SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.42 número1Utilidad de los antígenos preparados con cepas rugosas de Brucella en el diagnóstico de brucelosis caninaCaracterización de cepas de Escherichia coli O157 no productoras de toxina Shiga aisladas de perros índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Servicios Personalizados

Articulo

Indicadores

  • No hay articulos citadosCitado por SciELO

Links relacionados

  • En proceso de indezaciónCitado por Google
  • No hay articulos similaresSimilares en SciELO
  • En proceso de indezaciónSimilares en Google

Bookmark


Revista argentina de microbiología

versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.42 n.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ene./abr. 2010

 

INFORME BREVE

Caracterización molecular de Streptococcus pyogenes causantes de enfermedad invasora y síndrome de shock tóxico estreptocócico

F. Traverso1, 2*, M. Sparo1, 3, V. Rubio4, J.A. Sáez Nieto4

1Hospital Ramón Santamarina, Tandil;
2Nueva Clínica Chacabuco, Chacabuco 340 (7000)Tandil;
3Centro de Estudios Bioquímicos, Tandil, Prov. de Buenos Aires, Argentina; 4Laboratorio de Taxonomía, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III. Majadahonda, Madrid, España.
* Correspondencia. E-mail: fernandotraverso@yahoo.com.ar

RESUMEN

Streptococcus pyogenes es el agente causal de varias enfermedades comunes entre las que se incluyen la faringoamigdalitis, la escarlatina y el impétigo. Sin embargo, en las últimas décadas se ha registrado mundialmente un resurgimiento de casos de enfermedad invasora y síndrome de shock tóxico estreptocócico (SSTE). El propósito del presente trabajo fue estudiar la diversidad genética, los factores de virulencia (genes spe, sme, ssa) y la sensibilidad a los antibióticos de 10 cepas de S. pyogenes causantes de enfermedad invasora y SSTE. Los aislamientos fueron recuperados de hemocultivos de pacientes internados en el Hospital Santamarina y en la Nueva Clínica Chacabuco (Tandil, Argentina) entre diciembre de 2000 y abril de 2005. Predominaron 2 patrones de electroforesis en campo pulsante. El más frecuente comprendió 5 aislamientos del tipo emm1-T1, con perfil de toxinas speA, speB, speF, speG y smeZ. El segundo patrón más frecuente incluyó 2 aislamientos tipo emm3-TNT (speB, speF, speG). Estos dos tipos (emm1 y emm3) fueron los prevalentes en las infecciones invasoras. Las otras tres cepas correspondieron a los tipos emm49-TNT (speB, speC, speF, speG), emm75-T25 (speB, speF, speG) y emm83-TNT (speB, speF, speG, ssa, smeZ). Se encontró diversidad genética entre las cepas aisladas, pero todos los aislamientos fueron sensibles a penicilina, cefotaxima, eritromicina, clindamicina, cloranfenicol, tetraciclina y rifampicina. Por tal motivo, aún es válido el tratamiento empírico con penicilina asociada a clindamicina.

Palabras clave: Streptococcus pyogenes; Síndrome de shock tóxico estreptocócico

ABSTRACT

Molecular characterization of Streptococcus pyogenes from invasive disease and streptococcal toxic shock syndrome episodes. Streptococcus pyogenes causes a variety of common human diseases, including pharyngitis, scarlet fever and impetigo. Nevertheless, the past decades have witnessed a worldwide resurgence in invasive disease and streptococcal toxic shock syndrome (STSS). The objective of the present study is to evaluate the genetic diversity, virulence gene distribution (spe, sme and ssa genes) and susceptibility pattern of 10 S. pyogenes isolates causing invasive disease and STSS. The isolates were recovered from blood cultures of hospitalized patients at Hospital Santamarina and Nueva Clínica Chacabuco, Tandil, Buenos Aires, Argentina between 12/2000-04/2005. Two pulse field gel electrophoretic patterns predominated. The most frequent one included 5 characteristic isolates of emm1-T1 type, toxin gene profile speA, speB, speF, speG and smeZ. The second pattern included 2 characteristic isolates of emm3-TNT type (speB, speF, speG). The other 3 isolates corresponded to types emm49-TNT (speB, speC, speF, speG), emm75-T25 (speB, speF, speG) and emm83-TNT (speB, speF, speG, ssa, smeZ). All isolates were susceptible to penicillin, cefotaxime, erythromycin, clindamycin, chloramphenicol, tetracycline and rifampicin. The data from the present study demonstrated genetic diversity among the strains. Types emm1 and emm3 were prevalent in invasive disease. The empirical treatment with the combination of penicillin and clindamicin is still valid.

Key words: Streptococcus pyogenes; Streptococcal toxic shock syndrome

Streptococcus pyogenes es el agente causal de varias enfermedades comunes entre las que se incluyen la faringoamigdalitis, la escarlatina y el impétigo. También provoca enfermedades graves como la fascitis necrotizante y el síndrome de shock tóxico estreptocócico (SSTE). Además, es capaz de causar complicaciones posinfecciosas como fiebre reumática y glomerulonefritis (11).
A mediados de la década del 80 se observó un incremento significativo en los casos y en la gravedad de la enfermedad invasora por S. pyogenes en varios países de Europa y en América del Norte (3, 6, 10). Estas infecciones fulminantes se caracterizaron por hipotensión aguda y grave, shock, falla multiorgánica y muerte. Este síndrome clínico, denominado síndrome del shock tóxico estreptocócico, estuvo en muchos casos asociado a la destrucción del tejido de partes blandas. A pesar de los estudios que se han realizado en distintos países, las razones del resurgimiento tan agresivo de las infecciones causadas por S. pyogenes siguen sin conocerse.
Si bien se han hecho muchos esfuerzos por entender y conocer los factores de virulencia de las cepas responsables de la enfermedad invasora y la respuesta inmune generada por el paciente, sólo se ha podido establecer una relación entre determinados tipos M y la producción de exotoxinas. Los serotipos M1 y M3 determinados por el tipo de proteína M, uno de los principales factores de virulencia de este patógeno, son los más frecuentes en estos aislamientos. La virulencia de S. pyogenes está determinada también por una serie de genes que codifican la producción de exotoxinas. Entre las responsables de los cuadros invasores graves se encuentran las siguientes exotoxinas: A, B, C, F, G, H, J, SSA y SMEZ. En relación con el huésped, los principales factores conocidos que aumentan el riesgo de presentar SSTE y enfermedad invasora son edades cortas o avanzadas (los neonatos y los ancianos son los grupos más susceptibles), diabetes, alcoholismo, procedimientos quirúrgicos, traumas, varicela y contacto con pacientes infectados.
El objetivo del presente trabajo fue estudiar la relación clonal, los factores de virulencia (genes spe, sme, ssa) y la sensibilidad a los antibióticos de cepas de S. pyogenes causantes de enfermedad invasora y SSTE. Se aislaron 10 cepas a partir de hemocultivos de pacientes internados en el Hospital Santamarina y en la Nueva Clínica Chacabuco de la ciudad de Tandil, Bs. As., durante el período comprendido entre diciembre de 2000 y abril de 2005. Se incluyeron en el estudio sólo los pacientes que cumplían con la definición de caso de infección invasora (infección localizada en tejidos profundos, sangre, líquido cefalorraquídeo u otros líquidos obtenidos por punción, diagnosticada sobre la base del aislamiento de microorganismos a partir de muestras que normalmente deberían ser estériles).
La identificación de los microorganismos se realizó de manera convencional: crecimiento de colonias b-hemolíticas en agar suplementado con 5% de sangre de carnero, observación de cocos gram positivos en cadenas y sensibilidad a la bacitracina (discos de 0,04 U; Britania, CABA, Argentina). La confirmación de las cepas se realizó mediante aglutinación de partículas de látex utilizando sueros específicos para el serogrupo de estreptococos b-hemolíticos grupo A (Slidex Strepto kit, bioMérieux, Francia).
La sensibilidad a los antibióticos se estudió mediante dilución en agar y con el método epsilométrico (Etest, Biodisk, AB, Suecia) para los siguientes antibióticos: penicilina, cefotaxima, eritromicina y clindamicina. Además, se ensayó cloranfenicol, tetraciclina y rifampicina mediante difusión en agar con discos, siguiendo las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2).
La secuenciación del gen emm (que codifica la proteína M serotipo específica) se realizó mediante amplificación (PCR) y secuenciación de un fragmento de 160 pb que codifica a la citada proteína, de acuerdo con los protocolos internacionales del Centers for Disease Control and Prevention de Atlanta. Los fragmentos de las secuencias se compararon y analizaron según los esquemas descritos previamente (1, 4).
Para la detección de los antígenos T de las cepas se utilizó el esquema de Seiken, Japón (Oxoid, España).
A los fines de comprobar la identidad clonal de las cepas, se realizó una electroforesis en campo pulsante (PFGE) utilizando SmaI como enzima de restricción. La preparación de las muestras y las condiciones de la electroforesis se ajustaron a un protocolo ya descrito (8). Los perfiles moleculares obtenidos fueron fotografiados y analizados con el software BioNumerics versión 6.0 (Applied Maths, Kortrijk, Bélgica). La relación entre los perfiles fue estimada mediante la proporción de bandas compartidas, aplicando el coeficiente de Dice y generando dendrogramas basados en el método Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean (UPGMA). Los patrones moleculares obtenidos por SmaI-PFGE fueron agrupados en grupos clonales con una similitud del 100%.
El estudio de los factores de virulencia de las cepas se llevó a cabo por la detección de los genes spe, sme y ssa (que codifican las exotoxinas pirógenas) mediante una PCR múltiple, de acuerdo con metodología descrita (9).
Siete pacientes fueron adultos (> 16 años) y tres fueron niños (£ 16 años). La mediana de edad de los 10 pacientes (4 varones y 6 mujeres) fue de 43 años (rango: 6 a 79 años). Las características clínico-epidemiológicas de los pacientes se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Características clínico-epidemiológicas de los pacientes con infección invasora por S. pyogenes

Se registraron 4 casos de SSTE y 7 muertes (todos los pacientes adultos) en el período estudiado. Tres de los pacientes fallecidos no presentaban enfermedad de base previa. No se registraron casos de SSTE ni muertes en la edad pediátrica. Los casos de SSTE fueron una consecuencia de la infección por los tipos emm1 (n = 2) y emm3 (n = 2); los asociados a mortalidad correspondieron a los tipos emm1 (n = 4), emm3 (n = 2) y emm49 (n = 1).
Se obtuvieron 2 patrones de PFGE predominantes. El más frecuente comprendió 5 aislamientos del tipo emm1- T1 y presentó el perfil de toxinas speA, speB, speF, speG y smeZ. El segundo patrón más frecuente incluyó 2 aislamientos del tipo emm3-TNT y presentó los genes speB, speF y speG. Las otras tres cepas correspondieron a los tipos emm49-TNT (speB, speC, speF y speG), emm75- T25 (speB, speF, speG) y emm83-TNT (speB, speF, speG, ssa y smeZ). La relación clonal de las cepas de S. pyogenes puede verse en la Figura 1 y el estudio de los factores de virulencia (genes spe, sme y ssa) en la Figura 2.


Figura 1. Relación clonal entre los diferentes genotipos emm de S. pyogenes. La macro restricción del ADN genómico se realizó empleando la enzima SmaI. El marcador de peso molecular utilizado fue Lambda Ladder PFGE Marker (New England BioLabs, Madison, EE.UU.). NT: no tipificable.


Figura 2. Estudio de los factores de virulencia (genes spe, sme y ssa) de las cepas de S. pyogenes mediante PCR múltiple A) Amplicones resultantes de la PCR múltiple 1 (speB, speF, speC, speH) B) Amplicones resultantes de la PCR mùltiple 2 (ssa, speJ, smeZ, speA, speG). Calle 1: marcador de peso molecular (100 pb); calle 2: cepa 1 (speB, speF, speG); calle 3: cepa 2 (speB, speF, speG); calle 4: cepa 3 (speA, speB, speF, speG, smeZ); calle 5: cepa 4 (speB, speC, speF, speG); calle 6: cepa 5 (speA, speB, speF, speG, smeZ); calle 7: cepa 6 (speA, speB, speF, speG, smeZ); calle 8: cepa 7 (speB, speF, speG, ssa, smeZ); calle 9: cepa 8 (speB, speF, speG); calle 10: cepa 9 (speA, speB, speF, speG, smeZ); calle 11: cepa 10 (speA, speB, speF, speG, smeZ); calle 12: control positivo 57 (speB, speF, speC, speH); calle 13: control positivo 411 ( speA, speG, smeZ, speJ); calle 14: control positivo 232 (speG, ssa, speA); calle 15: marcador de peso molecular (100 pb).

Todos los aislamientos fueron sensibles in vitro a penicilina (CIM90 0,007 μg/ml) y a cefotaxima (CIM90 0,016μg/ml). No se detectó resistencia a la eritromicina (CIM90 0,06 μg/ml) ni a clindamicina (CIM90 0,06 μg/ml). Todas las cepas fueron sensibles a cloranfenicol, tetraciclina y rifampicina.
Desde mediados de la década del 80 hasta nuestros días se han realizado estudios sobre infecciones invasoras causadas por S. pyogenes en distintos países del mundo (3, 6,10). En este trabajo hemos analizado la relación clonal, los factores de virulencia y la sensibilidad a los antibióticos de todos los casos de infecciones invasoras por S. pyogenes que se produjeron entre diciembre de 2000 y abril de 2005 en dos instituciones de salud de la ciudad de Tandil, Prov. de Buenos Aires, Argentina. Observamos que existe diversidad genética en las cepas de S. pyogenes aisladas de sangre y que los tipos emm1 y emm3 fueron los prevalentes en las infecciones invasoras que este germen ocasionó en nuestro medio durante el período citado.
En un estudio multicéntrico de infecciones invasoras causadas por S. pyogenes y S. dysgalactiae subesp. equisimilis realizado en Argentina durante el período octubre de 1998-marzo de 1999, se describió que la mayor parte de los episodios graves correspondieron a la ciudad de Tandil (7). En esa oportunidad, se hallaron los siguientes genotipos: emm12 (n = 2), emm75 (n = 1) y emm82 (n =2). Se detectaron 5 casos de SSTE y 4 muertes en un período de 6 meses. Por otro lado, a escala nacional, sólo hubo 2 aislamientos del grupo emm3 sobre un total de 55, y ninguno de ellos estuvo asociado a SSTE ni a casos fatales. Asimismo, y a diferencia de lo observado en el presente estudio, no hubo entonces aislamientos del tipo emm49.
Aunque se ha detectado un total de 5 aislamientos del tipo emm1 con idéntico patrón de PFGE, descartamos la presencia de un brote intrahospitalario, dado que las cepas fueron aisladas de distintas instituciones y en un amplio intervalo de tiempo.
No existen en la actualidad estudios que permitan asociar de forma clara y contundente características fenotípicas y genotípicas de los aislamientos con las infecciones invasoras. Algunos estudios apuntan hacia ciertos fenotipos predominantes (M1 y M3) productores de exotoxinas (5), tal como lo hemos detectado en nuestro estudio, aún con un pequeño número de cepas.
La penicilina continúa siendo universalmente activa in vitro contra S. pyogenes, pero en las infecciones invasoras-como la sepsis grave, la fascitis necrotizante, la miositis y el empiema- no hay una respuesta tan favorable a la monoterapia con penicilina y la morbimortalidad puede ser alta. Por lo tanto, el tratamiento empírico aconsejado es la combinación de penicilina con clindamicina, ya que esta última tiene un importante rol en la inhibición de la síntesis de las toxinas estreptocócicas y de la proteína M. Además, ofrece la ventaja de que actúa sobre grandes inóculos de microorganismos y sobre los estreptococos en fase estacionaria.
En su conjunto, el estudio de las infecciones invasoras por S. pyogenes realizado en nuestra región coincide con lo que señalan estudios realizados en otros países en cuanto a las características fenotípicas y genotípicas de los aislamientos bacterianos, en los que se mantienen similares patrones microbiológicos.

Agradecimiento: a la Prof. Giselle Blanchiman por la cuidadosa lectura del manuscrito.

BIBLIOGRAFÍA

1. Beall B, Facklan R, Thomson T. Sequencing emm-specific PCR-products for routine and accurate typing of group A streptococci. J Clin Microbiol 1996; 34: 953-8.        [ Links ]

2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 16th Informational Supplement, 2006; M100-S16. Wayne, Pa, USA.        [ Links ]

3. Davies DH, McGeer A, Schwartz B, Green K, Cann D, Simor AE, et al. Invasive group A streptococcal infections in Ontario, Canada. N Engl J Med 1996; 335: 547-54.        [ Links ]

4. Hoe NP, Fullerton KE, Liu M, Peters JE, Gackstetter GD, Adams GJ, et al. Molecular genetic analysis of 675 group A Streptococcus isolates collected in a carrier study at Lackand Air Force, San Antonio, Texas. J Infect Dis 2003; 188: 818-27.        [ Links ]

5. Johnson DR, Stevens DL, Kaplan EL. Epidemiologic analysis of group A streptococcal serotypes associated with severe systemic infections, rheumatic fever, or uncomplicated pharyngitis. J Infect Dis 1992; 166: 374-82.        [ Links ]

6. Kiska DL, Thiede B, Caracciolo J, Jordan M, Johnson D, Kaplan EL, et al. Invasive group A streptococcal infections in North Caroline: epidemiology, clinical features, and genetic and serotype analysis of causative organisms. J Infect Dis 1997; 176: 992-1000.        [ Links ]

7. Lopardo, HA, Vidal P, Sparo M, Jeric P, Centron D, Facklam RR, et al. Six-month multicenter study on invasive infections due to Streptococcus pyogenes and Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis in Argentina. J Clin Microbiol 2005; 43: 802-7.        [ Links ]

8. Mazon A, Gil-Setas A, Sota de la Gandara LJ, Vindel A, Sáez-Nieto JA. Transmission of Streptococcus pyogenes causing successive infections in a family. Clin Microbiol Infect 2003; 9: 554-9.        [ Links ]

9. Schmitz FJ, Beyer A, Charpentier E, Normark BH, Schade M, Fluit AC, et al. Toxin-gene profile heterogeneity among endemic invasive european group A streptococcal isolates. J Infect Dis 2003; 188:1578-86.        [ Links ]

10. Strömberg A, Romanus V, Burman LG. Outbreak of group A streptococcal bacteriemia in Sweden: an epidemiologic and clinical study. J Infect Dis 1991; 164: 595-8.        [ Links ]

11. Torrabadella P, Botet P, Luisa M. Infecciones invasivas por Streptococcus pyogenes. Cambios en sus características clínicas, nuevos aspectos fisiopatológicos y enfoque terapéutico actual. Enferm Infecc Microbiol Clin 1994; 12: 505-10.        [ Links ]

Recibido: 04/08/09
Aceptado: 28/12/09