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Revista argentina de microbiología

versión impresa ISSN 0325-7541

Rev. argent. microbiol. vol.43 no.3 Ciudad Autónoma de Buenos Aires jun./set. 2011

 

INFORME BREVE

Detección del gen codificante de la metalo-ß-lactamasa VIM-2 en un integrón de clase 1 asociado con el gen blaCTX-M-2 en un aislamiento clínico de Pseudomonas aeruginosa en el Uruguay: primera comunicación

 

Ana J. Ingold1, Mercedes Castro2, Adriana Nabón2, Graciela Borthagaray1, 2, Carolina Márquez1,3*

1Cátedra de Microbiología, Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Química, Universidad de la República. Avda. Gral. Flores 2124;
2Servicio de Bacteriología, Hospital Central de las Fuerzas Armadas. Avda. 8 de Octubre 3050;
3Cátedra de Microbiología, Departamento de Biociencias, Facultad de Ciencias, Universidad de la República. Iguá 4225, Montevideo, Uruguay

*Correspondencia. E-mail: cmarquez@fq.edu.uy

 


RESUMEN

Con el fin de analizar la presencia de metalo-ß-lactamasas en nuestro medio, se incluyeron en este estudio aislamientos de Pseudomonas aeruginosa causantes de infecciones nosocomiales en un centro hospitalario del Uruguay, en el período comprendido entre abril y setiembre de 2008. En un aislamiento se detectó la presencia del gen codificante de la metalo-ß-lactamasa VIM-2 asociado a un integrón de clase 1 y del gen codificante de una ß-lactamasa de espectro extendido CTX-M-2. Esta es la primera comunicación de la presencia de los genes blaCTX-M-2 y blaVIM-2 en un mismo aislamiento de P. aeruginosa. A pesar de que las carbapenemasas ya han sido ampliamente documentadas en varias partes del mundo, esta es la primera comunicación de una metalo-ß-lactamasa adquirida con actividad carbapenemasa en bacterias patógenas encontradas en el Uruguay.

Palabras clave: Integrón; Carbapenemasas; Pseudomonas; VIM-2; Metalo-ß-lactamasa; CTX-M-2.

ABSTRACT

VIM-2 metallo-ß-lactamase gen detection in a class 1 integron associated to blaCTX-M-2 in a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in Uruguay: first communication. In order to analyze the presence of metallo-ß-lactamase in our country, we included in this study Pseudomonas aeruginosa isolates causing nosocomial infections in a hospital from Uruguay. The presence of a metallo-ß-lactamase VIM-2 in a class 1 integron and of an extended spectrum -lactamase CTX-M-2 was detected in one isolate. This is the first report of both genes, blaCTX-M-2 and blaVIM-2,in the same P. aeruginosa isolate. Although carbapenemases have been extensively documented in the world, this is the first report of an acquired metallo-ß-lactamase with carbapenemase activity in pathogenic bacteria in Uruguay.

Key words: Integron; Carbapenemase; Pseudomonas; VIM-2; Metallo-ß-lactamase; CTX-M-2.


 

Pseudomonas aeruginosa es uno de los principales patógenos oportunistas recuperados en infecciones hospitalarias y se encuentra asociado a una alta tasa de mortalidad. Es capaz de adquirir resistencia a la mayoría de las drogas de utilización clínica; los carbapenems son la opción terapéutica más utilizada en los cuadros graves.
La resistencia a carbapenems en P. aeruginosa puede ser el resultado de la sobre-expresión de sistemas de eflujo, de la impermeabilidad de la membrana externa, de la expresión de ß-lactamasas o de una combinación de estos mecanismos. Las ß-lactamasas descritas en la especie e involucradas en la resistencia a carbapenems son, por un lado las metalo-ß-lactamasas (MBL) pertenecientes a las familias IMP y VIM, y las enzimas SPM-1, GIM-1, SIM-1 y AIM, y por el otro las serino-ß-lactamasas de clase A de Ambler GES-2 y KPC-2. Cabe mencionar, asimismo, la sobreexpresión de la cefalosporinasa intrínseca de la especie de tipo AmpC (9, 12).
La adquisición de genes codificantes de MBL constituye un mecanismo de resistencia con alta implicancia epidemiológica debido a su capacidad de diseminación horizontal. Estas enzimas presentan un perfil de hidrólisis de sustrato amplio y son capaces de hidrolizar cefalosporinas de espectro extendido (cefotaxima, ceftacidima y cefepime) y carbapenems (imipenem y meropenem); no hidrolizan aztreonam y su actividad no es afectada por inhibidores de ß-lactamasas de uso clínico, mientras que es inhibida por quelantes de cationes divalentes como el EDTA. Las carbapenemasas pertenecientes a las familias VIM e IMP son las más diseminadas en la especie; de ellas, la variante VIM-2 es la descrita con mayor frecuencia en todo el mundo. Los genes codificantes se encuentran como elementos móviles (genes en casetes) insertados en integrones de clase 1 o clase 3, los cuales, a su vez, están a menudo asociados a transposones y a plásmidos conjugativos. Esto contribuye a una amplia dispersión en bacterias muy distantes en términos de filogenia (15).
Otras carbapenemasas están todavía restringidas a zonas geográficas determinadas. En particular, en América del Sur se han informado aislamientos que contienen blaSPM-1 en Brasil; blaVIM-11 y blaIMP-13 en Argentina; y blaVIM-8 en Colombia (4, 5, 10, 14).
A pesar de los porcentajes de aislamientos de P. aeruginosa resistentes a imipenem (24 %) y a meropenem (31 %) informados por el Sistema Nacional de Vigilancia de Infecciones Intrahospitalarias del Ministerio de Salud Pública del Uruguay, al presente no hay información sobre la presencia de carbapenemasas en este país (8).
También se han descrito en P. aeruginosa ß-lactamasas de espectro extendido (BLEE) pertenecientes a las familias SHV, TEM, PER, VEB, BEL, GES, y más recientemente, CTX-M-2 (11).
En este trabajo se comunica la presencia de carbapenemasas en aislamientos de P. aeruginosa provenientes de un centro de asistencia médica de Montevideo, Uruguay, y el hallazgo del gen codificante de la MBL VIM-2, así como la descripción de su contexto genético.
Se estudiaron siete aislamientos consecutivos de P. aeruginosa recuperados de siete pacientes internados en el Hospital Central de las Fuerzas Armadas de Mon- tevideo, en el período de abril a setiembre de 2008. Los aislamientos fueron identificados mediante el método automatizado VITEK 2 utilizando tarjetas GN (bioMérieux, EE.UU.). El resultado se obtuvo tras 5 a 7 horas de incubación, con probabilidades de identidad del 97 al 99 % para P. aeruginosa, y se expresó con un código numérico o bionúmero.
Cada aislamiento se subcultivó en medio TSA, se incubó a 35 °C durante 24 horas y se conservó a -20 °C en medio infusión cerebro corazón con glicerol al 20 %.
Se realizó el antibiograma por difusión en agar según la metodología indicada por el CLSI (3). Los antibióticos ensayados fueron los siguientes: piperacilina/tazobactama (TZP), 100 y 10 μg; ceftacidima (CAZ), 30 μg; cefepima (FEP), 30 μg; aztreonam (ATM), 30 μg; imipenem (IMP), 10 μg; meropenem (MEM), 10 μg; y amicacina (AMK), 30 μg (Oxoid, Reino Unido) (3), y se determinó la CIM a IMP utilizando el E-test (AB biodisk, Suecia). Se agregó el ensayo de sinergia con doble disco para tazobactama, CAZ, FEP e IMP, y para ácido borónico 300 μg (Britania, Argentina), CAZ e IMP.
El origen de los aislamientos y los resultados de la identificación y de los ensayos de sensibilidad se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Origen y características fenotípicas de los aislamientos de Pseudomonas aeruginosa

(1)TZP: piperacilina/tazobactama. CAZ: ceftacidima. FEP: cefepima. IMP: imipenem. MEM: meropenem. ATM: aztreonam. AMK: amicacina., R: resistente, I: intermedio, S: sensible, según criterios determinados por la norma CLSI 2010 (3); (2)U: urocultivo, PC: punta de catéter, H: hemocultivo; (3)CCI: centro de cuidados intensivos; SM: sala de medicina; CCIN: centro de cuidados intensivos de niños; SC: sala de cirugía; (4)Bionúmero: código numérico de sistema de VITEK 2; (5)coaislado con Klebsiella pneumoniae; (6)MIEm: ensayo microbiológico imipenem-EDTA modificado; (7)sd: sin dato.

Los aislamientos U-011, U-004 y U-057 presentaron sensibilidad disminuida o resistencia a la CAZ, con un halo de inhibición menor de 18 mm, lo que ameritó la detección fenotípica de carbapenemasa. Se colocó un disco que contenía EDTA 372 μg y mercaptoacetato de sodio 900 μg (Britania, Argentina) a 15 mm de borde a borde de un disco de IMP y de un disco de MEM, según el ensayo de sinergia previamente descrito (1). Solo el aislamiento U-011 presentó un agrandamiento en el halo de inhibición del disco de carbapenem en la zona adyacente al disco de EDTA, que se interpretó como un ensayo de sinergia positivo y que sugirió la presencia de una MBL.
También se estudió la expresión fenotípica de carbapenemasas por un ensayo microbiológico, el de imipenem-EDTA (MIEm), utilizando perforaciones en el agar en lugar de discos (Figura 1), y el extracto enzimático crudo obtenido mediante ruptura por congelamiento/ descongelamiento (6). Se colocó un disco de IMP en el centro de una placa con agar Müeller-Hinton previamente hisopada con una suspensión de Escherichia coli ATCC 25922, y se realizaron cuatro perforaciones a 8 mm del disco. En las perforaciones se depositaron 40 μl de: extracto enzimático solo (S); extracto enzimático con sulfato de zinc 0,1 mM (S/Zn); extracto enzimático con EDTA 20 mM (S/E); y buffer Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, como control negativo (B).
Se observó crecimiento de E. coli alrededor de S y S/Zn con los aislamientos U-011 y U-004, y sólo en este último se observó crecimiento alrededor de S/E. Este resultado sugiere la producción de una carbapenemasa inhibible por EDTA (carbapenemasa MBL) en el aislamiento U-011, de una carbapenemasa no inhibible por EDTA (carbapenemasa no MBL) en el aislamiento U-004 y la ausencia de actividad detectable con el aislamiento U-057 (Figura 1).


Figura 1. (A) Detección fenotípica de MBL correspondientes a los aislamientos U-011 (izquierda) y U-004 (centro) por el ensayo microbiológico de EDTA/imipenem. S: extracto enzimático; S/Zn: extracto enzimático con sulfato de zinc 0,1 mM; S/E: extracto enzimático con EDTA 20 mM; B: buffer Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, control negativo. (B) Ensayo de sinergia empleando discos con EDTA 372 μg-mercaptoacetato de sodio 900 μg, imipenem 10 μg y meropenem 10 μg.

Los aislamientos U-011 y U-004 fueron resistentes a IMP y MEM; las CIM del IMP fueron > 32 μg/ml y 16 μg/ ml, respectivamente, y se observó una correlación entre el resultado del método por difusión en agar a partir de discos y la determinación de la CIM por el E-test para este antibiótico. El aislamiento U-011 fue resistente a cefalosporinas de espectro extendido y a TZP, y sensible a ATM y AMK. El otro aislamiento resistente a carbapenems fue únicamente resistente a CAZ y AMK.
Dada la ubicuidad de los genes codificantes de MBL de tipo IMP y VIM en casetes génicos asociados a integrones de clase 1, se realizó la búsqueda de estos últimos como herramienta para su detección en el aislamiento U-011. La amplificación del gen intI1, codificante de la integrasa IntI1, la amplificación de la región variable comprendida entre los extremos conservados 5´ y 3´, y la detección de la región ISCR1 como marcador de integrón inusual se realizaron por PCR con el uso de tres pares de oligonucleótidos, HS463A/HS464, HS458/HS459 y HS819/HS820, respectivamente, a partir del ADN total (7). La extracción del ADN se realizó mediante la lisis de una suspensión bacteriana con proteinasa K y SDS, seguida de la precipitación de proteínas con cloruro de sodio y del ADN con isopropanol (2). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 94 °C durante 5 minutos, seguidos de 35 ciclos de 94 °C 30 segundos, 60 °C 30 segundos y 72 °C 2 minutos, y un período de extensión final a 72 °C durante 10 minutos, utilizando un termociclador Labnet Multigene II.
La amplificación de la región variable comprendida entre la región ISCR1 y el segundo extremo conservado 3´(3´-SC2), habitualmente presente en los integrones inusuales, se realizó con los oligonucleótidos HS821/ HS822, aplicando un tiempo de extensión de 5 min a 72 °C (8). Los productos amplificados fueron purificados con el uso de resinas (Quiaquick Gel Extraction Kit, Quiagen) y enviados a secuenciar (Macrogen Inc., Korea). Las secuencias fueron analizadas utilizando la herramienta Basic Local Alignment Search Tool.
La amplificación del gen intI1 fue positiva, se obtuvo un producto de 490 pb, resultado compatible con la presencia de un integrón de clase 1. La amplificación de la región variable generó un producto de 1200 pb cuya secuencia reveló la presencia de un solo casete génico que contenía el gen blaVIM-2, codificante de una MBL de la familia VIM (Figura 2).


Figura 2.
Entornos genéticos de los genes blaVIM-2 (A) y blaCTX-M-2(B). Intl1: gen codificante de la integrasa; attI y attC: sitios de recombinación específica de la integrasa; blaVIM-2: gen codificante de la metalo-ß-lactamasa VIM-2; qacEΔ1: gen de resistencia a compuestos de amonio cuaternario; sul1: gen de resistencia a sulfamidas; ISCR1: gen codificante de una recombinasa hipotética; blaCTX-M-2: gen codificante de la BLEE CTX-M-2.

Estos resultados determinan la presencia del gen blaVIM-2, en forma de casete génico, en un integrón de clase 1. Esta localización en un elemento genético móvil, en un integrón de clase 1 que habitualmente se asocia a otros elementos genéticos móviles, como transposones y plásmidos conjugativos, hace que esta carbapenemasa tenga el potencial de diseminarse por transferencia horizontal a otras cepas de la especie, así como a otras especies patógenas de relevancia clínica, distantes filogenéticamente, como K. pneumoniae y E. coli. Cabe destacar que en dos de las cinco muestras de orina analizadas se aislaron a su vez K. pneumoniae y P. aeruginosa, lo que agrega un nicho ecológico en el cual puede ocurrir la transferencia.
En el mismo aislamiento se detectó la región ISCR1 mediante la obtención de un producto del tamaño esperado, de 500 pb, aproximadamente. La amplificación y posterior secuenciación de una región variable de 3000 pb, comprendida entre ISCR1 y 3´-SC2, reveló la presencia del gen blaCTX-M-2 (Figura 2).
Este es el primer informe en el Uruguay donde se detectan genes codificantes de una BLEE y de una MBL en P. aeruginosa.
Algunos estudios previos demostraron una alta frecuencia de detección del complejo ISCR1-blaCTX-M-2 asociado a integrones de clase 1 inusuales en aislamientos clínicos obtenidos de pacientes con infecciones urinarias intrahospitalarias locales de K. pneumoniae (13). La detección del gen blaCTX-M-2 en P. aeruginosa constituye una evidencia del probable intercambio de genes de resistencia localizados en integrones entre enterobacterias y P. aeruginosa, especie que probablemente constituya un reservorio subestimado de tales genes.
En el aislamiento U-004, además de la actividad de carbapenemasa no inhibida por EDTA, se obtuvieron ensayos de sinergia positivos con tazobactama-CAZ y con tazobactama-FEP, y una débil sinergia con tazobactama-IMP, lo que sugiere la producción de una serino-carbapenemasa de clase A. Se estudió la presencia de genes codificantes de carbapenemasas de la familia KPC por amplificación por PCR utilizando los oligonucelótidos KPCfw y KPCrv ya descritos, con las siguientes condiciones de amplificación: 94 °C 5 minutos, seguidos de 35 ciclos de 94 °C 30 segundos, 60 °C 30 segundos, 72 °C 1 minuto, y un período de extensión final a 72 °C durante 5 minutos, utilizando como control positivo un aislamiento clínico de K. pneumoniae productor de KPC-2. No se obtuvo un producto de amplificación y se descartó la presencia del gen blaKPC, por lo que la resistencia a carbapenems en esta cepa podría deberse a la producción de otro tipo de carbapenemasa de clase A.
En el aislamiento U-057 no se detectó actividad de carbapenemasa, tampoco se demostró sinergia con tazobactama y CAZ o FEP; sin embargo, se observó sinergia entre el ácido borónico y CAZ e IMP y presentó resistencia a TZP, lo que sugiere que la sensibilidad disminuida a betalactámicos podría deberse a mecanismos distintos de carbapenemasas o de BLEE adquiridas.
El aislamiento PC-009, sensible a los ß-talactámicos y solo con sensibilidad disminuida al ATM y al IMP, demostró sinergia en los ensayos con tazobactama y CAZ o FEP, circunstancia que sugiere la producción de una BLEE en un aislamiento sensible a CAZ, que deberá ser confirmada en estudios posteriores. Asimismo, el resto de los aislamientos (U-025, U-061 y H-029) presentaron sensibilidad a los ß-talactámicos y no demostraron sinergia entre tazobactama o ácido borónico y CAZ o FEP.
Se comprobó la presencia de un gen codificante de una MBL con expresión fenotípica de resistencia a carbapenems y del gen codificante de la BLEE CTXM- 2 en P. aeruginosa aislada de un urocultivo de un paciente con sonda vesical, internado en el área de cuidados intensivos. Es de destacar que, a pesar de ser un hallazgo ampliamente documentado en otras partes del mundo, esta es la primera comunicación de una actividad de carbapenemasa y, en particular, de una metalo-ß-lactamasa adquirida, en bacterias patógenas en el Uruguay.
Dada la ubicuidad de las metalo-ß-lactamasas del tipo IMP y VIM en casetes génicos asociados a integrones de clase 1, destacamos la utilidad de la búsqueda de estosúltimos como herramienta valiosa para su detección.
Asimismo, la detección del gen blaCTX-M-2 fue posibleúnicamente gracias al análisis de la segunda región variable asociada a un integrón de clase 1 inusual.

Agradecimientos: Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA) del Uruguay, Programa de Desarrollo Tecnológico (PDT) del Ministerio de Educación y Cultura, Uruguay. Personal del Servicio de Bacteriología, H C. FF.AA., Uruguay. A Analía Sanabria por su colaboración con la toma de fotografías.

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Recibido: 14/12/10
Aceptado: 26/4/11