SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.45 número1Nueva esterasa tolerante a los solventes orgánicos aislada por metagenómica: ideas sobre la clasificación de las esterasas/lipasasAsociación entre las mutaciones en embB y la resistencia a etambutol en aislamientos de Mycobacterium tuberculosis de Cuba y República Dominicana: patrones y problemas reproducibles índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Servicios Personalizados

Revista

Articulo

Indicadores

  • No hay articulos citadosCitado por SciELO

Links relacionados

Compartir


Revista argentina de microbiología

versión impresa ISSN 0325-7541

Rev. argent. microbiol. vol.45 no.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires mar. 2013

 

MICROBIOLOGÍA BÁSICA

Respuesta humoral y consecuencias reproductivas en ovejas desafiadas con Brucella ovis al final de la gestación

Fernando A. Paolicchi*1,5, Marta Núñez1, María A. Fiorentino1, Rosana C. Malena1, Marcos Trangoni2, Silvio Cravero2, Silvia M. Estein3,4

1Laboratorio de Bacteriología, Departamento de Producción Animal, INTA Balcarce;
2 Instituto de Biotecnología, CICVyA, INTA Castelar;
3
Laboratorio de Inmunología, Depto. SAMP, Centro de Investigación Veterinarias de Tandil (CIVETAN)-CONICET, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires, Tandil;
4
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET);
5
Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Mar del Plata, Balcarce, Argentina.

*Correspondencia. E-mail: fpaolicchi@balcarce.inta.gov.ar


RESUMEN

La brucelosis ovina por Brucella ovis es una enfermedad de prevalencia alta en Argentina. Para evaluar la patogenicidad de B. ovis y la respuesta serológica durante el último mes de gestación, 6 ovejas se distribuyeron en dos grupos: G1, ovejas preñadas, n = 4 y G2, ovejas no preñadas, n = 2. Tres ovejas del G1 (15 días preparto) y una del G2 fueron inoculadas con B. ovis. Se analizaron muestras de suero mediante diferentes pruebas serológicas. Se realizó aislamiento y PCR a partir de mucus cérvico-vaginal (mcv), placenta y leche. En las muestras de placenta se realizó histopatología. Las hembras del G1 parieron corderos vivos; se detectaron anticuerpos en las ovejas desafiadas del G1 a partir de los 5 días posinoculación. El mcv de las ovejas desafiadas resultó negativo al aislamiento en ambos grupos. Las muestras de leche del G1 fueron positivas por cultivo y PCR a B. ovis. La técnica de PCR resultó positiva en las placentas de las ovejas desafiadas del G1. La histopatología reveló una placentitis necrótica supurativa en una de las ovejas desafiadas. El desafío con B. ovis preparto resultó en la invasión de la placenta y de la glándula mamaria, con la consecuente excreción de la bacteria por leche. La infección con B. ovis indujo una respuesta humoral temprana en las ovejas. La colonización de la placenta por B. ovis y la excreción de la bacteria por la leche sugieren un potencial riesgo de infección activa para los corderos y la posibilidad de que estos se comporten como portadores latentes de la infección.

Palabras clave: Brucella ovis; Gestación; Leche; Placenta; Pruebas serológicas; PCR.

ABSTRACT

Immune response and reproductive consequences in experimentally infected ewes with Brucella ovis during late pregnancy. Ovine brucellosis by Brucella ovis is a highly prevalent disease in Argentina. This study aimed to evaluate the pathogenicity of B. ovis and the serological response in ewes during late pregnancy and in their offspring. Six adult ewes were distributed in two groupsGI (pregnant females, n = 4) and G2 (nonpregnant females, n = 2). Three pregnant ewes at 15 days prepartum and one nonpregnant eve were inoculated with B. ovis. Sera of sheep and their offspring were analyzed by different serological tests. Samples of cervicovaginal mucus, placenta and milk were studied by bacteriology. A Brucella genus-specific PCR assay was carried out in placenta and milk samples. Placenta samples were hystopathologically processed. G1 females gave birth to live lambs, but one died hours postpartum. Serological techniques employed detected antibodies in serum of inoculated pregnant animal 5 days postchallenge. Sera of female controls G1 and G2 remained negative throughout the study. Cervicovaginal mucus of infected ewes in G1 and G2 yielded negative results to bacteriology, but B. ovis was isolated from milk. The PCR assay was positive for the placenta and milk from inoculated pregnant ewes. Histopathology revealed necrotic suppurative placentitis in one placenta. However, although results demonstrated that B. ovis can invade the placenta and mammary gland, this bacterium did not cause abortion when it was inoculated intravenously at 15 days prepartum. B. ovis infection induced an early humoral response in pregnant ewes, but their lambs remained seronegative, indicating that there was no transfer of antibodies in infancy. Placenta colonization and milk excretion of B. ovis involves a potential source of infection for lambs, which could play a role as latent carriers of infection.

Key words: Brucella ovis; Gestation; Placenta; Milk; Serological tests; PCR.


INTRODUCCIÓN

La brucelosis ovina causada por Brucella ovis es una enfermedad infectocontagiosa que afecta al ganado ovino y que se caracteriza por provocar epididimitis e infertilidad en el carnero (3). La transmisión de la infección se produce por la vía venérea durante la estación reproductiva, o entre machos cuando existe sodomía u olfateo prepucial (5). Además, se ha sugerido la vía congènita como una ruta probable de infección; sin embargo, la presencia de anticuerpos en el calostro contribuiría a la eliminación de B. ovis en el cordero (6, 7, 10). En la oveja preñada, la infección natural puede provocar mortalidad embrionaria con infertilidad transitoria, placentitis, aborto tardío (9, 12, 17) o el nacimiento de corderos débiles, que mueren a las pocas horas o días de nacidos (14). Esta enfermedad está ampliamente distribuida a nivel mundial y ocasiona importantes pérdidas económicas en la producción ovina debido a la disminución en los porcentajes de preñez, parición y corderos vivos al momento del destete en las majadas infectadas (11).

En la oveja preñada, el diagnóstico bacteriológico se apoya en el aislamiento de B. ovis a partir de muestras de mucus cérvico-vaginal, placenta, leche y/o tejidos de los fetos abortados (1). Por otro lado, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una prueba sensible que permite detectar en fluidos y tejidos fragmentos del ADN de distintas especies de Brucella (2, 4, 25).

El diagnóstico indirecto se basa en el empleo de pruebas serológicas que detectan anticuerpos específicos, algunas de las cuales son la fijación de complemento (FC) (3), la inmunodifusión en gel de agarosa con extracto salino de B. ovis (IDGA-HS) (19) y el enzimoinmunoensayo indirecto (ELISAi) con antígeno lipopolisacárido rugoso (LPS-R) (ELISAi LPS-R B.ovis) (24). En la actualidad existen, además, otras pruebas serológicas que emplean como antígeno a B. canis, que es la otra especie rugosa del género Brucella y que comparte epitopes con B. ovis. Estas pruebas incluyen la aglutinación rápida en placa (Rapid Slide Agglutination Test o RSAT) (8) y la técnica de ELISAi contra B. canis (ELISAi B. canis) (15).

El objetivo del presente trabajo fue evaluar en ovejas preñadas e infectadas al final de la gestación: a) la patogenicidad de B. ovis, b) la colonización bacteriana de la placenta y de la glándula mamaria, y c) la respuesta serológica en estas hembras y en su crías.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales

Se emplearon 6 ovejas adultas de la raza Romney Marsh pertenecientes a un establecimiento libre de brucelosis ubicado en la provincia de Buenos Aires (Argentina) y dedicado a la producción ovina. Al inicio del ensayo, todas las ovejas presentaron un estado sanitario óptimo y resultaron seronegativas al ELISAi LPS-R B.ovis. Las ovejas fueron alojadas en corrales de la EEA INTA Balcarce, con alimentación ad libitum compuesta por una ración balanceada y pastura natural. Los animales se identificaron con números mediante aretes plásticos y se distribuyeron al azar en los siguientes grupos experimentales:

Grupo 1 (G1): cuatro ovejas (N.° 1, 2, 3 y 4) fueron sincronizadas mediante inducción con 60 mg de medroxiprogesterona impregnada en esponja. A los 14 días se extrajo la esponja y se inyectaron 200 UI de hormona PMSG vía parenteral. Cuarenta y ocho horas más tarde fueron inseminadas con 300 ul de semen fresco (dosis total 4 x 108 espermatozoides) extraído de un carnero Romney Marsh de probada fertilidad y libre de brucelosis.

- Grupo 2 (G2): dos ovejas (N.° 5 y 6) sin inseminar y no preñadas.

Diagnóstico de preñez

Se realizó ecografía transvaginal a las ovejas del G1 los días 38, 53 y 68 posinseminación artificial con el fin de monitorear el estado de preñez y registrar pérdidas embrionarias durante el período predesafío.

Preparación del inóculo

Se utilizó la cepa de referencia B. ovis PA76250 (INRA, Nouzilly, Francia) conservada a -80 °C en el cepario de la Facultad de Ciencias Veterinarias, U.N.C.P.B.A. En el momento de su uso fue recuperada mediante siembra en agar tripteína de soja adicionado con 0,5 % de extracto de levadura (TSAYE) y 5 % de suero equino en atmósfera con 10 % de C02. Para incrementar su virulencia, esta cepa fue inoculada en ratones BALB/c, y recuperada a partir del bazo en el mismo medio de cultivo a los 21 días posinoculación. Se preparó el inóculo para el desafío de las ovejas y la concentración final determinada por recuento retrospectivo fue de 6,2 x 106 UFC/ml (18).

Desafío con Brucella ovis

Tres ovejas del G1 (N.° 1, 2 y 3) fueron desafiadas a los 135 días de gestación mediante venopunción yugular con 1 ml del inóculo; una de las ovejas del G2 (N.° 6) fue desafiada del mismo modo, en la misma fecha. Las dos ovejas restantes de cada grupo (N.° 4 y N.° 5) no fueron inoculadas y permanecieron como controles sin desafiar. A partir del momento del desafío y una vez por semana hasta el momento del parto de las ovejas preñadas, se realizaron los registros térmicos vía transrectal y la toma de muestras de sangre por punción yugular para la obtención de suero para análisis serológico. En el momento de las pariciones se registraron los siguientes datos: viabilidad de las crías y retención de placenta. Los corderos fueron pesados el día del nacimiento; se verificó su condición sanitaria clínica y se identificaron con aretes plásticos numerados.

Estudios bacteriológicos y moleculares

En las ovejas del G1 se tomaron muestras de placenta en el momento del parto y también de mucus cérvico-vaginal y de leche a los 8, 15, 30, 45 y 60 días posparto. Las muestras obtenidas se colocaron en recipientes estériles y fueron procesadas para su cultivo en placas con agar sangre Columbia (Oxoid Ltd, Wad Road, Basingstoke, Inglaterra) adicionado con 7% de sangre bovina desfibrinada estéril y agar Skirrow con antibióticos (23). Se incubó a 37 °C en atmósfera con 10 % de C02 y observó diariamente durante 14 días, como ha sido descrito anteriormente (20). Además, con el fin de descartar otros patógenos del área genital en ovinos, las muestras se cultivaron en agar Mac Conkey (Oxoid Ltd.) en condiciones de aerobiosis durante 24 h. Las colonias fueron identificadas y tipificadas por su actividad enzimática frente a urea, oxidasa, producción de SH2, requerimientos de C02 y crecimiento en distintas concentraciones de tionina o fucsina, según Alton (1).

Las muestras de leche y de placenta de las ovejas del G1 fueron procesadas mediante PCR. Para el análisis en leche se utilizó el siguiente protocolo: 1 ml de leche cruda fue adicionado con tampón de lisis 100 ul de SDS 10 % y 20 ul de proteinasa K (100 ug/ml) e incubado durante 40 min a 65 °C. Posteriormente se realizaron dos extracciones con fenol/cloroformo/isoamílico (24:24:1). Luego de centrifugar 10 min a 12 000 r.p.m. se efectuó una segunda extracción con cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Una vez centrifugado se le transfirió el sobrenadante, a éste se agregaron 100 ul de NaCl 5 M, 0,6 vol de isopropanol y se incubó a -20 °C toda la noche. Tras la centrifugación se descartó el sobrenadante y se efectuaron dos lavados con etanol frío al 70 %. Se centrifugó durante 10 seg y se eliminó el exceso de alcohol a 65 °C, 5 min. El material resultante se resuspendió en 50 ul de Tris-HCl, pH 8, 10 mM y se conservó hasta la realización de la PCR. Para el análisis por PCR de placenta, a 100 mg de placenta se le agregaron 880 ul de bufferTE (Tris 50 mM / EDTA 50 mM, pH 8), 100 ul de SDS, 10 % y 20 ul de proteinasa K (100 ug/ml), esta mezcla se incubó 4 h a 65 °C. El procesamiento posterior fue idéntico al descrito para la leche.

Para el desarrollo de la PCR se utilizaron los cebadores B4/B5 que reconocen una región interna de la secuencia del gen BCSP31 de 223 pb, que codifica para una proteína periplásmica de 31 kDa que se encuentra conservada en todas las especies de Brucella (2). La PCR fue acondicionada para un volumen final de 25 ul que contenía 1,25 U de Taq polimerasa (Promega, EE.UU.), buffer ADN polimerasa 1x (10 mM Tris-HCl pH 8,5 y 1,5 mM de MgCl2), 200 uM de cada dNTP y 25 ul de H20. La reacción fue llevada a cabo en un termociclador MyCicler Thermal Cycler (Bio-Rad, California, EE.UU.) con una desnaturalización inicial de 95 °C durante 5 min, 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 1 min, hibridación a 60 °C durante 1 min y extensión a 72 °C durante 1 min. La extensión final fue de 10 min a 72 °C, y mantenimiento a 15 °C. La electroforesis se realizó en un gel de agarosa al 1,5 % en buffer TAE (10 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 8) con 0,5 ug/ml de bromuro de etidio. Como control positivo se empleó ADN de la cepa B. ovis RE0 198 y como control negativo la mezcla sin muestra El gel se documentó utilizando un equipo Fotodyne (Wisconsin, EE.UU) con el programa CollageTM worksheet.

Estudios serológicos

Se obtuvieron muestras de sangre de las ovejas inmediatamente antes del desafío y una vez por semana hasta los 61 días posinoculación. Los corderos fueron sangrados con la misma frecuencia desde el nacimiento hasta los 73 días de vida, tiempo en que finalizó el ensayo. Los sueros de las ovejas fueron analizados por ELISAi LPS-R para B. ovis (24) y por IDGA-HS con extracto salino de B. ovis (19). Además, se realizaron las pruebas de RSAT y ELISAi con el antígeno HS de B. canis, utilizando la metodología ya descrita (8, 15). Los sueros de los corderos fueron analizados solo por ELISAi LPS-R para B. ovis.

Estudios histopatológicos

Las muestras de placenta fueron fijadas en formol tamponado al 10 %. Se realizaron cortes de5um y se colorearon con hematoxilina y eosina según técnicas de rutina para su análisis microscópico.

RESULTADOS

Preñez y parición

Todas las ovejas del G1 resultaron con preñez confirmada mediante ecografía a los 51 días posinseminación y parieron corderos vivos con un peso promedio de 4,8 kg + 0,5 kg, el tiempo de gestación promedio fue de 158 días + 2 días. La oveja N.° 1, perteneciente al grupo desafiado del G1, parió un cordero de peso normal que murió a las pocas horas de nacido. Este fue hallado 24 h después con registros de depredación salvaje y en la necropsia no se observaron lesiones macroscópicas compatibles con brucelosis. El cultivo bacteriológico de los pulmones y líquido del abomaso dio resultado negativo y no se pudieron obtener muestras de órganos adecuadas para procesar el material por PCR. Durante el periodo evaluado no se registraron alteraciones en la temperatura rectal de las ovejas.

Bacteriología y PCR

Todos los cultivos de mucus cérvico-vaginal y placenta resultaron negativos al aislamiento de B. ovis, sin observarse el desarrollo de otros patógenos de importancia reproductiva en ovinos.

Se aisló B. ovis de las muestras de leche de dos ovejas desafiadas del G1 (N.° 1 y 3) a partir de los 30 días posparto (Tabla 1). Por otro lado, las muestras de leche de las ovejas desafiadas del G1 (N.° 1, 2 y 3) resultaron positivas por PCR a partir del día 8 posparto (Figura 2), esto es, 22 días antes de obtener resultado positivo en el cultivo bacteriológico de leche. La prueba de PCR aplicada a las muestras de placenta de las ovejas del G1 dio resultado positivo en 2 de las 3 ovejas inoculadas (N.° 1 y 3) (Tabla 1). La oveja N.° 4 del G1 (control no desafiada) resultó negativa a la bacteriología y a la PCR en las muestras obtenidas posparto.


Figura 1. Placentitis supurativa (oveja N.° 3). Las flechas indican el área con mayor concentración de polimorfonucleares neutrófilos. Hematoxilina y eosina, aumento 100X.

Tabla 1. Resultados del cultivo bacteriológico y de la PCR para identificación de B. ovis en muestras de leche de las ovejas preñadas/desafiadas y de la oveja control no desafiada


Figura 2. Resultados del análisis por PCR de leche y placenta de las ovejas del grupo G1. (-) Control negativo de reacción (mezcla sin muestra). Líneas 1-3: leche de oveja N.° 4 (control no desafiada); línea 4: placenta de oveja N.° 1; líneas 5-7: leche de oveja N.° 1; línea 8: placenta de oveja N.° 2; líneas 9-11: leche de oveja N.° 2; línea 12: placenta de oveja N.° 3; líneas 13-16: leche de oveja N.° 3; (+) control positivo de ADN de B. ovis REO 198. Las muestras de leche corresponden a los diferentes tiempos de muestreo posparto.

Serología

A partir del día 5 posdesafío se detectaron anticuerpos en una de las ovejas del G1 (N.° 1) mediante la prueba de RSAT. Dos de la ovejas desafiadas del G1 (N.° 1 y 3) resultaron positivas a la prueba de IDGA-HS a partir del día 12 posdesafío. La otra oveja inoculada de este grupo (N.° 2) resultó positiva a las pruebas de RSAT e IDGA-HS a partir de los días 33 y 40 posdesafío, respectivamente. Las tres ovejas desafiadas del G1 permanecieron positivas hasta la finalización del ensayo (Tabla 2). Las ovejas del G2 (no preñadas), tanto la control como la desafiada (N.° 5 y 6, respectivamente), resultaron siempre negativas a las pruebas de RSAT e IDGA-HS. Las ovejas N.° 1, 2 y 3 del G1 resultaron positivas al ELISAi LPS-R para B. ovis a partir de los días 12, 54 y 26 posdesafío, respectivamente. Por otro lado, en la oveja desafiada del G2 (N.° 6), este ELISA detectó títulos positivos con dos picos en los días 33 y 54 posdesafío (Figura 3). Las ovejas N.° 1, 2 y 3 reaccionaron en el ELISAi para B. canis a partir de los días 19, 26 y 40 posdesafío, respectivamente. La oveja control del G1 (N.° 4) y las dos ovejas del G2 (N.° 5 y 6) resultaron negativas a esta técnica en el periodo de estudio (Figura 4). Los sueros de los corderos resultaron negativos en el ELISAi para B. ovis.


Figura 3. Evolución de los niveles de anticuerpos séricos de las ovejas de los grupos G1 y G2 medidos mediante ELISA -anti LPS-R B. ovis. Valores de referencia: negativo: DO 0-0,094; sospechoso: DO 0,095-0,119; positivo: DO> 0,120.

Tabla 2. Resultados serológicos de las pruebas de IDGA-HS y RSAT en ovejas de los grupos G1 y G2


Figura 4. Evolución de los niveles de anticuerpos séricos de las ovejas de los grupos G1 y G2 medidos mediante ELISA-anti B. canis. Valor de referencia: positivo %> 39.

Histopatología

En la oveja N.° 3 del G1 se observó una placentitis necrótica supurativa epitelial y perivasculitis con presencia de polimorfonucleares neutrófilos (Figura 1). En el resto de las ovejas del G1 no se observaron lesiones histológicas placentarias.

DISCUSIÓN

En el presente trabajo fueron evaluadas las consecuencias reproductivas y la respuesta inmunitaria humoral en ovejas con preñez avanzada de 135 días, tras la inoculación con B. ovis. El experimento fue diseñado con el objetivo de estudiar las probables consecuencias epidemiológicas que conllevaría la infección de ovejas sanas con B. ovis durante la preñez avanzada, expuestas a la infección por cohabitar el predio con abortos de ovejas infectadas en la majada. En nuestro trabajo el desafío con la cepa patógena de B. ovis PA76250 en la preñez avanzada no provocó abortos ni alteraciones en el período de gestación normal, y la cepa de desafío no fue recuperada por cultivo bacteriológico de las placentas ni del mucus cérvico-vaginal de las ovejas desafiadas. Sin embargo, 2 de las 3 muestras de placentas del grupo desafiado (G1) resultaron positivas por la técnica de PCR y, además, una de estas muestras placentarias presentó lesiones histopatológicas compatibles con una placentitis necrótica por B. ovis.

La dosis de desafío de B. ovis y la vía de inoculación empleadas en este experimento coinciden con lo informado por Ris (22). Otros autores han empleado dosis superiores (108 UFC, 109 UFC) y otras vías de infección (intraconjuntival, intravaginal e intrauterina), se obtuvieron en todos los casos entre 63 y 75 % de infección placentaria (10, 12, 17). Nuestros resultados sugieren que el tiempo de gestación en el cual se realizó el desafío y la concentración de bacterias utilizada para el desafío fueron adecuados para que B. ovis colonizara la placenta, pero no suficientes para provocar abortos o el nacimiento de corderos infectados. Asimismo, en otros ensayos en los que se efectuó la inoculación experimental en etapas tempranas o avanzadas de la gestación, los resultados revelan que si bien B. ovis genera una endometritis grave, la bacteria posee una reducida capacidad para inducir abortos en ovejas o la muerte perinatal de los corderos (10, 13).

En referencia a la colonización por B. ovis en las ovejas desafiadas del G1, el resultado positivo a la PCR en leche a partir de los 8 días posparto indicaría que, a pesar del estado avanzado de la gestación cuando se realizó el desafío, B. ovis se localizó en la glándula mamaria, lo que dio como resultado la excreción permanente de B. ovis en este fluido. Aunque en nuestro trabajo no se comprobó la infección de los corderos durante el periodo estudiado, trabajos previos han demostrado que la infección mamaria y de los linfonódulos adyacentes favorece la infección de los corderos durante la lactancia, el desarrollo de infecciones latentes y la persistencia de la infección en la majada, sin la intervención directa por vía venérea de los carneros (10, 16).

La persistencia de los títulos serológicos y la infección en ovejas enfermas con B. ovis por más de un año indican que la infección persiste de una estación reproductiva a la siguiente, lo que ocasiona la aparición de animales infectados por brucelosis (10, 21). En nuestro trabajo, la respuesta serológica específica contra B. ovis detectada en todas las ovejas preñadas e infectadas en las primeras semanas posdesafío demuestra la utilidad de diferentes pruebas serológicas que incluyeron antígenos homólogos y heterólogos (B. canis). En efecto, tanto las técnicas de ELISAi, reconocidas por su mayor sensibilidad y especificidad, como las pruebas de IDGA-HS y RSAT permitieron identificar en animales preñados la infección con B. ovis. En contraste, en la oveja no preñada e infectada se observó una respuesta serológica intermitente solo mediante la prueba de ELISAi para B. ovis. Si bien los datos corresponden a un animal, no hemos encontrado en la bibliografía consultada información sobre la respuesta serológica en ovejas infectadas no preñadas.

Brucella ovis inoculada en ovejas al final de la gestación coloniza la placenta y la glándula mamaria y estimula la producción de anticuerpos específicos detectables en el suero en las primeras semanas posinfección. Por lo tanto, el diagnóstico serológico aplicado en este tipo de animales gestantes resulta útil para identificar las ovejas positivas antes de que se produzca el aborto o el nacimiento de los corderos y la consiguiente eliminación de material infeccioso dentro de la majada.

El empleo de la técnica de PCR aplicada a muestras de leche de ovejas constituye un método diagnóstico alternativo o complementario al cultivo bacteriológico, ya que es una prueba rápida y sensible que permite detectar fragmentos específicos de ADN prescindiendo de la viabilidad de la bacteria y aun en presencia de otros microorganismos contaminantes (2). A su vez, los resultados obtenidos con la aplicación de la PCR en la leche materna permitieron la detección precoz de la infección en relación con la bacteriología. Si bien no se pudieron realizar estudios por PCR en los órganos del cordero muerto, el uso de esta técnica con el material obtenido de abortos permitiría aumentar la probabilidad de obtener resultados positivos a la infección por Brucella.

En conclusión, la correcta identificación en cualquier época del año de los animales posiblemente infectados con B. ovis permitiría mejorar el estatus sanitario de las explotaciones ovinas con brucelosis y contribuiría a reducir el riesgo de reinfección de las ovejas en estas majadas infectadas. El uso complementario de varias pruebas de diagnóstico serológico, bacteriológico y de biología molecular aplicadas a las muestras de leche y/o de placenta de las ovejas que abortaron aumentaría el espectro de posibilidades de identificación temprana de B. ovis.

Agradecimientos: a los Dres. Nidia Lucero y Gustavo López (INEI-ANLIS Dr. "Carlos G. Malbrán", Ciudad Autónoma de Buenos Aires) por la asistencia en la realización de las pruebas serológicas de RSAT y ELISA indirecto B. canis.

REFERENCIAS

1. Alton GG, Angus RM, Jones LM, Verger JM. Brucella ovis. In: INRA, editor. Laboratory techniques for the brucellosis laboratory, 1st edition. Paris, 1988, p. 155-85.         [ Links ]

2. Baily G, Krahn J, Drasar B, Stoker N. Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplification. J Trop Med Hyg 1992; 95: 271-5.         [ Links ]

3. Blasco J, Brucelosis ovina. Ovis 1990; 8: 1-69.         [ Links ]

4. Bricker B, Halling S. Differentiation of Brucella abortus bv 1, 2, and 4, Brucella melitensis, Brucella ovis, Brucella suis bv 1 by PCR. J Clin Microbiol 1994; 32: 2660-6.         [ Links ]

5. Buddle M. Observation on the trasmission of Brucella infection in sheep. N Z Vet J 1955; 3: 10-9.         [ Links ]

6. Bulgin MS. Epididymitis in rams and lambs. Vet Clin North Am Food Anim Pract 1990; 6: 683-90.         [ Links ]

7. Burgess G. Ovine contagious epididymitis: a review. Vet Microbiol 1982; 7: 551-75.         [ Links ]

8. Carmichael L, Joubert J. A rapid slide agglutination test for the serodiagnosis of Brucella canis infection that employs a variant (M) organism as antigen. Cornell Vet 1987; 77: 3-12.         [ Links ]

9. Collier J, Molello J. Comparative distribution of Brucella abortus, Brucella melitensis and Brucella ovis in experimentally infected pregnant sheep. Am J Vet Res 1964; 107: 930-4.         [ Links ]

10. Grilló MJ, Marín CM, Barberán M, Blasco JM. Experimental Brucella ovis infection in pregnant ewes. Vet Rec 1999; 144: 555-8.         [ Links ]

11. Homse A, Casaro A, Campero C, Paolicchi F, Terzolo H. Infección experimental en ovejas por Brucella ovis. Rev Med Vet 1994; 75: 302-6.         [ Links ]

12. Hartley W, Jebson J, McFarland D. The artificial infection of sheep with a Brucella-like organism. Part I: The artificial infection of ewes. N Z Vet J 1954; 2: 80-5.         [ Links ]

13. Hughes KL, Experimental Brucella ovis infection in ewes. 1. Breeding performance of infected ewes. Aust Vet J 1972; 48: 12-7.         [ Links ]

14. Libal M. Ovine abortion caused by Brucella ovis. In: Clyde Kirkbride, editor. Laboratory Diagnosis of Livestock Abortion, 3rd edition. Ames, Iowa State University Press, 1990, p. 27-9.         [ Links ]

15. López G, Ayala SM, Escobar GI, Lucero N. Use of Brucella canis antigen for detection of ovine serum antibodies against Brucella ovis. Vet Microbiol 2005; 105: 181-7.         [ Links ]

16. Marco J, González L, Cuervo L, Beltran de Heredia F, Barberán M, Marin C, Blasco J. Brucella ovis infection in two flocks of sheep. Vet Rec 1994; 135: 254-6.         [ Links ]

17. McGowan B, Biberstein E, Harrold B, Robinson E. Epididymitis in rams: the effect of the ram epididymitis organism (REO) on the pregnant ewe. Proc US Live Stock Sanit Assoc 1961; 65: 291-6.         [ Links ]

18. Miles A, Misra S. The estimation of the bactericidal power of the blood. J Higiene 1938; 38: 732-49.         [ Links ]

19. Myers D, Jones L, Varela Díaz V. Studies of antigen for complement fixation and gel diffusion test in the diagnosis of infections caused by Brucella ovis and others Brucella. Appl Microbiol 1972; 23: 894-902.         [ Links ]

20. Paolicchi FA, Terzolo H, Malena R, Morsella C. Estudio comparativo de medios de cultivo para aislar Brucella ovis. Rev Argent Microbiol 1991; 23: 155-9.         [ Links ]

21. Paolicchi FA, Silva Paulo P, Solanet C, Eberhardt A, Malena R, Fiorentino MA, Vigliocco A. Aislamiento de Brucella ovis del tracto genital y leche de ovejas con persistencia de títulos positivos a ELISA. Rev Med Vet 2007; 88: 62-6.         [ Links ]

22. Ris D. The bacteriology and serology of ewes inoculated with viable Brucella ovis organism. N Z Vet J 1970; 18: 2-6.         [ Links ]

23. Terzolo H, Paolicchi FA, Moreira AR, Homse A. Skirrow agar for simultaneous isolation of Brucella and Campylobacter species. Vet Rec 1991; 129: 531-2.         [ Links ]

24. Vigliocco A, Silva Paulo P, Mestre J, Briones G, Draghi G, Tossi M, Nielsen K. Development and validation of an indirect enzyme immunoassay for detection of ovine antibody to Brucella ovis. Vet Microbiol 1997; 54: 357-68.         [ Links ]

25. Xavier MN, Teane M, Silva EA, Costa TA, Paixäo VS, Moustacas, Robles CA, Gouveia AMG, Lage AP, Tsolis RM, Santos R. Development and evaluation of a species-specific PCR assay for the detection of Brucella ovis infection in rams. Vet Microbiol 2010; 145: 158-64.         [ Links ]

Recibido: 11/9/2012
Aceptado: 7/12/2012