Staphylococcus aureus es un comensal que coloniza la piel, las mucosas y, persistentemente, las fosas nasales anteriores del 20% al 30% de la población mundial ¹⁴. También puede causar intoxicaciones graves que ponen en riesgo la vida de los seres humanos y los animales. La intoxicación estafilocócica de origen alimentario es una de las enfermedades transmitidas por alimentos más frecuentes en el mundo ⁸. En general, es una enfermedad autolimitada, que se inicia con vómitos violentos, después de un período corto de incubación de 2-6 horas a partir de la ingestión del alimento contaminado, puede producir también una gastroenteritis aguda ³. En la mayoría de los casos los síntomas remiten después de 24 horas. Se estima que solo el 10% de los pacientes con intoxicación estafilocócica de origen alimentario acuden a un hospital ⁵, y la mortalidad varía del 0,03% al 4,4% y se da principalmente en niños y ancianos ².

Se han descrito 23 enterotoxinas (SE) ¹¹ y superantíge-nos, pero solo algunas de las primeras han demostrado inducir una respuesta emética en ensayos en monos. Entre las enterotoxinas con actividad emética se incluyen las clásicas SEA/SEB/SEC/SED/SEE, como así también SEG/SEH/SEI/SEJ ¹.

S. aureus puede aislarse a partir de muestras de heces de pacientes, alimentos, muestras ambientales y manipuladores de alimentos. En los alimentos procesados la contaminación es introducida principalmente por los manipuladores, debido a inadecuadas prácticas de manufactura ¹³. Por otra parte, las malas condiciones de almacenamiento de los alimentos favorecen la multiplicación de S. aureus y la consecuente producción de las enterotoxinas como principal factor de virulencia.

El presente trabajo tuvo como objetivos describir un brote de intoxicación estafilocócica de origen alimentario ocurrido en un jardín de infantes del partido de Hurling-ham, provincia de Buenos Aires, e identificar y caracterizar la cepa de S. aureus responsable de ese brote.

El 27 de noviembre de 2008 un total de 117 personas (contabilizando ninños, docentes y auxiliares) asistieron entre las 12 y las 13 horas al comedor de un jardín de infantes de Hurlingham, provincia de Buenos Aires. Entre las 14 horas y las 22 horas 47 personas (37 niños de 2 a 6 años y 10 adultos) acudieron al hospital de dicha localidad con síntomas gastrointestinales, principalmente vómitos (95%) y dolores abdominales; con menor frecuencia los pacientes informaron de diarrea (5%). De los ninos afectados 5 fueron internados con signos de deshidratación y uno de ellos fue derivado a la Unidad de Terapia Intensiva del Hospital Nacional Profesor Alejandro Posadas. La tasa de ataque fue del 40%, con un período de incubación promedio de 6 horas. Durante el interrogatorio todos los afectados refirieron haber comido salpicón de ave durante el almuerzo.

Ante la presunción de un brote de enfermedad transmitida por alimentos a fuente común, se procedió a inspeccionar la cocina y a recolectar información sobre la manipulación de los alimentos. Se tomaron muestras de alimentos y se efectuaron hisopados de manos y narinas de 5 manipuladores, y se recolectó materia fecal de 5 pacientes. Las muestras de alimentos fueron procesadas para la detección y el aislamiento de S. aureus y Bacillus cereus, según los lineamientos normativos de la International Commission on Microbiological Specifications for Foods⁶. Las muestras de materia fecal de los pacientes y los hisopados de nariz y manos de los manipuladores fueron sembrados en el medio Baird Parker (BP) directamente y también luego del enriquecimiento en caldo Gioliti Cantoni a 35°C durante 24 horas. Las colonias presuntivas de Staphylococcus spp. fueron tipificadas por pruebas bioquímicas convencionales. La detección de los genes que codifican las diferentes ente-rotoxinas se realizó por 2 PCR múltiples (mPCR), mPCR1 para la detección de los genes sea, seb, sec y 16S rRNA, y mPCR2 para la detección de los genes sed, see y 16S rRNA ⁹. Simultáneamente, se utilizó elsistema miniVIDAS® (bioMérieux, Argentina), determinación inmunoenzimática cualitativa y automatizada que permite la detección de las enterotoxi-nas de Staphylococcus spp. en alimentos mediante la técnica enzyme linked fluorescent assay para determinar la capacidad de producir el pool de enterotoxinas SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED y SEE.

Los aislamientos fueron subtipificados por la técnica de electroforesis de campo pulsado (PFGE) con la enzima de restricción Smal (Promega, Madison, WI, EE. UU.), según el protocolo descrito por Mulvey et al. ¹⁰, con modificaciones. Los bloques de agarosa que contenían el ADN de cada cepa fueron digeridos con 15 U de la enzima SmaI. Se utilizó como cepa de referencia Salmonella Braenderup H9812 digerida con la enzima XbaI. Los fragmentos de ADN fueron separados en un gel de agarosa al 1% (Seakem LE Agarose, Rockland, ME, EE. UU.) en buffertris borato EDTA0,5X, en una cámara de electroforesis CHEF-DR III system (BioRad, Hercules, CA, EE. UU.). La captación de imágenes se realizó con el programa Doc-It Image Acquisition, y los patrones de macrorrestricción generados fueron analizados con el software BioNumerics versión 5.1 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Bélgica). La relación entre los patrones fue estimada por la proporción de bandas compartidas aplicando el coeficiente de Dice, generando dendrogramas basados en el método UPGMA. Los patrones moleculares obtenidos por Smai-PFGE fueron agrupados en conjuntos clonales cuando presentaron una similitud del 100%.

La muestra de salpicón de ave fue positiva para la presencia del pool de enterotoxinas SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED y SEE mediante la utilización del sistema miniVIDAS. Se aisló S. aureus subsp. aureus portador de los genes que codifican las enterotoxinas SEA y SED, y no se aisló Bacillus cereus.

De 4/5 muestras de materia fecal y de 3/5 muestras de manipuladores de alimentos se aislaron cepas de S. aureus subsp. aureus. Las cepas aisladas de la nariz del manipulador 1 (M1) y de las manos de los manipuladores 2 (M2) y 3 (M3) portaban los genes que codifican las enterotoxinas SEA y SED. Por otra parte, la cepa de S. aureus aislada de las manos del M1 codificaba SEB y SEC, y aquella aislada de la nariz del M2 portaba genes codificantes de SEA y SEC. Si bien la portación de genes codificantes de SEA es la más frecuente en S. aureus, también se ha descripto en este microorganismo la asociación entre 2 o más enterotoxinas ¹².

De la muestra de narinas del M3 solo se recuperó Staphylococcus coagulasa negativo, no toxigénico ( fig. 1). Las muestras de manos y narinas de los manipuladores M4 y M5 fueron negativas.

Figura 1 A. PCR múltiple para la detección de los genes sea (521pb), seb (667 pb), sec (284 pb) y 16S rRNA (228 pb) de Staphylococcus aureus. Calle 1: aislamiento del alimento; calles 2 y 3: nariz y mano del manipulador 1, respectivamente; calles 4 y 5: nariz y mano del manipulador 2, respectivamente; calles 6 y 7: nariz y mano del manipulador 3, respectivamente; calle 12: control positivo sea; calle 13: control positivo seb; calle 14: control positivo sec; calle 15: control de reactivos. B. PCR múltiple para la amplificación de los genes sed (385 pb), see (171 pb) y 16S rRNA (228 pb) de Staphylococcus aureus. Calle 1: aislamiento alimento; calles 2 y 3: nariz y mano del manipulador 1, respectivamente; calles 4 y 5: nariz y mano del manipulador 2, respectivamente; calles 6 y 7: nariz y mano del manipulador 3, respectivamente; calle 12: control positivo sed; calle 13: control positivo see; calle 14: control de reactivos. 

No se observaron diferencias en la recuperación de aislamientos a partir de materia fecal cuando las muestras se sembraron directamente en BP en comparación con aquellas muestras sometidas al enriquecimiento previo en Gioliti Cantoni. Sin embargo, la etapa de enriquecimiento resultó ser más eficaz para la recuperación de S. aureus a partir de hisopados de manos o de nariz (5 positivos) que la siembra directa en BP (2 positivos).

Sobre un total de 10 cepas de S. aureus analizadas se establecieron 3 patrones de macrorrestricción por Smai-PFGE, los cuales presentaron entre 7 y 9 bandas bien definidas, de 45 a 630 kb. Los patrones de las cepas aisladas de la nariz de M1, de las manos de M2 y M3, las 4 cepas aisladas de materia fecal de los pacientes y la cepa recuperada del salpicón de ave presentaron el 100% de similitud entre sí (patrón Smai-PFGE #1), el 75% de similitud con la cepa de nariz de M2 (patrón Smai-PFGE #2) y el 61% de similitud con la cepa de manos de M1 (patrón Smai-PFGE #3) ( fig. 2).

Figura 2 Relación clonal de aislamientos de Staphylococcus aureus asociados a un brote de intoxicación alimentaria en un jardín de infantes. 

El agente etiológico de la intoxicación alimentaria —identificado como S. aureus subsp. aureus— fue productor de las enterotoxinas A y D y fue aislado del salpicón de ave, de la materia fecal de los pacientes y de 3 manipuladores (M1, M2 y M3); los perfiles de bandas fueron indistinguibles por Smai-PFGE y, por lo tanto, estos aislamientos pertenecieron a un mismo clon, lo que permite inferir que hubo una contaminación durante el proceso de preparación del alimento.

A partir del interrogatorio se pudo establecer que los manipuladores eventuales M1 y M2 fueron los encargados del troceado y picado del pollo, mientras que el manipulador M3 trabajó con el producto ya elaborado.

Si bien la portación nasofaríngea de S. aureus es frecuente (al igual que la de cepas enterotoxigénicas ⁷) y un 50% de los adultos sanos puede transmitir S. aureus a través de sus mucosas ⁴, su presencia en el alimento demuestra malas prácticas de manufactura ¹⁵. Como hipótesis sobre el origen del brote se puede suponer que M1 pudo haber contaminado el pollo durante el troceado y picado a partir de sus narinas. Posteriormente, M2 y M3 se contaminaron las manos al entrar en contacto con el alimento. Esto enfatiza la necesidad de capacitar al personal de cocina en normas básicas de higiene y buenas prácticas de manufactura ¹⁵.

Además, hubo factores que favorecieron la proliferación de S. aureus y la producción de enterotoxinas, como las altas temperaturas (aproximadamente 38 °C en el ambiente externo) y el tiempo prolongado en completar toda la operación de picado, mezclado, fraccionamiento y distribución del alimento para el consumo. A raíz de la ocurrencia de este brote se intensificaron las medidas de higiene en la cocina del establecimiento y se capacitó a todo el personal eventual de cocina, junto con el personal estable de todos los jardines de infantes del municipio, en lo referente a buenas prácticas de manufactura.

La investigación oportuna de este brote pone de manifiesto la importancia del trabajo conjunto en términos de epidemiología, clínica y laboratorio, a fin de poder identificar el agente causal y detectar situaciones predisponentes para la ocurrencia de brotes, lo cual ayuda a implementar medidas correctivas y preventivas.