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Revista argentina de microbiología

versão impressa ISSN 0325-7541

Rev. argent. microbiol. vol.44 no.3 Ciudad Autónoma de Buenos Aires jun./set. 2012

 

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Y ENFERMEDADES INFECCIOSAS

Evaluación inmunoenzimática del antígeno recombinante SAPA en perros infectados naturalmente por Trypanosoma cruzi

 

Rubén O. Cimino1,4*, Patricio Diosque2,3,4, Inés R. López Quiroga1,4, José F. Gil3,4, Julio R. Nasser1,4

1 Cátedra de Química Biológica, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de Salta;
2 Instituto de Patología Experimental, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Salta;
3 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas;
4 Instituto de Investigación de Enfermedades Tropicales, Universidad Nacional de Salta, Argentina.

*Correspondencia. E-mail: rcimino@unsa.edu.ar

 


RESUMEN

En este trabajo evaluamos el antígeno recombinante SAPA (Shed Acute Phase Antigen) para la detección de anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi en sueros de perros infectados naturalmente. La técnica utilizada fue el ELISA y los antígenos utilizados fueron un homogenato de parásitos de T. cruzi (ELISA-H) y el recombinante SAPA (ELISA-SAPA). Se analizaron 93 sueros de perros por ELISA-H y ELISA-SAPA, los que fueron agrupados de la siguiente manera: grupo 1 (G1), 11 sueros controles negativos de la ciudad de Salta; grupo 2 (G2), 11 sueros controles positivos, pertenecientes a perros infectados naturalmente con T. cruzi; y grupo 3 (G3), 71 sueros de perros pertenecientes a zona endémica de infección chagásica. La sensibilidad y la especificidad del ELISA-SAPA fueron del 100 %. El índice kappa entre ELISA-H y ELISA-SAPA fue de 0,85. Estos resultados confirman que es adecuado el uso del antígeno recombinante SAPA para el diagnóstico de la infección por T. cruzi en perros.

Palabras clave: Antígeno SAPA; Trypanosoma cruzi; Perros; ELISA

ABSTRACT

Immunoenzymatic evaluation of the recombinant SAPA protein of Trypanosoma cruzi in naturally infected dogs. We evaluated the recombinant antigen SAPA (Shed Acute Phase Antigen) for the detection of Trypanosoma cruzi antibodies in sera from naturally infected dogs. The technique used was ELISA and the antigens were a homogenate of parasite T. cruzi (ELISA-H) and the recombinant SAPA (ELISA-SAPA). We analyzed 93 sera from dogs by ELISA-H and ELISA-SAPA, which were grouped as follows: G1: 11 negative control sera from the city of Salta, G2: 11 positive control sera from dogs naturally infected with T. cruzi and G3: 71 samples of dogs belonging to a Chagas disease-endemic area. The sensitivity and specificity of ELISA-SAPA were 100 %. The kappa index between ELISA-H and ELISA-SAPA was 0,85. These results confirm the use of SAPA antigen in the diagnosis of infection with T. cruzi in dogs.

Key words: SAPA antigen; Trypanosoma cruzi; Dogs; ELISA


 

La enfermedad de Chagas es una parasitosis que afecta aproximadamente a 16-18 millones de personas en América Latina. Trypanosoma cruzi, agente causal de esta enfermedad, infecta a mamíferos como humanos, perros y gatos (5).

En ensayos de laboratorio y de campo se ha comprobado por xenodiagnóstico que la carga de parásitos en perros infectados por T. cruzi es persistente en el tiempo (11, 12). Si bien los niveles de IgG en perros infectados con distintos linajes de T. cruzi son elevados, no se observó una correlación entre la cepa infectante y el cuadro clínico o histopatológico (12).

La utilización de antígenos crudos u homogenatos de T. cruzi en el diagnóstico tiene la dificultad de presentar cruza antigénica con Leishmania spp. Los métodos serológicos usados comúnmente en el diagnóstico de la infección chagásica en perros son HAI, IFI y ELISA, las sensibilidades informadas son del 84 %, 95 % y 94 %, respectivamente (10). No existen muchos antecedentes en la evaluación de antígenos recombinantes para el diagnóstico de la infección por T. cruzi en perros.

La proteína TS-SAPA de T. cruzi se encuentra en la superficie de los tripomastigotes y es importante, ya que facilita la invasión del parásito a la célula hospedadora. En el extremo N-terminal presenta actividad trans-sialidasa-neuraminidasa, relacionada con la transferencia de ácido siálico a la superficie del parásito, lo que permite la invasión a la célula. En el extremo C-terminal se encuentra una región inmuno-dominante denominada SAPA (Shed Acute Phase Antigen), que contiene 12 repeticiones de aminoácidos en tándem. Este dominio repetitivo produce una fuerte respuesta humoral en los pacientes agudos y en casos de infección congénita en humanos (1, 14). La inmuno-genicidad y especificidad del antígeno SAPA para el diagnóstico de la infección chagásica fue demostrada en laboratorio (2, 13).

La estandarización de la técnica de ELISA para detectar anticuerpos anti-T. cruzi en perros infectados naturalmente es de suma importancia por su aplicabilidad en estudios epidemiológicos, debido a que los perros cumplen un papel importante en el ciclo de transmisión de T. cruzi en zonas endémicas (9). En el presente trabajo evaluamos la reactividad del antígeno recombinante GST-SAPA en sueros de perros infectados naturalmente con T. cruzi mediante la técnica de ELISA.

Se estudiaron perros de un área endémica de la enfermedad de Chagas en la provincia de Chaco (6). Se les realizó el xenodiagnóstico a los animales, el cual consistió en la aplicación de 3 frascos con 10 ninfas del 3er al 5to estadio de Triatoma infestans, cada uno por un período de 15 minutos. Los insectos fueron conservados en el insectario a temperatura de 28 °C y en oscuridad. La lectura de los xenodiag-nósticos se realizó a los 30 y 60 días posalimentación. Las heces fueron mezcladas con buffer fosfato salino (PBS) 1X (pH 7,2) y observadas durante 15 minutos al microscopio, con un aumento de 400X (6).

Se preparó un homogenato de T. cruzi cepaTulahuén partiendo de cultivos axénicos. Los parásitos se concentraron por centrifugación y se lisaron con buffer de lisis [Tris base 50 mM pH 8, EDTA 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, Tritón 100X 0,1 %]. Para la obtención de la mezcla se le agregó sacarosa (10 % concentración final) y luego de centrifugar 60 min a 20 000 g y 4 °C, se recuperó el sobrenadante. Se cuantificó mediante el método de Bradford. Se conservó a -20 °C para su posterior uso.

El antígeno recombinante GST-SAPA fue producido respetando el protocolo descrito previamente (8). Para evaluar su producción se realizó una electroforesis SDS-PAGE (12 %).

En la técnica de ELISA se utilizó un homogenato de parásitos (ELISA-H) como antígeno de placa. Se plaquearon 2 (µg/pocillo y se dejó toda la noche a 4 °C. La dilución de suero fue de 1/500 y la del anticuerpo secundario biotinilado de 1/2500. La dilución de avidina-peroxidasa fue de 1/16 000. El cromógeno utilizado fue o-fenilendiamina (OPD) disuelta en buffer citrato (pH 5,3). La reacción se detuvo usando H2SO4 2 M y la lectura de las densidades ópticas (DO) fue a 490 nm (6).

El ELISA-SAPA se realizó plaqueando 0,5 mg/pocillo de antígeno recombinante GST-SAPA disuelto en buffer carbonato (pH 9,6); esto se dejó toda la noche a 4 °C. Se bloqueó con PBS-leche descremada al 5 %. La dilución de suero fue de 1/500 en PBS-leche 1 % y se dejó reaccionar 1 h a temperatura ambiente. Todas las muestras fueron analizadas por duplicado. Se utilizó un anticuerpo secundario biotinilado anti-dogs IgG totales en una dilución 1/2500, disuelto en PBS y protegido con suero normal de caballo (concentración final 1 %). Las placas se dejaron reposar 30 min a temperatura ambiente. Se agregó conjugado avidina-peroxidasa, dilución 1/16 000 en PBS-Tween al 0,05 %, las placas se incubaron durante 30 minutos. Para visualizar la reacción se utilizó OPD en presencia de H2O2 al 30 % disuelto en buffer citrato (pH 5,3). Al cabo de 30 minutos en la oscuridad se detuvo la reacción con ácido sulfúrico 2M. La lectura de las DO se realizó a 490 nm en lector de ELISA. Finalizada cada reacción se lavó 3 veces cada placa con PBSTween al 0,1 %. Los reactivos utilizados fueron de Sigma, St Louis, MO, EE. UU.

El ELISA-GST se normatizó para demostrar si la proteína de fusión glutatión s-transferasa (GST) podía reaccionar inespecíficamente con anticuerpos presentes en los sueros controles. Para esto se plaqueó una alícuota de 0,5µg/pocillo disuelta en buffer carbonato (pH 9,6); se dejó toda la noche a 4 °C. Las condiciones de trabajo fueron idénticas a las del ELISA-SAPA.

Se estudiaron 93 muestras de sueros de perros que fueron analizados por ELISA-H y ELISA-SAPA. Para la evaluación del antígeno recombinante SAPA se formaron los siguientes grupos (G): G1, 11 sueros controles negativos (CN), correspondientes a perros residentes en la ciudad de Salta, área no endémica para T. cruzi, no reactivo por ELISA-H y ELISA GST; G2, 11 sueros controles positivos (CP), correspondiente a una zona con transmisión activa de T. cruzi, todos fueron positivos por xenodiagnóstico, ELISA-H y no reactivos para ELISA-GST; y G3, 71 muestras de sueros correspondientes a una zona de transmisión activa de T. cruzi.

Análisis de datos: El cut-off fue determinado como la media de las DO de los sueros CN más 3 veces el valor de la desviación estándar (DE). Se calculó la DO relativa dividiendo la DO de cada muestra por el cut-off calculado. Se determinó el índice de concordancia kappa y los valores de sensibilidad y especificidad. Dado que los resultados de los sueros frente a los diferentes antígenos no mostraron homogeneidad de varianzas mediante la prueba F, las medias de DO relativas de los distintos grupos de sueros fueron comparadas utilizando el método de construcción de intervalos de confianza bootstrap para un nivel de significancia del 95 %, con el software Infostat profesional v1.0 (http://www.infostat.com.ar/).

En la Figura 1 se pueden observar los valores relativos de DO para las tres pruebas de ELISA. La sensibilidad (11/11) y especificidad (0/11) del antígeno SAPA fue del 100 %. Ninguno de los sueros controles del G1 y el G2 fueron reactivos para GST y sus valores promedios de DO no mostraron diferencias estadísticamente significativas (p > 0,05) (Tabla 1). Se observaron diferencias significativas cuando se compararon los valores promedio de DO del G2 obtenidos frente a ELISA-SAPA y ELISA-H (p < 0,05) (Tabla 1).


Figura 1. Valores de densidad óptica relativa para las tres pruebas de ELISA. La línea de puntos indica el cut-off. G1: sueros controles negativos; G2: sueros controles positivos

Tabla 1. Análisis de los diferentes grupos de sueros por el método no paramétrico de bootstrap

En la Figura 2 se muestran los valores relativos de DO determinados por ELISA-H y ELISA-SAPA para el G3. A partir de este grupo de sueros se determinó el grado de concordancia entre ELISA-H y ELISA-SAPA. La concordancia bruta observada entre ELISA-H y ELISA-SAPA fue de 0,94, mientras que el índice kappa fue del 0,85 [IC 95 %: 0,72-0,99] (p< 0,05). Los valores promedios de DO de los sueros que resultaron reactivos para ELISA-SAPA y ELISA-H del G3 fueron 4,54 (IC 95 %: 3,21-5,80) y 10,75 (IC 95 %: 7,96-12,93), respectivamente, con diferencias estadísticamente significativas entre ellos (p<0,05). Por su parte, los promedios de DO de los sueros que resultaron no reactivos en el G3 fueron 0,44 (IC 95 %: 0,38-0,51) para ELISA-SAPA y 0,31 (IC 95 %: 0,17- 0,45) para ELISA-H. Estos resultados de reactividad del G3 muestran el mismo patrón que los observados en el G1 y G2. Cuatro sueros seronegativos por ELISA-H fueron reactivos por ELISA-SAPA.


Figura 2. Valores de densidad óptica relativa de sueros del G3 para las pruebas de ELISA-H y ELISA-SAPA. La línea de puntos indica el cut-off

El antígeno recombinante SAPA inicialmente fue propuesto como marcador de fase aguda y congénita en humanos (1, 14). En estudios recientes se observó reactividad en sueros de pacientes chagásicos en fase indeterminada o crónica de la enfermedad (8).

Los perros infectados por T. cruzi, a diferencia de los humanos infectados, se caracterizan por presentar elevadas parasitemias a lo largo de su vida, siendo el reservorio doméstico más importante. Por lo tanto, la presencia de perros infectados en el domicilio representa un factor de riesgo en la transmisión de T. cruzi al humano (9).

La especificidad del antígeno SAPA frente a sueros de pacientes con leishmaniosis del norte de la Argentina fue demostrada previamente (8).

La parasitemia persistente y los procesos de reinfección recurrente que estarían sufriendo estos animales justifican el uso del antígeno SAPA, ya que se estaría estimulando la producción continua de anticuerpos anti-SAPA en los perros. Esto explicaría la alta reactividad observada con el antígeno SAPA (100 %) en este trabajo. Además, los cuatro perros del G3 que dieron resultados reactivos para ELISA-SAPA y negativos para ELISA-H pueden haber estado padeciendo una infección aguda primaria al momento de la toma de la muestra, hecho que explicaría la predominancia de anticuerpos anti-SAPA y no de anticuerpos totales anti-T.cruzi.

Por otro lado y dado que los sueros evaluados frente a GST mostraron valores medios de DO similares a los de los controles negativos (p > 0,05), esta proteína de fusión no afectaría la especificidad del recombinante SAPA. Esto ya fue observado anteriormente (4).

Son escasos los antecedentes de serología en perros; el método inmunocromatográfico Dipstick test (Trypanosoma cruzi Detec-Canine, Inbios, Seattle, WA) demostró una sensibilidad y especificidad del 96 % y 94 %, respectivamente (3). Este test está basado en la propiedad que tiene un antígeno recombinante con múltiples epitopes ITC-6 y ITC8.2 derivados de distintos antígenos de T. cruzi que incluyen al péptido 2, TcD, TcF, TcLo y SAPA. Luego, la aplicación del ensayo de la trans-sialidasa (TIA) en perros mostró una co-positividad con el xenodiagnóstico del 97 %, mientras que para serología convencional fue del 91 % (15). También se informó una sensibilidad del 44,4 % y 100 % de especificidad para el antígeno Ag1 de T. cruzi, evaluado mediante la técnica de ELISA (7).

La técnica inmunoenzimática de ELISA es una metodología económica y factible, que puede utilizarse como una herramienta en los estudios epidemiológicos de la infección por T. cruzi en perros infectados naturalmente.

Agradecimiento: los autores agradecen al personal técnico del Instituto de Patología Experimental. Al Sr. Carlos Meza por su colaboración en el trabajo de campo. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación de la Universidad Nacional de Salta (Proyecto N.° 1923 y N.° 1720) y por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Argentina.

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Recibido: 3/4/2012- Aceptado: 25/6/2012