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Revista argentina de microbiología

Print version ISSN 0325-7541

Rev. argent. microbiol. vol.43 no.2 Ciudad Autónoma de Buenos Aires June 2011

 

AGENTES ANTIMICROBIANOS

Evaluación de tres métodos para la detección de la sensibilidad in vitro de especies de Candida a los antifúngicos

 

Ivana Maldonado1*, Liliana Fernández Canigia1, Walter Vivot, Patricia Domecq1, Graciela Davel2, Susana Córdoba2

1 Sección Microbiología, Laboratorio Central, Hospital Alemán; Av. Pueyrredón 1640 (CP1118) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina;
2 Departamento Micología, INEI - ANLIS "Dr. Carlos G. Malbrán", Av. Vélez Sarsfield 563 (C1282AFF) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
*Correspondencia. E-mail: ivanam27@gmail.com

 


RESUMEN

Los métodos de referencia E. Def 7.1 y M27-A3, que detectan resistencia in vitro a los antifúngicos, son onerosos y muy laboriosos, por lo que su implementación en los laboratorios hospitalarios es limitada. Existen técnicas comerciales de simple realización, que permitirían obtener resultados comparables a los que se obtienen con los métodos estándares. Los objetivos de esta investigación fueron: a) comparar los resultados de concentración inhibitoria mínima obtenidos según el método de referencia E.Def 7.1 con los obtenidos mediante el empleo del equipo comercial ATB® Fungus 3 en un conjunto de 82 aislamientos clínicos de Candida spp. frente a los siguientes antifúngicos: anfotericina B, 5-fluorocitosina, fluconazol e itraconazol; b) comparar en ese mismo conjunto de aislamientos los resultados del estudio de sensibilidad al fluconazol por difusión en agar empleando tabletas Neo-SensitabsTM o discos Malbrán con los que se obtienen por el método de referencia. La concordancia general entre el método de referencia y el ATB® Fungus 3 fue del 90,2 %, mientras que la concordancia del método de referencia con los métodos por difusión con discos y con tabletas alcanzó el 96,3% y el 92,7 %, respectivamente. El ATB® Fungus 3 fue eficaz para determinar la sensibilidad a la anfotericina B y a la 5-fluorocitosina, pero se observaron discrepancias al evaluar la sensibilidad a los azoles. Los métodos por difusión resultaron útiles para determinar la sensibilidad al fluconazol; sin embargo, observamos 3 discrepancias muy mayores, 1 mayor y 2 menores con el método de difusión con tabletas, mientras que con los discos solo se produjeron 3 discrepancias menores.

Palabras clave: Candida; Levaduras; Sensibilidad a los antifúngicos

ABSTRACT

Evaluation of three methods for in vitro detection of antifungal susceptibility of Candida species. Reference methods E.Def 7.1 and M27-A3 detect in vitro resistance; however, they are expensive and very laborious. Thus, their actual use in hospital laboratories is limited. There are commercial techniques available, having easier accessibility and development, which would yield results comparable to those of the reference methods. The objectives of this study were: a) to compare the results of minimal inhibitory concentration of 82 Candida spp. clinic isolates according to reference method E.Def 7.1 and ATB® Fungus 3; b) to compare the results of fluconazole susceptibility testing by disk diffusion in agar with Neo-SensitabsTM tablets and Malbrán disks with those of the reference methods. Minimal inhibitory concentration for amphotericin B, 5-flucytosine, fluconazole and itraconazole was performed according to the E.Def 7.1 and the ATB Fungus 3 methods and diffusion was carried out with fluconazole disks and tablets. General concordance between the reference method and ATB Fungus 3 was 90.2 % and 96.3 and 92.7% for diffusion with disks and tablets. The ATB Fungus 3 method was effective to determine susceptibility against amphotericin B and 5-flucytosine; however, discrepancies were observed with azole drugs. Disk diffusion methods are useful to determine susceptibility to fluconazole; however, 3 very major, 1 major and 2 minor errors were observed with the tablets, whereas only 3 minor errors were observed with the disks.

Key words: Candida; Yeasts; Antifungal susceptibility


 

INTRODUCCIÓN

Candida albicans y otras especies del género Candida son la causa principal de infecciones fúngicas invasoras (candidemia) en pacientes hospitalizados (6, 8, 17, 22, 23).
La implementación del tratamiento antifúngico adecuado dentro de las 12-24 horas de obtener un hemocultivo positivo es de vital importancia, ya que permitiría disminuir en forma significativa la mortalidad asociada a la candidemia (13, 18, 24). Al respecto, Rodero et al. comunicaron que el porcentaje de mortalidad asociada a candidemia en los pacientes que recibieron tratamiento antifúngico fue de 26,3 %, mientras que en los pacientes no tratados fue del 47 % (32). Los métodos de referencia M27-A del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (3) y el E.Def 7.1 del European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) (11) permiten determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) frente a las levaduras. Ambos estándares son fiables, reproducibles y muy útiles para la vigilancia epidemiológica. Gracias a ellos se puede conocer el perfil de sensibilidad de las distintas especies y, de esa forma, elegir el tratamiento inicial más adecuado. Sin embargo, la realización de estas técnicas es onerosa y muy laboriosa, por lo que su implementación se ve limitada en los laboratorios clínicos.
El fluconazol es la droga de primera línea más usada en los pacientes hospitalizados. Ante la emergencia de cepas resistentes, el CLSI publicó en 2004 el estándar por difusión en agar M44-A (21). De esta forma, es posible determinar de manera rápida la sensibilidad al fluconazol en levaduras del género Candida (14, 29, 30, 35). Por otra parte, en el Departamento de Micología INEI, ANLIS "Dr. C. Malbrán" se desarrolló y estandarizó un método de difusión en agar que utiliza discos de papel cargados con fluconazol. Este método permite realizar como práctica de rutina en los laboratorios el tamizaje de los aislamientos clínicos y conocer el nivel de sensibilidad de las levaduras del género Candida frente al citado agente (31). Además, están disponibles en el mercado equipos que permiten determinar la sensibilidad a los antifúngicos por microdilución o por difusión en agar. El sistema ATB® Fungus 3 (bioMérieux, Francia) involucra una técnica de dilución en caldo, no colorimétrica, basada en el M27-A del CLSI, mientras que las tabletas Neo-Sensitabs (Rosco Diagnostica A/S, Dinamarca) se utilizan para la determinación de la sensibilidad por difusión en agar (34).
Es importante conocer el perfil de sensibilidad de los aislamientos clínicos, no solo para elegir la mejor alternativa terapéutica, sino también para vigilar la epidemiología de la resistencia y colaborar con la elección de los tratamientos empíricos iniciales más adecuados. En el comercio existe una amplia variedad de equipos potencialmente útiles para realizar la determinación de la sensibilidad in vitro frente a los antifúngicos; sin embargo, es aconsejable que los laboratorios evalúen estas técnicas y las comparen con los estándares antes de decidir su implementación en la rutina.
Los objetivos de este trabajo fueron: a) comparar las CIM de cuatro antifúngicos (anfotericina B, 5-fluorocitosina, fluconazol e itraconazol) obtenidas por microdilución según el método de referencia E. Def 7.1 del EUCAST (en adelante, MR) con las determinadas mediante el sistema comercial ATB® Fungus 3 (en adelante, ATB F3) en 82 aislamientos clínicos de Candida spp.; b) comparar los resultados de sensibilidad al fluconazol que se obtienen por el método de difusión en agar con tabletas Neo-Sensitabs (en adelante, T) y con el método de discos desarrollado por el Instituto Malbrán (en adelante, DM) con los que arroja el método de referencia.

MATERIALES Y MÉTODOS

Microorganismos
Se estudiaron 62 aislamientos de Candida spp. obtenidos de pacientes de ambos sexos, hospitalizados y ambulatorios, que fueron atendidos en el Hospital Alemán de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires durante el período 2005-2008. Además, se incluyeron en el estudio 20 aislamientos de Candida spp. pertenecientes a la colección de cultivos del Departamento de Micología INEI, ANLIS ¨Dr. Carlos G. Malbrán¨.
Las siguientes especies del género Candida fueron incluidas en el estudio: Candida albicans (n = 37), C. tropicalis (n = 18), C. glabrata (n = 10), C. parapsilosis (n = 9), C. krusei (n = 4), C. guilliermondii (n = 2), C. famata (n = 1), C. inconspicua (n = 1).

Identificación de los microorganismos
Las levaduras fueron identificadas a nivel de especie mediante el estudio de las características micromorfológicas en agar leche con Tween 80 al 1 %, el cultivo en CHROMagar Candida® (CHROMagar Company Ltd., Francia) y la evaluación de la asimilación de fuentes de carbono con ID 32C (bioMérieux, Marcy L`Etoile, Francia). Los aislamientos del Departamento de Micología INEI, ANLIS ¨Dr. Carlos G. Malbrán¨ fueron identificados utilizando pruebas bioquímicas, fisiológicas y morfológicas según el método de Kurtzman et al., con modificaciones (7, 16).

Pruebas de sensibilidad in vitro
Concentración inhibitoria mínima: se utilizó el método de referencia E.Def 7.1 del EUCAST (11).
- Medio de cultivo: se utilizó RPMI 1640 con 2 % de glucosa, tamponado a pH 7 con ácido morfolino propano sulfónico (MOPS) (Sigma, Argentina) 0,165 M.
- Antifúngicos: se ensayó la actividad in vitro de la anfotericina B (AMB), la 5-fluorocitosina (5-FC) (Sigma, Argentina), el fluconazol (FZL) (Pfizer, S. A., Argentina) y el itraconazol (ITR) (Janssen, Argentina). Las soluciones stock de AMB, ITR y FZL se prepararon en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma, Argentina), y la de 5-FC en agua destilada estéril. Los rangos de concentraciones probados fueron 0,015 a 16 μg/ml para la AMB y el ITR y de 0,13 a 128 μg/ml para la 5-FC y el FZL. La CIM se determinó en placas de 96 pocillos, fondo plano (Nunclon 167008, Nunc, Naperville, IL, EE.UU.).
- Inóculo: se realizó a partir de un cultivo de 24 horas a 35 °C en agar YM (extracto de malta 0,3 %; extracto de levadura 0,3 %; peptona 0,5 %; glucosa 1 %; agar 2 %). Se preparó un inóculo de turbidez 0,5 McFarland en solución 0,15 M de cloruro de sodio estéril (solución salina 0,85 %) (SSE) (1-5 x 106 UCF/ml).
Se sembraron las placas y se incubaron durante 24 y 48 horas. La lectura se realizó en un lector a 405 nm (Labsystems Multiskan Multisoft, Basingstoke, Reino Unido). Para calcular el 100 % de crecimiento, se promedió la absorbancia de las celdas controles sin droga. Se consideró CIM de AMB a aquella concentración que provocó una disminución de la densidad óptica del 95 % comparada con la del control de crecimiento, mientras que para los azoles y la 5-FC se consideró una reducción del 50 %.
Puntos de corte: recientemente el EUCAST publicó los siguientes puntos de corte en μg/ml: FZL, sensible (S) ≤ 2, sensible dependiente de la dosis (DD) 4, resistente ® > 4; voriconazol, S ≤ 0,125, R > 0,125. Para los restantes antifúngicos, se consideraron los siguientes puntos de corte: 5-FC, S ≤ 4, DD 8-16 y R ≥ 32; ITR, S ≤ 0,13, DD 0,25-0,50 y R ≥ 1; AMB, S ≤ 1, R > 2. Cabe aclarar que para este último agente no hay puntos de corte establecidos, por lo que se utilizaron los sugeridos según las CIM poblacionales de los aislamientos (3).ATB F3: la técnica se llevó a cabo según las indicaciones del fabricante. El sistema ATB F3 consiste en una galería que contiene 16 pares de cúpulas. El primer par, sin antifúngico, es para el control de crecimiento. Los 15 pares siguientes contienen 5 antifúngicos con los siguientes rangos de concentración en μg/ml: 5-FC, 4-16; AMB, 0,5-16; FZL, 0,25-128; ITR, 0,125-4; y VCZ 0,06-8. En el presente estudio no se evaluó la sensibilidad de los aislamientos de Candida spp. frente al voriconazol.
- Inóculo: a partir de un cultivo puro de 24 horas se realizó una suspensión de turbidez equivalente a 2 de la escala McFarland, luego se transfirieron 20 μl de esta suspensión al ATB F3 Medium y se procedió a inocular las galerías, se distribuyeron 135 μl de ATB F3 Medium por cúpula (3 x 104 levaduras/ml o 4 x 103 levaduras por cúpula). Se colocó la galería en un contenedor hermético con un papel absorbente humedecido. Se incubó durante 24 horas (± 2 horas) en aerobiosis a 35 °C. Cuando el crecimiento fue insuficiente, se incubó 24 horas más. En todos los ensayos se verificó la presencia de un crecimiento suficiente en las cúpulas testigo. La lectura se realizó de manera visual.
Se tomaron como puntos de corte los valores de CIM en μg/ml considerados por el fabricante: AMB, S ≤ 1 y R > 2; 5-FC, S ≤ 4, DD 8-16 y R ≥ 32; FZL, S ≤ 8, DD 16-32 y R ≥ 64; e ITR, S ≤ 0,13, DD 0,25-0,50 y R ≥1.

Métodos de difusión en agar
- Antifúngico: se evaluó el fluconazol. La carga de fluconazol fue de 25 μg por disco y por tableta.
- Inóculo: se preparó un inóculo de turbidez 0,5 de la escala de McFarland en SSE a partir de un cultivo de 24 horas a 35 °C en agar YM. Se utilizaron placas de Petri con medio Mueller-Hinton, con el agregado de 2 % de glucosa y azul de metileno, concentración final de 0,5 μg/ml (MHM). Las placas se sembraron por inundación, previa dilución 1/10 en 5 ml de SSE a partir del inóculo inicial. Se inundó la placa de MHM con 5 ml del inóculo inicial diluido, se dejó en contacto 5 minutos y se extrajo el líquido excedente. Los discos/tabletas se colocaron sobre la superficie del agar de la placa previamente inoculada con la ayuda de una pinza estéril. Luego las placas se incubaron a 35 ± 2 °C durante 24 horas; si transcurrido este tiempo los halos no eran claramente distinguibles, se prolongó la incubación 24 horas más. La lectura se realizó con la ayuda de una regla para medir el diámetro del halo externo de la zona de inhibición. Se asumió que las colonias más pequeñas que desarrollaron dentro de la zona de inhibición obedecieron a un efecto de crecimiento residual, por lo que no se las consideró como mutantes resistentes (31, 34).
- Interpretación de los resultados.
Ensayo con discos Malbrán (DM): se consideró sensible al aislamiento que produjo un diámetro del halo ≥ 16 mm; a los aislamientos que presentaron un diámetro del halo < 16 mm se les determinó la sensibilidad al fluconazol por el método de referencia (CIM) (31).
Ensayo con tabletas Neo-Sensitabs (T): cuando el diámetro del halo fue >19 mm se consideró sensible; si el diámetro del halo estaba entre 18 y 15 mm se consideró sensible dependiente de la dosis, y cuando el diámetro del halo fue de ≤14 mm se consideró resistente (34).
Para los métodos estudiados se observaron distintas categorías de discrepancias. Las discrepancias muy mayores se calcularon sobre el número de aislamientos que fueron clasificados como sensibles por los métodos de ATB F3, DM o T y como resistentes por el MR. Las discrepancias mayores se determinaron por el número de cepas resistentes por los métodos ATB F3, DM o T y sensibles por el MR. Las discrepancias menores se definieron cuando por uno de los métodos el resultado fue sensible dependiente de la dosis y por el otro sensible o resistente.

Análisis estadístico
La CIM se determinó por el método de referencia y se correlacionó con el diámetro de los halos de inhibición obtenidos mediante los métodos de difusión utilizados (discos y tabletas). Para conocer el grado de asociación entre el método de referencia y los métodos de difusión, se realizaron los correspondientes análisis de regresión lineal (r) y se determinaron los coeficientes de correlación de Pearson (r2). Además, se calculó el porcentaje de concordancia entre el método de referencia y los métodos por difusión.

Control de calidad
Se utilizaron las cepas de referencia: C. krusei ATCC 6258 y C. parapsilosis ATCC 22019 (3, 11, 21).

RESULTADOS

Cuando se evaluó el grado de asociación entre el DM y el MR, el valor de la regresión lineal fue r = 0,69 y el coeficiente de correlación de Pearson r2 = 0,48, p = 0,00; mientras que con las T se obtuvo un r = 0,57, r2 = 0,33 y p = 0,00, respectivamente. El porcentaje de concordancia entre el MR y el ATB F3 fue del 98,8 %, 91,5 %, 91,5 % y 79,3 % para la AMB, la 5-FC, el FZL y el ITR, respectivamente. La concordancia entre el MR y la difusión con DM y T para el FZL fue del 96,3 y 92,7 %, respectivamente.
Para la AMB, el 100 % (82/82) de los aislamientos evaluados mostró valores de CIM ≤ 1μg/ml por el MR, pero por el sistema ATB F3 un aislamiento resultó resistente. Según el MR, el 95,1 % (78/82) fue sensible a la 5-FC; 87,8 % (72/82) fue sensible al FZL y 85,4 % (70/82) fue sensible al ITR. Para el ATB F3, las mayores discrepancias se observaron con el ITR, con un 75,6 % (62/82) de los aislamientos sensibles. En la Tabla 1 se muestra la distribución por categorías de sensibilidad según el método y el antifúngico evaluado.

Tabla 1. Evaluación de la sensibilidad a los antifúngicos de aislamientos de Candida spp. con el método de referencia*, con el sistema comercial ATB Fungus 3 y con métodos de difusión. Discrepancias entre las metodologías evaluadas.

Cuando se evaluó la actividad in vitro de la AMB, solo un aislamiento de C. albicans mostró una discrepancia mayor. Sin embargo, se observaron las siguientes discrepancias según el antifúngico y la especie evaluada: a) 5-FC, 1 discrepancia muy mayor con C. tropicalis; 1 discrepancia mayor con C. albicans; 5 discrepancias menores (1 con C. albicans, 3 con C. krusei y 1 con C. tropicalis); b) FZL, 2 discrepancias muy mayores (1 con C. glabrata y 1 con C. krusei); 2 discrepancias mayores con C. krusei; 3 discrepancias menores (2 con C. tropicalis y 1 con C. guilliermondii).
El mayor número de discrepancias se observó con ITR. Hubo 3 discrepancias muy mayores (2 de ellas con C. glabrata y 1 con C. inconspicua); una discrepancia mayor con C. glabrata y 13 discrepancias menores (2 con C. albicans, 2 con C. krusei, 2 con C. glabrata, 5 con C. tropicalis y 2 con C. guilliermondii). Para los métodos por difusión se evaluó únicamente el FZL. Con los discos Malbrán, solo hubo 3 discrepancias menores, 2 con C. tropicalis y 1 con C. glabrata. Con las tabletas Neo-Sensitabs se observaron las siguientes discrepancias: 3 muy mayores (1 con C. albicans, 1 con C. glabrata, 1 con C. krusei); 1 discrepancia mayor con C. krusei y 2 discrepancias menores, 1 con C. krusei y 1 con C. tropicalis.
Las especies que mostraron mayores discrepancias con los métodos evaluados fueron C. krusei, C. glabrata y C. tropicalis cuando se determinó la sensibilidad a los azoles.

DISCUSIÓN

Las infecciones del torrente sanguíneo por levaduras del género Candida tienen un significativo impacto en la evolución clínica de los pacientes, cuyo desenlace suele ser fatal si no se implementa un tratamiento antifúngico adecuado dentro de las 24 horas de establecido el diagnóstico de candidemia (8, 19, 24, 32). Además, el uso cada vez más frecuente de drogas triazólicas en el tratamiento de infecciones fúngicas oportunistas y el hecho de que haya un número más elevado de pacientes inmunocomprometidos trajeron aparejado un cambio en la distribución de especies de levaduras asociadas a estas infecciones. Por eso es importante conocer el espectro de actividad de los antifúngicos frente a aislamientos clínicos (20, 22, 25-28).
Los documentos M27-A3 (3) y E.Def 7.1 (11) son los estándares reconocidos para determinar la sensibilidad in vitro frente a los antifúngicos. Estos estándares son fiables, reproducibles y muy útiles para la vigilancia epidemiológica; sin embargo, su aplicación en los laboratorios clínicos se ve limitada.
La introducción del fluconazol en tratamientos empíricos y profilácticos en los últimos 30 años tuvo como consecuencia, tanto en niños como en adultos, un cambio en la epidemiología de la candidiasis invasora (22). Es así como en algunos países, C. krusei y C. glabrata ocupan un lugar prevalente por ser especies resistentes o menos sensibles al fluconazol. También es cada vez más frecuente la aparición de C. albicans, C. tropicalis o C. parapsilosis resistentes a los azoles (25). Estos cambios incrementaron el interés por desarrollar una técnica estandarizada, reproducible y más simple, con capacidad para detectar la sensibilidad in vitro a este antifúngico. En respuesta a la demanda, en 2004 el CLSI desarrolló y publicó el documento estándar M44-A (21), que sienta las bases para realizar difusión en agar con discos de fluconazol y que identifica de manera rápida la sensibilidad a fluconazol en levaduras del género Candida. El estándar recomienda realizar una lectura automatizada de los halos, la cual requiere de un equipo con un software. Dado su alto costo, este equipo es poco accesible para la mayoría de los laboratorios clínicos de nuestro país (14, 28, 29, 35).
En el Departamento de Micología INEI, ANLIS ¨Dr. Carlos G. Malbrán¨ se desarrolló y estandarizó un método de difusión en agar que utiliza discos de papel cargados con fluconazol. Esta técnica es aplicable a la rutina de los laboratorios y permite conocer el perfil de sensibilidad de levaduras del género Candida frente a fluconazol (31).
Por otra parte, existen diferentes técnicas disponibles en el comercio que son, por lo general, de fácil realización, económicas y pueden ser utilizadas en los laboratorios clínicos. Sin embargo, los resultados que se obtienen no siempre tienen correlación con el método de referencia, motivo por el cual algunas de ellas pueden presentar problemas a la hora de determinar la sensibilidad a los antifúngicos.
En nuestro estudio, la concordancia general entre el método ATB F3 y el método de referencia fue del 90,2 %, ambos métodos son comparables para la mayoría de los antifúngicos evaluados. El itraconazol fue la droga con más baja concordancia (79,3 %). Nuestros resultados fueron similares a los que obtuvieron otros autores con el ATB F2 (4, 5, 9, 15, 33). Asimismo, la mayor cantidad de discrepancias se observaron con C. glabrata, C. krusei y C. tropicalis frente a los antifúngicos triazólicos.
En este sentido, Eraso et al. compararon el ATB F2 con el Sensititre Yeastone y concluyeron que el ATB F2 es una alternativa simple, efectiva y reproducible para determinar la actividad antifúngica de la 5-FC y la AMB; sin embargo, con FZL e ITR es menos eficaz debido a que encontró discrepancias muy mayores con algunos aislamientos (9). Por otra parte, Torres-Rodríguez y Alvarado-Ramírez (33) compararon el ATB F2 con el Sensititre Yeastone y el M27-A2 y observaron que el ATB F2 tuvo una concordancia global mayor del 95 % con la lectura visual por ambos métodos. Cuando compararon el ATB F2 con el M27-A2, la lectura visual mostró mejor porcentaje de concordancia que la lectura automatizada para los antifúngicos evaluados (AMB, 100 % vs. 97 %; 5-FC, 100 % vs. 97 %; FZL, 97 % vs. 93 %; ITR, 98 % vs. 89 %). Las CIM más altas se debieron al fenómeno de crecimiento residual, particularmente con C. tropicalis y algunos aislamientos de C. albicans; este hallazgo también fue informado por Cuenca-Estrella et al. en sus trabajos (4, 5).
El fabricante del sistema comercial ATB F3 recomienda interpretar como sensibilidad intermedia a los aislamientos de C. glabrata que presentan un resultado sensible al fluconazol o al itraconazol, debido a la sensibilidad media natural de esta especie a estos antifúngicos. En nuestro trabajo se interpretaron los resultados según el valor de la CIM y se asignaron las categorías de resistente, sensible dependiente de la dosis o intermedio y sensible, independientemente de la especie. Se conoce que C. glabrata puede adquirir resistencia secundaria a los antifúngicos azólicos; por ese motivo no se recomienda el uso de fluconazol (30). En este sentido, recientemente el EUCAST comunicó nuevos puntos de corte en μg/ml para fluconazol, sensible ≤ 2 y resistente > 4 para C. albicans, C. parapsilosis y C. tropicalis; y recomienda no evaluar la sensibilidad a este azol en aislamientos de C. glabrata y C. krusei. Una excepción a esto es cuando se recupera C. glabrata de infecciones del tracto urinario, donde la concentración de fluconazol en la orina podría exceder la CIM de la especie (30).
Algunas especies como C. albicans y C. tropicalis pueden presentar el fenómeno de crecimiento residual, que implica una sobreestimación de la CIM de los antifúngicos nitrogenados (fluconazol, itraconazol). Con el ATB F3 este problema sería mayor si la lectura fuese automatizada, según las indicaciones del fabricante.
Cuenca-Estrella et al. (9) comunicaron la existencia de un 5,4 % de discrepancias muy mayores con las tabletas Neo-Sensitabs, por lo que no recomiendan esta técnica para detectar aislamientos resistentes al fluconazol.
Espinel Ingroff et al. (10) obtuvieron un 95,5 % de concordancia entre el método de referencia M27-A2 y las tabletas Neo-Sensitabs para fluconazol y no detectaron discrepancias muy mayores ni mayores. En nuestro trabajo, la concordancia fue del 92,7 % y detectamos un 3,6 %, 1,2 % y 2,4 % de discrepancias muy mayores, mayores y menores, respectivamente.
Por su parte, Vandenbossche et al. encontraron numerosas discrepancias y sugieren cambiar los puntos de corte de resistente ≤ 16 mm y sensible ≥ 30 mm a resistente ≤ 10 mm y sensible ≥ 21 mm, para disminuir las discrepancias muy mayores (35).
Cantón et al. (2) evaluaron la utilidad de las tabletas Neo-Sensitabs frente a fluconazol y encontraron que las discrepancias muy mayores surgieron en C. albicans, C. tropicalis y C. glabrata, y concluyen que las tabletas pueden utilizarse para determinar la sensibilidad al fluconazol; sin embargo, señalan que el punto de corte para definir la resistencia debería ser <17 mm. En nuestro estudio, las discrepancias fueron principalmente con C. glabrata y C. krusei, aunque también las hubo con C. albicans y C. tropicalis.
El sistema ATB F3 y el método por difusión con discos Malbrán pueden ser utilizados con confianza en los laboratorios clínicos para determinar la sensibilidad de aislamientos de Candida spp. a los antifúngicos. Sin embargo, para aquellos aislamientos que fuesen resistentes o sensibles dependientes de la dosis por estos métodos, es recomendable confirmar la sensibilidad por el método estándar por dilución. Debido a las discrepancias muy mayores que se advirtieron, las pruebas con tabletas Neo-Sensitabs no serían un procedimiento confiable para el análisis de sensibilidad a fluconazol, aunque las mayores discrepancias se observaron con C. glabrata y C. krusei; especies que tienen una sensibilidad disminuida al fluconazol o resistencia intrínseca, respectivamente. En las últimas recomendaciones se sugiere no determinar la sensibilidad a este antifúngico en estas especies; podríamos decir que el alerta debería estar con aislamientos de C. albicans y C. tropicalis.
En conclusión, el ATB F3 es un método eficaz y confiable para determinar la sensibilidad a la anfotericina B y a la 5-fluorocitosina. Sin embargo, presenta algunas limitaciones con las especies C. glabrata y C. krusei y con el antifúngico fluconazol. Asimismo, es conveniente evaluar al itraconazol con el método de referencia, por ser la droga que presenta mayores discrepancias.
Con respecto a los métodos de difusión con discos o tabletas, puede afirmarse que son asequibles, de fácil realización y detectan aislamientos sensibles a fluconazol. Es importante destacar que en nuestro trabajo no se observaron discrepancias muy mayores con el método de difusión con discos Malbrán, mientras que sí se observaron con las tabletas Neo-Sensitabs.
Es recomendable que cada laboratorio, antes de implementar estos métodos, realice los estudios comparativos correspondientes para evaluar la correlación que existe entre el método comercial y el método estándar.

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Recibido: 14/09/10
Aceptado: 02/03/011

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