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Revista argentina de microbiología

versión On-line ISSN 1851-7617

Rev. argent. microbiol. v.42 n.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ene./abr. 2010

 

INFORME BREVE

Actividad in vitro de la tigeciclina en aislamientos clínicos de Acinetobacter spp. multirresistentes. Comparación de diferentes métodos de evaluación

M. S. Zárate*, G. Serruto, J. Smayevsky

Laboratorio de Microbiología, Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas "Norberto Quirno" (CEMIC), Galván 4102 (1431), Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
*Correspondencia. E-mail: sole_z@hotmail.com; szarate@cemic.edu.ar

RESUMEN

Las infecciones causadas por Acinetobacter spp. multirresistentes (AMR) se han incrementado en todo el mundo; en este contexto, la tigeciclina provee una nueva opción terapéutica para el tratamiento de dichas infecciones. En este trabajo se realizó la validación de una metodología por microdilución (MD) in house frente a la metodología de MD comercial (gold standard) evaluando la sensibilidad de 32 aislamientos de AMR. Asimismo, en un grupo de 60 aislamientos de AMR obtenidos en dos períodos de tiempo diferentes (2000-2003 y 2006-2008) se evaluó la sensibilidad a la tigeciclina mediante las metodologías de MD in house, dilución en agar (DA) y difusión con discos (DD), según lo descrito por el CLSI, y se determinó la CIM90 de este agente frente a los aislamientos obtenidos en cada período. La sensibilidad fue interpretada utilizando los puntos de corte sugeridos por la FDA para Enterobacteriaceae. Se evaluó la correlación entre las metodologías citadas mediante curvas de dispersión y se estimaron los errores de los métodos ensayados. El coeficiente de correlación r entre la técnica de MD in house y la de DA y entre la técnica de MD in house y la de DD fue de 0,68 en ambos casos. La CIM90 por el método de MD in house fue para el período 2002-2003 de 1 μg/ml y para el período 2006-2008 de 2 μg/ml. Utilizando los puntos de corte de la FDA observamos un error menor no admisible (17,6%) por la técnica de DD debido a valores "falsos intermedios", dado que la CIM90 se encontraba entre 1 y 2 μg/ml.

Palabras clave: Tigeciclina; Acinetobacter spp.; Multirresistencia

ABSTRACT

In vitro activity of tigecycline in clinical isolates of multidrug resistant Acinetobacter spp. Comparison of different methods of evaluation. Infections caused by multidrug resistant (MDRA) Acinetobacter spp. have increased worldwide. Tigecycline provides a new therapeutic option for treating these infections. We conducted a study tailored to validate an in house methodology by broth microdilution (BM) vs. commercial BM in 32 MDRA isolates. Sixty MDRA isolated in 2 time periods (2000-2003 and 2006-2008) were compared by BM, agar dilution (AD) and disk diffusion (DD) methods, as described by the CLSI and the MIC90 for each period was determined. Susceptibility was interpreted by using the breakpoints suggested by the FDA for Enterobacteriaceae. The correlation between the methodologies was performed by a scattergram, and the errors between methods were calculated. The correlation coefficients between AD and BM, and BM and DD were, r: 0.68 in both cases. For 2002-2003, the MIC90 for BM was: 1 g/ml, and for 2006-2008: 2 μg/ml. Using the FDA breakpoints for DD, we observed an unacceptable minor error (17.6%) because of false-intermediate values, considering the MIC90 was 1-2 μg/ml.

Key words: Tigecycline; Acinetobacter spp.; Multidrug resistance

Las especies de Acinetobacter multirresistentes (AMR) se han convertido en patógenos intrahospitala-rios de difícil control, dada su extraordinaria capacidad para desarrollar resistencia a los antimicrobianos y sobrevivir en el medio ambiente (9).
En nuestros hospitales, los miembros del grupo AMR han producido varios brotes epidémicos en los últimos cinco años y perduran como endémicos en distintas áreas, sin lograrse su erradicación definitiva. Por otra parte, la selección de cepas multirresistentes ha provocado que los aislamientos actuales sean solamente sensibles a la colistina.
El advenimiento en estos últimos años de nuevos antibióticos como la tigeciclina (1), una glicilciclina con actividad frente a patógenos gramnegativos y grampositivos, permite incorporar nuevas opciones terapéuticas para el tratamiento de infecciones por gérmenes multirresistentes.
La tigeciclina ha sido aprobada por la FDA (Food and Drug Administration) para el tratamiento de infecciones complicadas intraabdominales y de piel y partes blandas (1). Sin embargo, no ha sido aprobada aún para el tratamiento de infecciones respiratorias, a menudo vinculadas con Acinetobacter spp., patógenos muy a menudo aislados en el ámbito nosocomial. No obstante, no es infrecuente su utilización fuera de protocolo para el tratamiento de las infecciones por estos microorganismos.
Para evaluar la actividad in vitro de la tigeciclina se pueden utilizar técnicas por dilución (en agar; macrodilución y microdilución en caldo) y por difusión con discos. La interpretación de los resultados se realiza sobre la base de los puntos de corte aprobados para Enterobacteriaceae, lo que ha generado controversias. Por ejemplo, Jones et al. (10) comunicaron que un 23,3% de aislamientos de Acinetobacter spp. son clasificados en la categoría de sensibilidad intermedia a tigeciclina por el método de difusión, cuando en realidad serían clasificados como verdaderamente sensibles por un método de referencia (dilución). Este nivel de error se considera no aceptable para la metodología, por lo que se propone una modificación en el punto de corte, pero esto no ha sido aprobado por los organismos de referencia (FDA y CLSI -Clinical and Laboratory Standards Institute-).
Otro parámetro que es preciso considerar es la utilización de medios de cultivo frescos para la realización de las pruebas de sensibilidad dado que, como señalan Bradford et al. (2), la actividad de la tigeciclina puede disminuir en 2 a 3 diluciones con el uso de caldo Mueller- Hinton de más de 12 horas de preparado.
Por otro lado, existen comunicaciones recientes que señalan que las diferentes marcas comerciales de medio Mueller-Hinton pueden generar discrepancias en los resultados de la metodología de difusión con discos, y atribuyen esa variabilidad al exceso de iones manganeso en el medio (7, 15).
En la literatura existe un número limitado de publicaciones que muestran la actividad in vitro de la tigeciclina frente a Acinetobacter spp. aislados en nuestro país (3, 10). Sin embargo, no existen datos acerca de la actividad in vitro de la tigeciclina en aislamientos obtenidos antes de su lanzamiento al mercado (años 2002-2003). Esto limita la posibilidad de comparar con respecto a la situación actual (2006-2008), en la que dicha droga se suele emplear cuando ya no hay otras opciones terapéuticas.
Los objetivos del presente trabajo fueron:
1) Validar una metodología in house por el método de microdilución en caldo tomando como referencia los resultados obtenidos mediante el método comercial de evaluación de la actividad in vitro de la tigeciclina frente a aislamientos de Acinetobacter spp. multirresistentes.
2) Comparar las metodologías de microdilución en caldo in house (MD), dilución en agar (DA) y difusión con discos (DD) respecto de la sensibilidad a tigeciclina en aislamientos obtenidos en dos períodos de tiempo diferentes (2002-2003 y 2006-2008), y establecer los errores mayores y menores derivados de cada una de las metodologías aplicadas.
3) Realizar un estudio comparativo adoptando los puntos de corte sugeridos por la FDA y por Jones et al. (10) para la metodología de difusión con discos.
4) Establecer la CIM90 de la tigeciclina frente a los aislamientos de cada período en estudio.
Se utilizaron 32 aislamientos para realizar la validación de la metodología de MD in house frente a la metodología de MD comercial (gold standard). Para establecer la comparación entre las metodologías de MD in house (utilizada como gold standard), de DA y de DD se emplearon 60 aislamientos, 24 de ellos obtenidos en el período 2002-2003 y 36 en el período 2006-2008.
Los aislamientos fueron identificados por pruebas bioquímicas convencionales según Shreckenberger et al. (14), y en algunos casos por el sistema comercial VITEK® (bioMériéux, Marcy, I'Étoile, Francia).
Los aislamientos fueron considerados multirresistentes cuando presentaban resistencia a por lo menos 3 familias de antibióticos.
Los estudios de sensibilidad a la tigeciclina se realizaron con medios de cultivo preparados en forma reciente, según normas del CLSI 2007 (4, 5).
La metodología comercial para evaluar la resistencia a la tigeciclina se efectuó según las recomendaciones del fabricante de dicho agente (Tygacil package insert [June 2005], Wyeth Pharmaceuticals Inc., Philadelphia, PA). Para la metodología de difusión con discos se utilizaron discos de tigeciclina de 15 μg.
En todos los casos se utilizaron como control de calidad las cepas de Escherichia coli 25922, Pseudomonas aeruginosa 27853 y Enterococcus faecalis 29212.
La categorización de sensible o resistente se estableció según los puntos de corte de la FDA para la familia Enterobacteriaceae (sensible £ 2 μg/ml y ³ 19 mm; resistente³ 8 μg/ml y £ 14 mm) y según los criterios de Jones et al. (10) (sensible ³ 16 mm; resistente £ 12 mm).
El análisis de los datos se efectuó en el programa WHO 5.4, se determinó la CIM90 y el rango de CIM de la tigeciclina para los aislamientos de cada período en estudio.
A fin de evidenciar la correlación entre los métodos se efectuó una gráfica de dispersión. Se consideraron estadísticamente significativas asociaciones con un valor de p <0,05.
La metodología de MD in house comparada con la MD comercial proporcionó un coeficiente de correlación r de 0,92. Esto nos permitió validar la metodología de MD in house frente al método comercial, no disponible en el mercado.
Los resultados de la metodología de DA comparados con los de la MD y los de la MD comparados con los de la DD proporcionaron coeficientes de correlación r de 0,68 y 0,68, respectivamente. El análisis de los errores mayores y menores al comparar las técnicas de DA y de MD proporcionaron niveles de errores menores admisibles, del 2%, mientras que cuando se compararon las técnicas de MD y de DD, los errores menores fueron no admisibles (17,6%) según los puntos de corte establecidos por la FDA, y admisibles según el trabajo de Jones et al. (0%) (Tabla 1).

Tabla 1. Comparación de resultados obtenidos por MD y DD según los puntos de corte propuestos por la FDA y por Jones et al., categorizados según el tipo de error (mayor o menor)

Los resultados de CIM90 por la técnica de MD fueron los siguientes: 1 μg/ml (período 2002-2003), 2 μg/ml (período 2006-2008) y 1 μg/ml (global, período 2002-2008); estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. El rango global de la CIM encontrada en todo el período estudiado (2002-2008) fue 0,125 - 4 μg/ml. Para los períodos 2002-2003 y 2006-2008 alcanzó valores de 0,25 - 2 μg/ml y de 0,125 - 4 μg/ml, respectivamente.
Diversos miembros del grupo AMR se aíslan con alta frecuencia en nuestro medio; este microorganismo es el segundo agente causal de neumonías asociadas a la ventilación mecánica y de bacteriemias en pacientes internados en UCI (datos no publicados). Frente a esta problemática, el lanzamiento al mercado de la tigeciclina ha generado grandes expectativas, con prescripciones de la droga fuera de protocolo en aproximadamente el 60% de las neumonías asociadas a respirador, dada la alta concentración alcanzada en el tejido alveolar (6).
Existe evidencia en la literatura internacional de que la tigeciclina presenta actividad in vitro frente a aislamientos de AMR en todo el mundo, y que la respuesta clínica es favorable en los pacientes tratados. Sin embargo, no pueden extraerse aún conclusiones a gran escala debido al escaso número de pacientes incluidos en estos estudios y a la coadministración de otros agentes antimicrobianos (12, 13).
Cabe destacar que se debe interpretar con cautela la actividad in vitro de la tigeciclina frente a Acinetobacter spp. debido a las limitaciones metodológicas existentes. El uso de la técnica de difusión con discos se ha asociado con menores porcentajes de sensibilidad en comparación con los métodos de dilución (caldo, agar o microdilución) (10).
Existen pocas publicaciones en nuestro país donde se evalúa la actividad in vitro de la tigeciclina por la metodología de MD (3) y de DD (8). Hasta la actualidad, no hay trabajos que comparen las tres metodologías (DA, MD y DD) y los errores derivados de cada una de ellas.
En el presente estudio observamos una buena correlación entre las 3 metodologías. Los errores mayores y menores por la metodología de DA y de MD son admisibles, es decir, menores del 10% (11). Los errores menores según la metodología de DD son no admisibles, en coincidencia con lo informado por Jones et al. (10).
La utilización del método de MD validado en este estudio nos permitió obtener datos de actividad in vitro de la tigeciclina frente a AMR aislados en 2 períodos de tiempo distintos (2002-2003 y 2006-2008), y no se hallaron diferencias significativas en la CIM90 del antimicrobiano frente a estos microorganismos.
Se concluye que la tigeciclina presenta buena actividad in vitro frente a aislamientos de Acinetobacter spp. multirresistentes. No obstante, la sensibilidad evaluada mediante la metodología de DD se debería interpretar con cautela, y en presencia de aislamientos que queden en las categorías de resistentes e intermedios, se sugiere evaluar mediante un método por dilución (MD o DA).

Agradecimientos: a la empresa Wyeth por proporcionar los reactivos para la realización de este trabajo y al Dr. Diego Cecchini por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue presentado como tesina en la Carrera de Especialización en Bioquímica Clínica, Área Bacteriología Clínica, perteneciente a la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires, promoción 2006-2008.

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Recibido: 19/05/09
Aceptado: 30/11/09