Introducción

La neosporosis bovina es una enfermedad parasitaria pro ducida por el protozoo apicomplejo Neospora caninum, ampliamente distribuido en regiones ganaderas de todo el mundLos cánidos se comportan como hospedadores definitivomientras que diversas especies de mamífe ros pueden ser hospedadores intermediarios, entre ellos, los bovino. En estos animales, el signo clínico más importante es el aborto, aunque también pueden presentarse casos de muerte embrionaria o neonataLas fallas reproductivas debidas a neosporosis bovina están asociadas a grandes pér didas económicas a nivel mundial, que han sido estimadas en alrededor de 1.300 millones de dólares por año, con mayor efecto sobre la industria lecher

La transmisión del parásito a los hospedadores intermediarios puede ocurrir horizontalmente, por la ingesta de ooquistes, o verticalmente durante la prenñez, por vía transplacentaria. La transmisión vertical, a su vez, puede subclasificarse como endógena o exógena. La vía endógena es causada por la reactivación de quistes tisulares en un animal persistentemente infectado y se asocia a un patrón endémico de fallas reproductivas y al mantenimiento de la infección en el rodeo. La transmisión exógena, en cambio, tiene lugar luego de una infección horizontal primaria causada por la ingesta de ooquistes por un animal preñnado y se asocia a un patrón epidémico de aborto

Entre los principales factores de riesgo figuran el sistema de producción y manej las consecuencias directas de las propias infeccione

Distintos estudios han verificado que el estado serológico de los rodeos infectados con N. caninum es variable entre países y regiones del mismo país, y también entre sistemas productivo. En América Latina, la neosporosis es considerada una enfermedad emergente en rodeos lecheros, con prevalencias variable

Según relevamientos realizados en diferentes regiones de la Argentina, se conoce que la enfermedad está ampliamente distribuida tanto en rodeos de cría como en tamboEn la provincia de Salta, existe un único antecedente sobre un relevamiento efectuado en el Valle de Lerma en 2011, que arrojó una prevalencia del 31% para tambos (comunicación personal). No existe un análisis de seroprevalencia actualizado de esta zona.

La ganadería en el noroeste argentino (NOA) ha crecido, principalmente, debido a la expansión de monocultivos en el centro del paíPor esta razón, estudiar la epidemiolo gía de las enfermedades reproductivas en esta zona podría redundar en un mayor crecimiento económico estratégico. Se ha reportado que los rodeos lecheros son más proclives a contraer infecciones por N. caninu a tener las pérdidas económicas asociadas. Para profundizar al respecto, en este trabajo nos propusimos estimar la seroprevalencia de esta enfermedad en vacas de tambos ubicados en el Valle de Lerma, provincia de Salta, y caracterizar distintos factores de riesgo asociados, con el objetivo de establecer las medidas de control más adecuadas para esta región.

Materiales y métodos

Encuesta epidemiológica

Se analizaron en total 16 establecimientos (51,6% del total de tambos de la provincia) ubicados en el Valle de Lerma, Salta, durante el período 2016-2018. Se realizó una encuesta transversal mediante visita a cada establecimiento. Esta contempló preguntas sobre identificación, manejo productivo, datos sanitarios y presencia de cánidos domésticos o silvestres. La vacuna reproductiva utilizada en algunos de los tambos estudiados está incluida dentro de los planes de vacunación regionales y contiene antígenos del herpesvirus bovino (IBR) tipo 1 y tipo 5, del virus de la diarrea viral bovina, de Campylobacter sp., Histophilus sp. y de diversos serovares de Leptospira sp.

Toma de muestra

El tamaño de la muestra se determinó mediante un pro grama de muestreo estadístico del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) (proMESA 1.3, desarrollado por Emilio A León [Unidad de Epidemiología, CICVyA, INTA], Sergio J. Duffy [Unidad de Epidemiología, CICVyA, INTA], Bryan oLeary [EpiCentre, Massey University, Nueva Zelanda] y Mark Stevenson [EpiCentre, Massey University, Nueva Zelanda]), considerando una prevalencia esperada de un 40% (estimada a partir de comunicaciones personales con profe sionales de INTA), aceptando un error relativo del 20% y una tasa de homogeneidad baja. Se tomaron por cada tambo alrededor de 40 muestras sanguíneas de hembras adultas raza Holstein en ordeñe, escogidas al azar. En 9 de los tam bos fue posible, además, muestrear algunos de los perros (n = 41) que estaban en contacto con las vacas, ya sea en el campo o en los alrededores de las instalaciones de ordene.

A los bovinos se les tomaron muestras de 5 ml de sangre sin anticoagulante por venopunción coccígea y a los cánidos domésticos se les tomaron 5ml de muestra de sangre sin anticoagulante por venopunción yugular o de vena cefálica antebraquial. Dichas muestras fueron incubadas durante 30 min a 37°C y luego centrifugadas (3.000rpm, 10 min). Se separó el suero en 2 alícuotas, que se conservaron a -20 °C hasta su análisis.

Técnicas serológicas

La detección en suero de anticuerpos específicos inducidos por la infección se realizó mediante un ELISA indirecto desarrollado en nuestro laboratorio, siguiendo los linea- mientos ya establecidoBrevemente, las placas fueron sensibilizadas (6h, 4°C) con un extracto soluble de taquizoítos de N. caninum (cepa Nc1, 750 ng/pocillo), que fue obtenido siguiendo procedimientos ya reportado Luego de 3 lavados con solución de lavado (PBS-Tween 0,05%; 250 pocillo), las placas fueron bloqueadas con 125 pocillo de una solución de PBS-caseína al 0,5% (solución bloqueante) durante toda la noche a 4^°C. Los sueros problema se diluyeron 1:120 en solución blo queante y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente (50 ^l/pocillo). Luego de 3 lavados, se adiciona ron 50^l/pocillo (dilución 1:5.000 en solución bloqueante) del anticuerpo conjugado (anti-IgG bovina conjugado a peroxidasa AffiniPure Goat Anti-Bovine IgG [H+L], número de catálogo 101-035-003, Jackson Immuno Reaserch Labora- tories Inc., PA, EE. UU.) y se incubó a temperatura ambiente durante 20 min. El sustrato (50 ^l/pocillo; TMB One Solution, número de catálogo G7431, Promega Biosciences, CA, EE. UU.) fue agregado luego de unos lavados e incubado en oscuridad durante 10 min a temperatura ambiente. Finalmente, se adicionó la solución de frenado (H₂SO₄ 2N, 50 ^l/pocillo) y las placas fueron leídas a 450 nm. Los resultados se calcularon normalizando los valores de densidad óptica (DO) respecto del control positivo (S/P [%]). Se utilizó como control positivo y negativo el suero de un animal infectado y de otro no infectado, respectivamente, caracterizados previamente por inmunofluorescencia indirecta (IFI, estándar de oro) y por ELISA (ID Screen® Neospora caninum Competition, IDVet, Montpellier, Francia).

Para determinar el punto de corte, se evaluaron muestras positivas (n = 307) y negativas (n = 327) (dilución final 1:120) cuyo status fue definido por IFI. Se construyó una curva ROC y se crearon 2 histogramas; su punto de intersección se consideró como el valor de corte. Se estableció una relación S/P del 40% como un umbral de corte apropiado, pero, dado que se observó cierta superposición entre ambas curvas, las muestras con valores de S/P entre el 30 y el 40% se conside raron dudosas y se procesaron nuevamente en una dilución final de 1:40. El valor de corte de esta prueba confirmatoria fue establecido en el 30% (datos no publicados).

Para determinar la avidez de los anticuerpos, se agregó un paso de lavado de las muestras de suero con un agente caotrópico (urea 6 M en PBS), que despega anticuerpos débilmente unidos al antígeno antes de agregar el conjugado. Esta solución se incubó en la placa durante 20 min a tempe ratura ambiente (100^l/pocillo). Luego, las placas fueron lavadas 3 veces con solución de lavado y se prosiguió con el protocolo, tal como se describió. El grado de disociación obtenido establece la fuerza de unión de los anticuerpos presentes en el suero al antígeno y se estima mediante el índice de avidez (IA [%]), que se calcula como la relación entre el valor de la DO con el tratamiento con el agente caotrópico y el valor de la DO sin aplicar dicho tratamiento. Se consideran anticuerpos de alta avidez aquellos que presentan IA superiores al 65

Las muestras de los sueros provenientes de los perros fueron procesadas por IFI en un laboratorio privado (BioVet Lab, Rafaela, Santa Fe, Argentina).

Análisis estadístico

Se utilizó un análisis estadístico descriptivo. Se estimó la prevalencia aparente y real en función de la sensibilidad (0,925) y especificidad (0,968) de la prueba de ELISA utilizada, que había sido desarrollada y validada previamente en nuestro laboratorio mediante un análisis ROC¹⁷.

La correlación lineal (Pearson) y la regresión lineal simple se emplearon para establecer la relación entre seropreva- lencia y porcentaje de infecciones crónicas. Se aplicaron un análisis de varianza y una prueba de Fisher para asociar la presencia de abortos con la seroprevalencia de N. caninum y con la proporción de infecciones crónicas y de infecciones agudas. En todos los casos, el intervalo de confianza (IC) utilizado fue del 95%.

Resultados

Sistemas productivos

Se realizaron encuestas en 16 tambos ubicados en diferentes puntos del Valle de Lerma, correspondientes a zonas altas sobre las cimas y las laderas de los cerros o en los valles con humedales. Se procesaron como mínimo 38 muestras de suero de vacas de cada tambo. Los tambos evaluados corres ponden a la mitad de los tambos de la provincia (fig. 1).

El Valle de Lerma se encuentra ubicado entre los parale los 24° 30’ y 25° 37’ de latitud sur y los meridianos 65° 22’ y

65° 40’ de longitud oeste, lo que representa un área total de 17.000km² de extensión, que alberga los departamentos de La Caldera, Capital, Rosario de Lerma, Cerrillos, Chicoana, La Viña y parte de General Güemes. La temperatura media es de aproximadamente 23 °C en verano y 15 °C en invierno. La distribución geográfica de los tambos que formaron parte de este trabajo se muestra en la figura 1C.

Los resultados de la encuesta realizada en los tambos se resumen en la. La mayoría de los establecimientos (13/16) tienen un manejo que complementa al pastoreo, con suplementación con maíz molido y silo más heno de alfalfa, soja, semilla de algodón y afrechillo de trigo. Dos establecimientos (2/16) tienen un sistema de dry lot, en donde los animales también son alimentados con pasturas naturales y suplemento, pero se encuentran en un área elevada con una pendiente que permite evacuar el agua en épocas de lluvia. El establecimiento restante tiene un sistema de free stall, con los animales confinados y un manejo más intensivo.

La mayoría de los tambos estudiados (13/16) utilizaban vacunas reproductivas, independientemente del sistema productivo. La presencia de perros se declaró en un 62,5% de los tambos y se registró también la visita nocturna frecuente de zorros (Lycalopex culpaeus) en los silos y las pasturas utilizadas por las vacas, aunque no se procesaron muestras de estos animales.

Serología en bovinos y caninos domésticos

Se obtuvieron muestras de 693 bovinos (459 vacas y 234 vaquillonas de 2-3 años) y 41 perros. El 100% de los tam bos presentó al menos 2 bovinos con anticuerpos específicos para N. caninum, lo que evidencia la importante circulación de la enfermedad. Los datos de serología obtenidos para N. caninum en sueros bovinos y caninos se muestran en l.

De un total de 693 muestras bovinas analizadas, 244 fueron positivas. Esto arroja una seroprevalencia aparente del 35,5% (IC = 0,32-0,39) y una seroprevalencia verdadera del 35,9% (IC = 0,32-0,40). La media estimada de la seroprevalencia intrarrodeo fue del 35,3 ± 14,9% (límites: 5% al 62,5%). La distribución de la frecuencia de la seroprevalencia de N. caninum en los rodeos estudiados indica que el 43,7% de ellos tiene una prevalencia mayor del 40% (fig. 2).

Al menos la mitad de los establecimientos en los que se tomaron muestras de sangre de perros presentaba anticuer pos específicos anti-N. caninum. El promedio de animales seropositivos fue de 71,7 ± 19,9%. Si bien la presencia de perros infectados y la seroprevalencia intrarrodeo no estu vieron asociadas de manera estadísticamente significativa, se detecta una tendencia que podría indicar una relación positiva entre ambas variables. Se necesitan más datos para confirmar esta asociación (fig. 3).

Mediante la aplicación del ELISA de avidez se determinó que el 43,7% de los bovinos positivos presentaban infeccio

Figura 2 Análisis de frecuencias de la seroprevalencia de N. caninum en los rodeos.

nes crónicas (IA mayor del 65%) y, por lo tanto, más de la mitad de los animales estudiados cursaban una infección aguda (fig. 4A). También se encontró una asociación negativa (r² = 0,33; p < 0,02) entre la seroprevalencia y las infecciones crónicas determinadas según el IA de IgG. Se observa claramente que los establecimientos que poseen menor seroprevalencia son aquellos en los que la inciden cia de infecciones crónicas es mayor que la de infecciones agudas (fig. 4B). Además, se observó una asociación positiva entre infecciones agudas y sistema productivo con pastoreo y suplementación (test de Fisher; p = 0,0294).

Las infecciones crónicas corresponden a un IA > 65%. ND: no determinado.

Figura 3 Asociación entre la seroprevalencia de N. caninum y el porcentaje de perros con serología positiva.

Figura 4 Porcentaje de animales con infecciones crónicas y agudas, determinado según la avidez de los anticuerpos totales específicos (IA mayor o menor del 65%, respectivamente) (A). Asociación entre el porcentaje de infecciones crónicas intratambo y la seroprevalencia de N. caninum en los rodeos (B).

Figura 1: Ubicación geográfica de la Argentina (A) y la provincia de Salta (B); el círculo senala la ubicación del Valle de Lerma.Detalle del Valle de Lerma (C); los círculos senalan la ubicación de los tambos muestreados (enumerados del 1 al 16). El color delfondo del círculo denota el sistema productivo del establecimiento. 

Discusión

En este estudio hemos caracterizado, por primera vez, la seroprevalencia de N. caninum en la cuenca lechera del Valle de Lerma, situado en la provincia de Salta (Argentina), y hemos analizado diferentes factores de riesgo para su transmisión en esta región, incluyendo aspectos geográficos, de manejo productivo y ecológicos.

Detectamos animales seropositivos en la totalidad de los tambos muestreados, con una seroprevalencia alta a nivel rodeo (valor promedio del 35,3% y un valor máximo del 62,5%), sin diferencias entre las prevalencias aparentes y las reales debido a la alta sensibilidad y especificidad de la prueba de ELISA utilizada. Estos valores remarcan la importancia que tiene N. caninum en la sanidad de estos establecimientos.

En la región central de Argentina, estudios previos hallaron también una elevada circulación de N. caninum, con casi la totalidad de los rodeos lecheros muestreados positivos, aunque con prevalencias menoreResulta importante destacar que el 43,7% de los tambos presen taron seroprevalencias superiores al 40%, con anticuerpos predominantemente de baja avidez, lo que denota la gran dispersión de la enfermedad con carácter epidémico en esta región. Esto remarca la importancia de establecer progra mas de manejo y control, considerando el escaso número de animales seronegativos presentes para reemplazos y los costos de las vaquillonas a incorporar.

La tasa de transmisión vertical en animales con infeccio nes crónicas ya fue estudiada por nuestro grupo de trabajo en animales de esta misma cuenca lecherEn ese trabajo previo, pudimos observar que la mayoría de los bovinos con infecciones crónicas no abortaba y que la transmisión se relacionaba con un perfil particular de respuesta inmunitaria. Dado que la presencia de anticuerpos puede generar protección (se ha visto que vacas multíparas infectadas no aborta la presencia de una alta tasa de infecciones crónicas podría explicar, al menos parcialmente, la falta de correlación entre seroprevalencia y abortos en algunos casos.

No encontramos asociaciones estadísticamente significativas entre la seroprevalencia de N. caninum en los rodeos y los datos productivos de estos, probablemente debido a que el manejo productivo y reproductivo es similar en la mayoría de los tambos.

Varios trabajos han propuesto al manejo intensivo como un factor de riesgo clave para explicar la mayor prevalencia de N. caninum que se suele observar en los tambos comparados con los rodeos de cría, lo cual se adjudicó a una mayor exposición posnatal a ooquistes que contaminan el agua y el alimento del ganado. Otros estudios, por el contrario, han identificado la transmisión vertical endógena como factor de riesgo en tambos con sistemas intensivoEn la cuenca del río Salado (principal área de cría de ganado de Argentina), los sistemas extensivos no estarían asociados a la transmisión horizontal del parásitaunque se reportó un tambo en la provincia de Buenos Aires con seroprevalen- cia muy alta (80,9%) y en donde la frecuencia estimada de transmisión horizontal superaba a la de transmisión vertical (el 51 y el 37,1%, respectivamente).

En este sentido, nuestros resultados muestran que el tambo con sistema intensivo (free stall) posee una mayor cantidad de infecciones crónicas, lo que sugiere la menor circulación de ooquistes. Lo mismo observamos en los campos con sistema de dry lot, en donde el escurrimiento del agua de lluvia y riego, favorecido por la pendiente de estas zonas, podría limitar el contacto de los quistes con el alimento. Estos datos sugieren que tanto el sistema de manejo (intensivo o extensivo) como las condiciones topográficas (altura, pendiente) y otras particularidades (acequias de agua de lluvia compartidas entre distintos tambos) deberían ser consideradas en futuros estudios que abarquen mayor número de tambos de similares características, ubicados en esta misma región o en otras.

Las características climáticas también podrían comportarse como un factor de riesgo asociado al aborto, aunque hay pocos datos al respecto. Se ha observado que un incremento en el nivel de precipitaciones en ambientes secos puede comprometer el éxito de la gestación en vacas infectadas con N. caninum.

La transmisión horizontal no ha sido tradicionalmente considerada como la más importante debido a su menor asociación con abortos en comparación con la transmi sión verticalaunque se ha establecido que también puede contribuir al mantenimiento de una alta seroprevalencia en rebaños infectados endémicamente.

En los tambos en los que se pudieron tomar muestras de perros, se encontró al menos un animal seropositivo, lo que evidencia una posible fuente de contagio importante. Todos los tambos reportaron la presencia de zorros y comadrejas; en muchos casos, se observó incluso la presencia de madrigueras y perros en los depósitos donde se almacena el alimento. Esto sugiere que la presencia de los perros en los rodeos bovinos constituye un factor de riesgo para este tipo de transmisión, tal como se ha informado previamente.

En este sentido, nuestros resultados remarcan la importancia que tiene individualizar los distintos factores de riesgo y diferenciar infecciones horizontales de verticales, y, a su vez, determinar si estas son endógenas o exógenas, para caracterizar la situación epidemiológica de una región en particular. Estos datos, sin duda, serán esenciales para la confección de un plan de manejo tendiente al control de esta enfermedad.

Conclusiones

Este trabajo demuestra por primera vez la circulación de N. caninum en la cuenca lechera del Valle de Lerma, en la provincia de Salta. Existe una alta prevalencia de neospo- rosis de carácter epidémico en los tambos de esta región, con un 100% de rodeos positivos y una prevalencia prome dio intrarrodeo del 35%. Se encontró una asociación positiva entre la seroprevalencia y la presencia de infecciones agu das en animales adultos, lo que sugiere que el principal mecanismo de dispersión de la enfermedad en esta región es la transmisión horizontal. La presencia de perros infec tados, la ubicación geográfica y el libre pastoreo serían los principales factores de riesgo con efecto sobre este tipo de transmisión.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún tipo de conflicto de interés con personas u organizaciones que pudieran sesgar su trabajo.

Financiación

Este trabajo se realizó con fondos provenientes del programa de Salud Animal de INTA (PNSA1115053).

Agradecimientos

Los autores agradecen al personal de los establecimientos donde se realizó el estudio, incluyendo tamberos y veteri narios, por su colaboración con el manejo de los animales.