MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

PCR múltiple para la detección de los genes sea, seb, sec, sed y see de Staphylococcus aureus. Caracterización de aislamientos de origen alimentario

E. A. Manfredi^{1 *}, G.A. Leotta^{1, 2}, M. Rivas¹

¹Servicio Fisiopatogenia, Departamento Bacteriología, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas - ANLIS "Dr. Carlos G. Malbrán". Av. Vélez Sarsfield 563 (1281) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina;
²Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)
*Correspondencia. E-mail: emanfredi@anlis.gov.ar

RESUMEN

La presencia de Staphylococcus aureus en los alimentos representa un riesgo potencial para la salud pública; sus enterotoxinas son el principal factor de virulencia. La detección de las enterotoxinas de S. aureus puede realizarse por ELISA, aunque sólo es posible detectar el pool de enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED y SEE. Los objetivos del presente trabajo fueron optimizar dos técnicas de PCR múltiple para la detección de los genes sea, seb, sec, sed y see de S. aureus y caracterizar un conjunto de 115 aislamientos de Staphylococcus spp. asociados a intoxicaciones alimentarias provenientes de diferentes provincias de Argentina. La caracterización se realizó por pruebas bioquímicas, ELISA y PCR. Sesenta y ocho aislamientos (59,1%) fueron positivos por ELISA, mientras que 61 (53%) fueron positivos por PCR. De los aislamientos positivos por PCR, 34 (55,7%) portaron el gen sea, 9 (14,8%) el gen seb, 5 (8,1%) el gen see, 4 (6,5%) el gen sec, 6 (9,9%) los genes sea y seb, 2 (3,3%) los genes sea y sec, y 1 (1,7%) los genes sea y sed. Este es el primer estudio de caracterización genotípica de aislamientos de S. aureus asociados con brotes de intoxicación alimentaria registrados en distintas provincias argentinas.

Palabras clave: Staphylococcus aureus; Enterotoxinas; Caracterización; PCR; Optimización

ABSTRACT

Multiplex PCR for the detection of sea, seb, sec, sed and see genes of Staphylococcus aureus. Characterization of isolates from food. The presence of Staphylococcus aureus in food represents a potential risk to public health, being its enterotoxins the major virulence factor. Enterotoxin detection can be determined by ELISA, but only for the pool of enterotoxins SEA, SEB, SEC, SED and SEE. The main aims of this study were to optimize two PCR techniques for detection of S. aureus sea, seb, sec, sed and see, and to characterize Staphylococcus spp. isolates associated with food intoxication. Two PCR techniques were optimized and 115 Staphylococcus spp. isolates from Ciudad Autónoma de Buenos Aires, and Buenos Aires, Córdoba, and Neuquén provinces were characterized. The characterization was performed by biochemical tests, ELISA and PCR. Sixty-eight isolates (59.1%) were positive by ELISA, while 61 (53%) were positive by PCR. Out of the positive PCR isolates, 34 (55.7%) carried the sea gene, 9 (14.8%) the seb gene, 5 (8.1%) the see gene, 4 (6.5%) the sec gene, 6 (9.9%) were positive for sea and seb genes, 2 (3.3%) for sea and sec genes, and 1 (1.7%) for sea and sed genes. This is the first study of genotypic characterization of S. aureus isolates associated with food intoxication from different provinces of Argentina.

Key words: Staphylococcus aureus; Enterotoxins; Characterization; PCR; Optimization

En el siglo XXI, las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) siguen constituyendo uno de los principales problemas para la salud pública. Staphylococcus aureus es el agente etiológico más frecuente entre las intoxicaciones de origen alimentario (9). Su presencia en alimentos procesados se debe a la contaminación introducida por los manipuladores, por inadecuadas prácticas de manufactura o por la utilización de materia prima contaminada (4).
Uno de los principales factores de virulencia de S. aureus son las enterotoxinas (SE), proteínas simples, termotolerantes y de bajo peso molecular (26 000-34 000) (1). Las principales enterotoxinas detectadas en intoxicaciones alimentarias son SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED y SEE. Sin embargo, en la actualidad se reconocen 13 nuevos tipos de enterotoxinas cuya implicancia en la salud pública todavía no está totalmente dilucidada, estas son las enterotoxinas SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL, SEM, SEN, SEO, SEP, SEQ, SER y SEU (2).
En Argentina, la detección de las enterotoxinas de S. aureus se realiza mediante equipos comerciales de enzimoinmunoensayo (ELISA), los que no permiten diferenciar cada una de ellas. Uno de estos equipos es automatizado y se basa en la técnica ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) (VIDAS, bioMérieux). El otro es manual, muy sencillo de utilizar y no requiere un equipo para la lectura de los resultados (TECRA, 3M). Una alternativa para identificar los aislamientos de S. aureus potencialmente enterotoxigénicos es detectar los genes que codifican la expresión de las SE.
Los objetivos del presente trabajo fueron optimizar dos técnicas de PCR múltiple para la detección de los genes sea, seb, sec1, sec2, sec3, sed y see de S. aureus y caracterizar aislamientos de Staphylococcus spp. asociados a intoxicaciones alimentarias. Los 115 aislamientos que se analizaron fueron provistos por las siguientes instituciones: Agencia Córdoba Ciencia S.A.; Laboratorio Central de Salud Pública de la Provincia de Buenos Aires; Laboratorio de Microbiología de Alimentos DLIM-DGHySA de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires; Hospital Heller de la provincia de Neuquén; Universidad Nacional de Río Cuarto; Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (UNLP-CONICET) y Universidad Nacional de Lanús.
Para realizar la caracterización fenotípica y genotípica de los aislamientos se utilizaron como controles positivos las cepas N5 (sea), N14 (seb), MC1 (sec), C1 (sed) y N19125 (see), provistas por la Agencia Córdoba Ciencia S.A. Como control negativo se utilizó la cepa S. aureus ATCC 25923.
Las cepas control y los 115 aislamientos de Staphylococcus spp. fueron cultivados en agar Baird Parker (Laboratorios Britania, Buenos Aires, Argentina) para evaluar la reducción de telurito y la producción de lecitinasa. Se efectuaron las pruebas de catalasa, coagulasa en tubo, DNAsa (Laboratorios Britania), producción de acetoína (caldo RM/VP, Laboratorios Britania) y reducción de nitrato [caldo cerebro corazón (CCC) 2,5% KNO₃ 0,1]. Luego se evaluó la capacidad de los aislamientos para fermentar hidratos de carbono (ICN Biomedials Inc., Ohio, EE.UU.) al 1% en caldo base de rojo fenol (Becton Dickinson). Los azúcares utilizados fueron trehalosa, lactosa y manosa. Finalmente, los aislamientos fueron analizados por el equipo miniVIDAS (bioMérieux, Marcy L'Étoile, Francia), una versión más compacta del equipo VIDAS antes citado que, al igual que aquél, utiliza un sustrato fluorescente (ELFA) para la detección de las toxinas SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED y SEE de Staphyloccoccus spp. La extracción de enterotoxinas se realizó según Gubbay et al. (7).
La extracción de ADN para la realización de las PCR se realizó según Leotta et al. (10) con algunas modificaciones. Cada aislamiento fue incubado en agar cerebro corazón (ACC) (Becton Dickinson) a 37 °C durante 24 h. Posteriormente, se incubó una colonia en 5 ml de CCC (Becton Dickinson) a 37 °C durante 24 h. De cada CCC se tomaron alícuotas de 1,5 ml en tubos Eppendorf y se centrifugó a 10 000 rpm durante 5 min. Descartado el sobrenadante, el sedimento fue resuspendido en 150 μl de buffer tritón [tritón X-100 (Merck, Darmstadt, Alemania) al 1% en buffer TE 1X (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8)]. Después de haber sido calentados a ebullición durante 30 min, los tubos fueron centrifugados a 10 000 rpm durante 5 min. Una alícuota de 5 μl de sobrenadante fue utilizada como ADN templado. Los cebadores empleados para la detección de los genes sea, seb, sec, sed, see y ADNr 16S fueron los descritos por Monday et al. (14) y Lovseth et al. (13) (Tabla 1). Se optimizaron dos técnicas de PCR: 1) para la detección de los genes sea, seb y sec; y 2) para la detección de los genes see y sed. En ambas PCR se incorporó un par de cebadores para amplificar el gen ADNr 16S como control interno de amplificación no competitivo (Figuras 1 y 2). La mezcla de reacción de ambas PCR contenía en un volumen final de 50 μl, 300 mM de cada uno de los cebadores para amplificar los genes codificantes de enterotoxinas y 60 mM de los cebadores para amplificar el gen ADNr 16S (Invitrogen), 400 μM de cada dNTP (Promega, Madison, WI, EE.UU.), buffer de PCR 1X (Fermentas, California, EE.UU.), 0,4 mM MgCl₂ (Fermentas), 0,04 U/μl de Taq polimerasa (Fermentas) y 5 μl de ADN muestra y de los controles correspondientes. Además, se utilizaron 50 μl de mezcla de reacción de PCR sin ADN templado como control del sistema. Las condiciones de amplificación para ambas PCR fueron: 95 °C 5 min; 15 ciclos de 95 °C 30 s, 68 °C 30 s y 72 °C 30 s; 20 ciclos de 95 °C 30 s, 60 °C 30 s y 72 °C 30 s; y un paso de extensión final a 72 °C durante 2 min. Para la electroforesis y adquisición de imágenes se agregaron 10 μl de una solución de xileno-cianol 0,25% y glicerol 30% a 50 μl del ADN amplificado; luego se sembraron 10 μl en un gel de agarosa al 2,5% en buffer TAE 1X adicionado con 0,5 μg/ml de bromuro de etidio. El tiempo de corrida fue de 25 min y el voltaje fue de 100 V. Se utilizó el marcador de peso molecular Cienmarker (Biodynamics S.R.L., Buenos Aires, Argentina). Para documentar los geles, se utilizó un transiluminador modelo 2000 (BioRad, Hercules, California, EE.UU.) y el sistema Olympus-5060 Wide Zoom (Melville, EE.UU.). El análisis de los geles se realizó con el programa Doc-It Image Acquisition (UVP, Inc., Upland CA, EE.UU.).

Tabla 1. Secuencia de los cebadores utilizados en las dos técnicas de PCR para la detección de los genes sea, seb, sec, sed, see y ADNr 16S de Staphylococcus aureus, según Lovseth A et al.

Figura 1. PCR múltiple para la detección de los genes sea (521 pb), seb (667 pb), sec (284 pb) y ADNr 16S (228 pb) de Staphylococcus aureus. Calles 1 y 2: aislamientos obtenidos de alimentos asociados a brotes de intoxicación alimentaria; calle 1: aislamiento de S. aureus portador del gen seb; calle 2: aislamiento de S. aureus no toxigénico. Calle 3: control positivo sea (N5). Calle 4: control positivo sec (MC1). Calle 5: control positivo seb (N14). Calle 6: control de reactivos. Calle 7: marcador de peso molecular Cienmarker (Biodynamics).

Figura 2. PCR múltiple para la amplificación de los genes sed (385 pb), see (171 pb) y ADNr 16S (228 pb) de Staphylococcus aureus. Calles 1 a 4: aislamientos obtenidos de alimentos asociados a brotes de intoxicación alimentaria; calles 1 y 4: aislamientos de S. aureus no toxigénicos; calles 2 y 3: aislamientos de S. aureus portadores del gen see. Calles 5 y 6: cepas control sed (C1) y see (N19125), respectivamente. Calle 7: control de reactivos. Calle 8: marcador de peso molecular Cienmarker (Biodynamics).

Sobre un total de 115 aislamientos de Staphylococcus spp. analizados, 113 fueron identificados como S. aureus subespecie aureus (98%), 11 aislamientos no utilizaron lactosa (9,7%) y 3 no utilizaron trehalosa (2,6%). Dos aislamientos fueron identificados como estafilococos coagulasa negativos. Por la técnica de enzimoinmunoensayo, 68 aislamientos fueron positivos para el pool de enterotoxinas SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED y SEE (59,1%). En 61 de los 115 aislamientos analizados (53,0%) se detectó alguna de las SE buscadas: 34 (55,7%) portaron el gen sea, 9 (14,8%) el gen seb, 5 (8,1%) el gen see y 4 (6,5%) el gen sec. Asimismo, 6 (9,9%) aislamientos fueron positivos para los genes sea y seb, 2 (3,3%) para los genes sea y sec y 1 (1,7%) para los genes sea y sed. Ninguno de los dos aislamientos de estafilococos coagulasa negativos fueron positivos para las enterotoxinas buscadas.
En los últimos años se desarrollaron numerosas técnicas de PCR múltiple para la detección de los genes que codifican las enterotoxinas de S. aureus (5, 6, 8). Las técnicas basadas en PCR fueron utilizadas en estudios epidemiológicos (3) y en el análisis de alimentos de riesgo (15). Algunas de estas nuevas técnicas permiten detectar un mayor número de genes que codifican enterotoxinas (2) y en ellas se utilizan varios cebadores, hecho que aumenta la complejidad y el costo de la caracterización. En este trabajo se optimizaron dos técnicas de PCR múltiple para la detección de los genes sea, seb, sec, sed y see con el fin de caracterizar los aislamientos de S. aureus asociados con intoxicación alimentaria. Para ello se tuvo en cuenta que el 95% de los aislamientos provenientes de brotes de ETA producen SEA, SEB, SEC, SED y SEE o sus combinaciones, mientras que sólo el 5% restante corresponde a las nuevas toxinas (2). Es interesante mencionar que las PCR descritas en este trabajo fueron utilizadas para el estudio epidemiológico de diferentes brotes de ETA en Argentina (11, 12).
La técnica de extracción de ADN utilizada en este trabajo no es de uso frecuente. Sin embargo, se obtuvieron resultados válidos de un modo más rápido, sencillo y económico que con los métodos artesanales y comerciales (10).
En lo concerniente a las técnicas de PCR, en esta investigación se modificó la cantidad de cebadores y el tiempo de ciclado respecto de los descritos por Monday et al. (14). Estas modificaciones permitieron utilizar una enzima Taq polimerasa convencional con resultados confiables, además de reducir los costos y el tiempo para la obtención de los resultados. Se analizaron 115 aislamientos provenientes de alimentos asociados con intoxicaciones alimentarias de diferentes provincias del país y se demostró que el gen predominante fue sea. Este hallazgo coincide con reportes previos en los cuales se caracterizaron aislamientos de S. aureus vinculados con intoxicaciones alimentarias y manipuladores de alimentos (4). Al analizar los mismos aislamientos por el sistema ELFA, se observó una mayor proporción de aislamientos positivos (un 6% más) comparado con los resultados obtenidos por las técnicas de PCR. Esta diferencia puede interpretarse como un falso resultado positivo del ELISA, el cual está contemplado en los equipos comerciales. Para los fabricantes de dichos equipos, la proporción de falsos resultados positivos es del 0,4%, un valor inferior al observado en el presente trabajo. Sin embargo, debemos considerar que el valor aportado por los fabricantes fue determinado sobre productos alimenticios y no a partir de cepas aisladas.
En el presente trabajo, la caracterización fenotípica y genotípica se basó en la detección de las enterotoxinas SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED y SEE y de los genes que las codifican. Sin embargo, sería importante desarrollar una segunda línea de PCR para detectar los genes que codifican las nuevas enterotoxinas, a fin de conocer la incidencia de estas enterotoxinas en la ETA e investigar su relevancia en la salud pública de nuestro país.
Cabe destacar, finalmente, que este es el primer estudio de caracterización genotípica de enterotoxinas provenientes de aislamientos de S. aureus asociados con brotes de intoxicación alimentaria registrados en distintas provincias argentinas.

Agradecimientos: los autores agradecen la valiosa colaboración de Nancy Passalacqua (Agencia Córdoba Ciencia), Universidad Nacional de Río Cuarto, Sergio Epszteyn (Laboratorio de Microbiología de Alimentos DLIM-DGHySA, G.C.B.A.), Guillermo Guirin (Universidad Nacional de Lanús), bioMérieux por el equipo miniVIDAS y los equipos para la detección de enterotoxinas de S. aureus. Hospital Heller (Neuquén); Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (UNLP-CONICET).

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Recibido: 20/04/10
Aceptado: 13/07/10