INFORME BREVE

Evaluación del sistema Vitek 2 para la identificación de las principales especies de levaduras del género Candida

Evaluation of Vitek 2 for the identification of Candida yeas

 

María E. Ochiuzzi^a*, Silvana Cataldi^b, Liliana Guelfand^b, Ivana Maldonado^b, Alicia Arechavala^b, Red de Micología CABA, Argentina^#

^aSección Microbiología, Laboratorio Central, Hospital General de Agudos Dr C.G. Durand, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
^bRed de Micología CABA, Argentina

Recibido el 4 de septiembre de 2013; aceptado el 27 de febrero de 2014

^# Los integrantes de la Red de Micología CABA están relacionados en el anexo.
* Autor para correspondencia.
Correo electrónico: omarieu@hotmail.com (M.E. Ochiuzzi).

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Resumen

El objetivo del trabajo fue evaluar el desempeño de las tarjetas YST del sistema Vitek 2 para la identificación de levaduras del género Candida. Se analizaron 168 aislamientos; los resultados fueron comparados con los obtenidos por los equipos API 20C AUX (24 %) o API ID 32C (76 %). Cada cepa se subcultivó en agar cromogénico para levaduras y se observó la micromorfología. C. albicans y C. dubliniensis fueron identificadas a través de pruebas bioquímicas y moleculares adicionales. La concordancia observada fue del 98,3 %. Solo tres cepas no fueron identificadas correctamente por el sistema Vitek 2: una cepa de C. tropicalis y una de C. krusei fueron identificadas erróneamente como C. parapsilosis y otra cepa de C. krusei fue identificada de manera incompleta por el software del equipo. El tiempo promedio de identificación con las tarjetas YST fue de 18,25 h. El sistema Vitek 2 surge como un método confiable, simple y efectivo para la identificación de las principales especies del género Candida.

Palabras clave

Vitek 2; Identificación; Candida spp.

© 2014 Asociación Argentina de Microbiología. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.

Abstract

The aim of this investigation was to evaluate the performance of Vitek 2 YST cards (bioMérieux, Inc., Hazelwood, MO, USA) for the identification of yeasts of the genus Candida. A total of 168 isolates were analyzed and the results were compared to those of the API 20C AUX (24%) o API ID 32C (76%) kits (bioMérieux, Marcy L'Etoile, France). Each isolate was grown in chromogenic agar and in corn meal agar (Oxoid, UK) to observe its micromorphology. C. albicans and C. dublininesis were identified by additional biochemical and molecular tests. The agreement observed was 98.3%. Only three isolates were incorrectly identified by Vitek 2: one strain of C .tropicalis and one strain of C. krusei were identified as C. parapsilosis by YST while one strain of C. krusei was identified with low discrimination. The average time for obtaining results was 18.25 h. Vitek 2 is a simple, safe and useful system for the identification of significant Candida species.

Keywords

Vitek 2; Identification; Candida spp.

© 2014 Asociación Argentina de Microbiología. Published by Elsevier España, S.L. All rights reserved.

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Las levaduras del género Candida constituyen la principal causa de infecciones fúngicas invasoras en pacientes hospitalizados^3,4. Diversos estudios señalan un cambio en la etiología de estas infecciones, con una disminución de Candida albicans y un marcado aumento del resto de las especies^2,6,10. En un estudio multicéntrico realizado en los hospitales de la Ciudad de Buenos Aires (Argentina), López Moral et al.⁸ señalaron que en hemocultivos, la distribución porcentual de las 4 especies más frecuentes (C. albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis y Candida glabrata) no presentó variaciones durante el período 2005-2008, y detectaron pocos aislamientos de especies menos frecuentes, como Candida pelliculosa, Candida dubliniensis, Candida rugosa, Candida intermedia, Candida sake, Candida holmii y Candida lusitaniae.

Por otra parte, se han identificado otros hongos levaduriformes como agentes etiológicos, los que generan cambios en la epidemiología y, por ende, en el adecuado abordaje del tratamiento antifúngico³. Las especies poco frecuentes del género Candida pueden presentar diversos patrones de sensibilidad, por lo tanto, es de suma importancia identificarlas correctamente y realizar las pruebas de sensibilidad in vitro.

El sistema Vitek 2 (bioMérieux, Inc., Hazelwood, MO, EE. UU.) es un equipo que identifica y establece el patrón de sensibilidad de diversos microorganismos. La tarjeta YST permite identificar levaduras de importancia clínica y organismos relacionados a través de 47 pruebas bioquímicas fluorescentes, las cuales incluyen asimilación de carbohidratos y ácidos orgánicos y detección de oxidasas y arilamidasas. Diversos estudios demostraron que mediante este sistema se puede identificar correctamente más del 93 % de las cepas analizadas en aproximadamente 18 horas^1,5,9,13,14. El objetivo de este estudio fue evaluar el desempeño de las tarjetas YST del sistema Vitek 2 para la identificación de las levaduras del género Candida más frecuentes en la práctica asistencial

Se estudiaron 164 aislamientos de Candida spp. provenientes de diversos materiales clínicos procesados en los hospitales integrantes de la Red de Micología de la Ciudad de Buenos Aires (CABA), Argentina, entre el 1 de septiembre de 2009 y el 31 de mayo de 2010. Se utilizaron como control de calidad las cepas de referencia C. parapsilosis ATCC 22019, C. krusei ATCC 6258, C. glabrata ATCC 90030 y C. albicans ATCC 64548.

Los aislamientos fueron obtenidos de las siguientes muestras: sangre (40), catéteres (14), líquidos de punción (10), hisopados de fauces (18), esputos (8), uñas (12), flujos vaginales (10), orinas (41), biopsias (7) y otros sitios (4).

Las levaduras fueron identificadas por medio de los equipos API 20C AUX (24 %) o API ID 32C (76 %) (bioMeriéux, Marcy l´Etoile, Francia), de acuerdo a la disponibilidad de cada hospital de origen. El procedimiento se realizó según las indicaciones del fabricante. Todos los aislamientos fueron identificados con una probabilidad ≥ 90 %. Estos sistemas comerciales fueron considerados el método de referencia.

Se analizaron en total 168 cepas (164 de muestras clínicas y 4 cepas ATCC), que incluyeron 32 C. parapsilosis, 28 C. glabrata, 26 de C. krusei, 29 de C. tropicalis, 20 de Candida guilliermondii, 26 C. albicans y 7 C. dubliniensis.

Para confirmar la pureza de cada aislamiento, se subcultivó en agar cromogénico para levaduras (CHROMagar^TM Candida, París, Francia), medio que contiene sustratos enzimáticos unidos a compuestos cromógenos que producen un color determinado en presencia de la enzima específica de algunas especies. También se inocularon en agar harina de maíz con 1 % de Tween 80 (corn-meal agar, Oxoid, Reino Unido)⁷, medio utilizado para observar la micromorfología de la levadura, la distribución de blastoconidios y la presencia de clamidoconidios y seudomicelios.

Debido a que C. albicans y C. dubliniensis presentan un perfil morfológico y fenotípico similar, se utilizaron 5 pruebas bioquímicas adicionales para realizar la identificación presuntiva (crecimiento a 42 °C, desarrollo en medio con NaCl 11 %, agar opacidad, agar tabaco y asimilación de D-xilosa)¹¹, y posteriormente se confirmó la identidad por un estudio molecular (PCR convencional) en el que se amplificó la región codificante completa del gen hwp1, que codifica una adhesina de superficie. Se utilizaron las siguientes secuencias de primers: Fw 5`-GCTACCACTTCAGAATCATCATC-3` y Rv 5`-GCACCTTCAGTCGTAGAGACG-3`. La detección de los productos amplificados se efectuó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 %. El tamaño de los fragmentos esperados era 941 pb (C. albicans) y 569 pb (C. dubliniensis)¹².

Se corroboró la identificación original de los 168 aislamientos utilizados en este estudio. En todos los casos, el color y el aspecto de las colonias en agar cromogénico fue el esperado para cada especie. De la misma manera, la micromorfología observada en el agar harina de maíz fue la esperada. Los aislamientos identificados presuntivamente como C. albicans-C. dubliniensis fueron confirmados mediante las pruebas fisiológicas, morfológicas y moleculares. Los 7 aislamientos de C. dubliniensis fueron identificados utilizando el sistema API ID 32C.

Antes de utilizar las tarjetas YST del sistema Vitek 2, cada aislamiento fue subcultivado en agar Sabouraud glucosado e incubado durante 48 h a 35 ºC para asegurar su pureza y viabilidad. Se realizó luego un segundo repique en el mismo medio de cultivo, que fue incubado durante 24 h. El inóculo de trabajo se preparó a partir de colonias de levaduras aisladas en 3 ml de solución fisiológica-agua destilada (1:1), hasta una turbidez equivalente a 1,8-2,2 de McFarland, utilizando el instrumento DensiCheck^® provisto por bioMérieux, según las indicaciones del fabricante. El inóculo preparado se dispensó en la tarjeta YST a través de un tubo de poliestireno estéril. Los cassettes fueron colocados en el Vitek 2; las tarjetas se llenaron, incubaron y leyeron dentro del equipo. Los datos obtenidos de cada prueba fueron interpretados según la base de datos del instrumento, para tipificar al microorganismo en estudio. El resultado de la identificación final fue clasificado como "excelente", "muy bueno", "bueno", "aceptable" o "baja discriminación", según el porcentaje de discriminación dado por el software del equipo. El tiempo de incubación varió de 18,0 a 18,5 h (promedio: 18,25 h).

Los resultados de identificación obtenidos por el Vitek 2 se compararon con los de los equipos API 20C AUX o API ID 32C leídos a las 48 y 72 h de incubación. El porcentaje de concordancia fue del 98,3 %. En la tabla 1 se detallan los resultados obtenidos. Tres cepas no fueron identificadas correctamente por el sistema Vitek 2: una cepa de C .tropicalis y una de C. krusei fueron identificadas erróneamente como C. parapsilosis por la tarjeta YST. Otra cepa de C. krusei fue identificada de manera incompleta por el software del aparato, pero al analizar los resultados de cada prueba incluida en la tarjeta y utilizando la micromorfología y las tablas del libro de De Hoog et al.⁶, se logró su correcta identificación.

Se validaron los resultados de cada ensayo en función de los datos correspondientes a las cepas ATCC.

La experiencia de varios autores avala la utilidad de las tarjetas YST para identificar levaduras correspondientes a géneros distintos de Candida, como Cryptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula spp., Pichia farinosa, Trichosporon asahii y Geotrichum capitatum, entre otros^1,5,9,13,14.

De acuerdo con los resultados de nuestro estudio podemos concluir que el sistema Vitek 2 es un método confiable, simple y efectivo para la identificación de las principales especies del género Candida. Presenta una concordancia del 98,3 % con los equipos API 20C AUX o API ID 32C. Es importante mencionar que al utilizar pruebas adicionales recomendadas por el software del equipo, se logra identificar las cepas que fueron catalogadas con baja discriminación, mejorando de este modo los resultados obtenidos^1,5,13,14. Asimismo, se reduce significativamente el tiempo necesario para obtener el resultado (de 48-72 h cuando se emplea API a 18,25 h con el sistema Vitek 2), en coincidencia con lo informado por otros trabajos^1,5,9.

Responsabilidades éticas

Protección de personas y animales. Los autores declaran que para esta investigación no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales.

Confidencialidad de los datos. Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.

Derecho a la privacidad y consentimiento informado. Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.

Agradecimientos

Al personal de la Unidad Micología del Hospital de Infecciosas "Dr. Francisco J. Muñiz", por haber realizado la PCR del gen hwp1.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Anexo. Integrantes de la Red de Micología CABA

Maldonado I, Hospital Alemán; Schijman M, Hospital General de Agudos Dr. T. Álvarez; López Moral L, Hospital General de Agudos Dr. C. Argerich; Rébori J, Hospital Borda; Relloso S, Instituto Universitario CEMIC; Cataldi S, Hospital General de Agudos Dr. C.G. Durand; Nápoli P, Hospital de Niños Dr. P. Elizalde; Fernández A, Fundación Favaloro; Guelfand L, Hospital General de Agudos J.A. Fernández; Arechavala A, Unidad Micología Hospital de Infecciosas F.J. Muñiz; Bianchi M, Unidad Micología Hospital de Infecciosas F.J. Muñiz; Romeo AM, Hospital General de Agudos Dr. J.M. Penna; Franco N, Hospital General de Agudos Dr. P. Piñero; Garbasz C, Hospital General de Agudos Dr. I. Pirovano; López M, Hospital General de Agudos Dr. Ramos Mejía; Madeo MC, Hospital General de Agudos Dr. Tornú; Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.

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