(13, 35, 74, 76, 97)}. Es capaz de pasar la barrera hematoencefálica y acumularse en el cerebro ⁽⁸⁵⁾. Una propiedad básica de la toxina épsilon es que incrementa la permeabilidad vascular por la alteración de las uniones estrechas entre las células endoteliales ⁽¹⁾; esto produce daño y edema en diversos órganos, como pulmón, corazón, riñón y cerebro ⁽¹¹⁾. En el cerebro, el daño neuronal y los desórdenes neurológicos están asociados con los edemas perivasculares (por el aumento de la permeabilidad vascular) y con la posible interacción con las neuronas del hipocampo, que lleva a una excesiva liberación de glutamato ^{(71, 72)}.
En ovejas y ratones se observó un aumento en la absorción de inmunoglobulinas anti-toxina diftérica cuando fueron coadministradas con la toxina épsilon, lo que llevó a suponer que esta toxina incrementaría la permeabilidad del intestino delgado y facilitaría su propia absorción y pasaje a la circulación general ^{(6, 13)}. Se ha informado que la toxina épsilon altera la permeabilidad paracelular del epitelio del intestino delgado ^{(6, 13)}. Esto podría explicar la mayor absorción intestinal de toxina épsilon y la acumulación de fluido en el intestino que se observó en animales de experimentación ^{(24, 120, 121)}, así como en casos clínicos ⁽²⁸⁾. Sin embargo, no existen estudios experimentales sobre la capacidad de absorción de la toxina en el intestino delgado y grueso de ovinos y caprinos, así como tampoco existe información comparativa sobre las diferencias de permeabilidad paracelular en el tracto intestinal. Tampoco se cuenta con estudios funcionales precisos acerca de la actividad de la toxina épsilon sobre epitelios intestinales, y considerando que en condiciones patológicas C. perfringens puede ser aislado de diferentes secciones del tracto intestinal ⁽⁶⁶⁾, no se puede descartar que la toxina épsilon tenga actividad sobre este tejido.

La toxina iota
La toxina iota de C. perfringens tipo E es un miembro de la familia de las toxinas binarias, como la toxina iota de C. spiroforme, la toxina CDT de C. difficile, la toxina C2 de C. botulinum y la toxina ántrax de B. anthracis ⁽¹⁶⁾. Estas toxinas binarias están formadas por un péptido de unión (Ib) de unos 81 kDa y un péptido enzimático (ADP-ribosiltransferasa) de 45 kDa (Ia). El primero es necesario para la internalización del segundo ⁽⁶²⁾. La toxina iota requiere de la remoción proteolítica de un fragmento propeptídico, el cual permite que la unidad Ib se inserte en la membrana e interactúe con la porción Ia ⁽³⁹⁾. Al insertarse en la membrana celular, el segmento Ib forma un poro heptamérico que permite la salida de los iones K⁺ y Na⁺, además de la entrada de la porción Ia a la célula. Una vez dentro de la célula, Ia ribosila la G-actina y termina por despolimerizar los filamentos de actina, con la consiguiente destrucción del citoesqueleto celular ⁽³⁹⁾. La activación de la toxina iota ocurre, generalmente, por efecto de las proteasas presentes en el tracto intestinal ⁽¹¹⁰⁾.
La toxina iota es dermonecrótica, citotóxica, enterotóxica e induce daño histopatológico intestinal ⁽¹⁶⁾. Sin embargo, durante mucho tiempo se dudó de su efecto patógeno ^{(110, 128)}; éste se confirmó hace alrededor de treinta años ^{(8, 16, 84)}. En 1978, Patton et al. ⁽⁸⁴⁾ informaron un brote de enterotoxemia en una colonia de conejos. Los animales afectados presentaban enteritis necrótica y hemorrágica aguda. Se aisló la toxina iota del contenido intestinal de los conejos afectados; esta toxina produjo lesiones agudas en el ciego de conejos sanos inoculados, salvo en aquellos a los que se los protegió con un antisuero específico contra la toxina ⁽⁸⁴⁾. Aunque existen informes de enterotoxemia asociada a esta bacteria en otras especies ⁽¹¹²⁾, sólo se la ha podido reproducir en conejos.
Estudios recientes han dado a las toxinas binarias, y en especial a la toxina iota, mayor importancia, dado que podrían utilizarse como transportadoras e internalizadoras de drogas en células procariotas ⁽⁵⁾.

Dos nuevas toxinas
A mediados de 1980, de una cepa de tipo C se purificó y caracterizó una proteína tóxica letal (enterotóxica y necrotizante) de 28 kDa, identificada inicialmente como toxina beta. En 1997, Gibert et al. ⁽³⁶⁾ aislaron una toxina de 28 kDa del contenido intestinal de un cerdo con enteritis necrotizante. Esta toxina era citotóxica para células CHO y, además, provocaba enteritis hemorrágica al ser inoculada en asas ligadas de cobayo ⁽³⁶⁾. El gen de esta proteína de 28 kDa fue secuenciado, y se pudo establecer que su producto no era la toxina beta, sino una proteína diferente, a la que se llamó beta-2 ⁽³⁶⁾.
El gen de la toxina beta-2 puede ser encontrado en todos los tipos de C. perfringens y se halla codificado en un plásmido en la mayoría de las cepas que lo contienen.
Esta toxina ha sido asociada con diversas enfermedades intestinales en animales ^{(36, 37, 42, 60)}, pero también se ha aislado de pacientes humanos con enfermedades gastrointestinales ^{(29, 30, 60)}. Aunque en los últimos años ha aumentado considerablemente la cantidad de publicaciones sobre la toxina beta-2 y su asociación con enfermedades entéricas, la mayoría de los trabajos sólo informan la presencia de bacterias con el gen codificante de la toxina, de modo que la asociación entre la enfermedad y la toxina aparece como una cuestión netamente especulativa ^{(27, 113)}.
En febrero de 2008, Keyburn et al. ⁽⁵³⁾ comunicaron la existencia de una nueva toxina clostridial responsable de la enteritis necrotizante en pollos: la NetB. El gen de dicha toxina fue caracterizado a partir de cepas de C. perfringens tipo A, aisladas del contenido intestinal de aves con esta enfermedad. La NetB sería una toxina de tipo formadora de poro. Estos autores reprodujeron la infección en aves libres de patógenos, a las que se les inoculó la toxina recombinante purificada o cepas que portaban el gen de la toxina o que carecían de éste. Sólo las aves que recibieron la toxina purificada o la cepa con la toxina desarrollaron enteritis necrotizante ⁽⁵³⁾.

CONCLUSIONES

C. perfringens es un microorganismo que reviste suma importancia en medicina humana y veterinaria ya que, pese a ser parte de la microbiota intestinal, es potencialmente patógeno y letal, tanto para animales como para el hombre. Tanto es así que el uso de algunas de sus toxinas como potenciales armas bioterroristas ha generado cierta preocupación en algunos países. Sin embargo y a modo de contracara, otras de sus toxinas podrían ser usadas en el tratamiento de enfermedades, como transportadoras e internalizadoras de drogas en células procariotas (toxina iota) o en ciertas terapias antitumorales (enterotoxina).
En el ámbito de la medicina veterinaria, C. perfringens genera importantes pérdidas en la producción ganadera. En el caso de la producción avícola, por ejemplo, el reciente descubrimiento de una toxina (NetB), presente en cepas de C. perfringes tipo A aisladas de aves con enteritis necrótica, abre una nueva línea de investigación, relevante tanto para el conocimiento de la patogenia de estos microorganismos como para el desarrollo de nuevas vacunas. Esta toxina, o tal vez otras también, podrían estar involucradas en la enteritis necrótica por C. perfringens tipo A observada en otras especies animales.
Dado el renovado interés que existe en el estudio de C. perfringens y sus toxinas, es posible que en los próximos años tengamos un perfil más completo de la biología de esta bacteria como comensal y como patógeno. Esta información permitirá dilucidar su papel en enfermedades entéricas en las que su participación aún es incierta.

Agradecimientos: Agradecemos la generosa ayuda de Yanil R. Parma. M.E. Fernández-Miyakawa es investigador del CONICET.

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Recibido: 07/04/09
Aceptado: 26/10/09