Introducción

Escherichia coli diarreogénica (DEC) comprende un grupo heterogéneo de cepas de E. coli que causan diferentes síndromes diarreicos y presentan marcadas diferencias en los factores de virulencia, la patogenia y la epidemiología de la infección. A la fecha, se reconocen seis categorías, variantes patogénicas o patotipos: Escherichia coli enteropatogénica (EPEC), Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC), Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC), Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC) y Escherichia coli de adherencia difusa (DAEC). La capacidad patogénica y el alcance epidemiológico de la última categoría, sin embargo, no se hallan completamente esclarecidos^4,11,21.

Las frecuencias de infección humana con DEC presentaron amplias variaciones según la región geográfica, con valores que oscilaron entre el 1 y el 52%4,6,9,10,20,23,25,26,32. Estudios publicados en numerosos países de Latinoamérica senalaron una prevalencia regional diferencial de los diversos patotipos. Por ejemplo, la mayoría de los casos de diarrea reportados en México, Colombia y Nicaragua estaban asociados a ETEC. En la población de Brasil, Paraguay y Perú, el patotipo más frecuente fue EAEC, mientras que, en la República Argentina, Chile, Venezuela y Uruguay, el principal patotipo asociado a diarrea fue EPEC1,2,8,16,21,28,30.

En los reportes oficiales sobre agentes etiológicos de diarreas agudas de nuestro país, Shigella spp. y EPEC aparecen como los patógenos bacterianos identificados con mayor frecuencia13. Sin embargo, existe información muy limitada sobre la infección por los diversos patotipos diarreogénicas de E. coli (a excepción de STEC) en la población pediátrica con enfermedades diarreicas. El objetivo de este trabajo fue estimar la frecuencia de infección por los patotipos de Escherichia coli diarreogénica en la población pediátrica ambulatoria con diarrea atendida en el Hospital Sor María Ludovica de La Plata, Argentina, durante el período comprendido entre mayo y octubre de 2017.

Materiales y métodos

El estudio se realizó con una estrategia cuantitativa, con la aplicación de un diseño observacional, descriptivo, prospectivo y de corte transversal. El período estuvo comprendido entre mayo y octubre de 2017. El estudio incluyó las heces de ninos menores de 15 años que presentaron un cuadro diarreico y que se atendieron en forma ambulatoria en el Hospital de Niños Sor María Ludovica de La Plata, Argentina. Se excluyeron del análisis las heces de niños hospitalizados, trasplantados, inmunosuprimidos, con enfermedades onco-hematológicas o enfermedad intestinal inflamatoria crónica. La confidencialidad fue observada mediante la asignación de un código alfanumérico interno, que permitió mantener separada en todo momento la identidad de las muestras de heces (descartadas al término del estudio) de cualquier tipo de información personal. La investigación respetó las normas de buenas prácticas clínicas, la declaración de Helsinki, con todas sus enmiendas, y estuvo de conformidad con la normativa vigente aplicable.

Los patotipos de DEC fueron detectados mediante la amplificación molecular de ocho fragmentos de genes de virulencia característicos, con dos PCR múltiples (mPCR1 y mPCR2). Los genes investigados fueron los codificantes de la intimina (eae), la toxina termolábil LT (lí), las toxinas termoestables STP (stp) y STH (sth), el antígeno plasmídico de invasión H (ipaH), el activador transcripcional R (aggR) y las toxinas Shiga 1 (stx1) y Shiga 2 (stx2). Los patotipos fueron identificados según los genes de virulencia hallados en las colonias aisladas: EPEC (presencia de eae, ausencia de stxí y stx2), ETEC (presencia de It, stp y/o sth), EIEC (presencia de ipaH), STEC (presencia de stxí y/o stx2, presencia o ausencia de eae) y EAEC (presencia de aggR). La detección molecular fue realizada aplicando una estrategia diagnóstica en dos etapas. La primera etapa consistió en la realización de las dos PCR múltiples con ADN proveniente del cultivo confluente. En caso de que se hubiera observado amplificación de algún gen, la segunda etapa consistió en la identificación de la colonia positiva (con genes de virulencia). Para tal efecto, el ADN de 10 a 20 colonias aisladas se utilizó como molde para las PCR individuales14. La colonia que presentó amplificación fue identificada por métodos fenotípicos (VITEK®2, Biomerieux) para confirmar la especie bacteriana3,14.

La extracción de ADN y la amplificación molecular se llevaron a cabo según metodologías ya descritas3,14. Brevemente, la materia fecal fue sembrada en agar MacConkey e incubada a 37°C durante 24 h. Las colonias características que se desarrollaron se resuspendieron en buffer TE con Tritón X-100, se lisaron a 100 °C y se centrifugaron a 10.000rpm. El ADN se conservó a -20°C hasta su utilización. Las concentraciones en la mezcla de reacción fueron las siguientes: buffer 1 X y dNTP, 0,1 mM; Taq polimerasa, 0,03 U/^l y ADN, 1-5 p,l. La concentración de MgCl2 fue 1,5mM para mPCR1 y 0,75mM en la mPCR214. Las concentraciones de primers fueron 0,2pmol/^l (SK1, SK2, STh-f, STh-r, STp-f y STp-r); 0,25pmol/^l (LT-R, LT-F, IpaH8 e IpaH15); 1 pmol/^l (aggRks1 yaggRkas2); 1,6pmol/^l (stx1-F y stx1-R); 0,4pmol/^l (stx2-F y stx2-R) y 0,125pmol/^l (16S-f y 16S-r)14 (tabla S1, material suplementario).

El protocolo de ciclado de mPCR1 consistió en 94 °C durante 5min, seguido de 30 ciclos de 94°C 30s, 56 °C 1 min y 72 °C 1 min. El protocolo de mPCR2 fue 94°C 5 min, seguido de 30 ciclos de 94°C 30 s, 57 °C 1 min y 72 °C 30 s. La extensión final para ambos protocolos fue a 72 °C por 2 min3,14. En cada amplificación, se utilizaron cepas control: E. coli 2348/69 (eae), E. coli KNH-172 (lt, stp), E. coli O126-53 (sth), E. coli C-481 (ipaH), E. coli 17-2 (aggR), E. coli EDL933 (stx1, stx2) y E. coli ATCC 2592214. Los productos de amplificación fueron detectados mediante electroforesis en geles de agarosa al 2,5% y tinción con bromuro de etidio. Los perfiles de bandas fueron documentados con el sistema de adquisición de imágenes UVP Doc-It® LS, LifeScience Software.

Resultados

El grupo de estudio quedó constituido por 211 ninos, con un ligero predominio del género masculino (54%). La población menor de 5 años representó el 76% de los casos.

Escherichia coli (E. coli) diarreogénica se detectó en el 12,3% (n=26/211) de los niños con diarrea. Los patotipos identificados fueron EAEC, ETEC (todos lt positivos), EPEC y STEC (stx2 y eae positivos) (tabla 1 y figs. 1 y 2). Los pato-tipos ETEC con toxina termoestable (stp o sth), STEC (stx1) y EIEC (ipaH) no fueron detectados.

Tabla 1: Frecuencia de patotipos de E. coli diarreogénica (DEC) en heces de ninos con diarrea. La Plata, Argentina. Mayo-octubre de 2017.

Las frecuencias de infección de los patotipos EAEC, ETEC, EPEC y STEC fueron 10,43; 1,42; 0,95 y 0,47%, respectivamente. El patotipo EAEC fue prevalente en todos los grupos etarios, mientras que ETEC, EPEC y STEC solamente se observaron en ninños menores de 5 añnos (fig. 3).

Discusión

Los resultados de este estudio permitieron estimar la frecuencia de infección entérica de los patotipos de Escherichia coli diarreogénica en una población pediátrica ambulatoria con diarrea, atendida en el Hospital Sor María Ludovica de La Plata, Argentina, durante el período comprendido entre mayo y octubre de 2017.

Las cepas diarreogénicas y comensales de E. coli poseen características fenotípicas similares, que dificultan su identificación en el laboratorio de diagnóstico y por lo cual es importante el uso de métodos moleculares11. En las últimas décadas, se han hecho grandes avances en el diagnóstico molecular de los agentes productores de diarrea. La estrategia diagnóstica utilizada en esta investigación permitió verificar la viabilidad del patógeno mediante el estudio secuencial de cultivo in vitro y la posterior amplificación del ADN bacteriano. Asimismo, para descartar los resultados falsos negativos por la presencia de inhibidores de reacción, todas las reacciones moleculares incluyeron un control de amplificación interno14.

La presencia de E. coli diarreogénica fue observada en el 12,3% de los niños estudiados. Dicho valor fue comparable con los documentados en estudios realizados en Chile y Paraguay30,31. Otros informes reportan valores de infección más elevados4,11,20,23,25. Las diferencias en la frecuencia de infección podrían deberse a diversos factores, como el diseño del estudio, la época del año, la región estudiada, la duración de la diarrea, la población seleccionada o los métodos de diagnóstico etiológico utilizados4,21. Por ejemplo, una investigación realizada en India por Rajendran et al.20 informó que la infección estuvo presente en más del 50% de la población. Sin embargo, dichos autores caracterizaron los patógenos en ninños menores de 5 añnos con diarrea aguda grave y que habían sido hospitalizados por el cuadro entérico. De igual modo, publicaciones referidas a dos provincias de la Argentina señalaron frecuencias de infección por DEC mayores que las reportadas en el presente estudio. Una de esas investigaciones fue realizada en Corrientes por Esquivel et al.5, quienes señalaron la presencia de patotipos DEC en el 31% de los casos. Sin embargo, dichos autores seleccionaron pacientes pediátricos y adultos con diarrea aguda de cuyas heces no se hubieran aislado otros patógenos bacterianos. El segundo estudio fue realizado en Misiones por Quiroga et al.19, quienes reportaron la presencia de DEC en el 33% de los casos. No obstante, dicho estudio aplicó un disenño longitudinal, incluyó solamente ninños menores de 20 meses y utilizó una metodología de laboratorio diferente. Los estudios citados fueron heterogéneos en cuanto a diseñnos metodológicos, técnicas de detección y criterios de inclusión, lo que dificulta la comparación.

Figura 1: Productos de amplificación de factores de virulencia de cepas control de Escherichia coli. Izquierda: PCR múltiple 1. Calle 1: E. coli 2348/69 (eae, 864 pb), calle 2: E. coli KNH-172 (It, 322 pb) y (stp, 166 pb), calle 3: E. coli O126-53 (sth, 120 pb), calle 4: E. coli ATCC 25922 (16S rRNA, 204 pb). Derecha: PCR múltiple 2. Calle 1: E. coli C-481 (ipaH, 619 pb), calle 2: E. coli 17-2 (aggR, 254 pb), calle 3: E. coli EDL933 (stxl, 130 pb) y (stx2, 346 pb), calle 4: E. coli ATCC 25922 (16S rRNA, 204 pb). 

Figura 2: Productos de amplificación de factores de virulencia de Escherichia coli provenientes de aislamientos de pacientes y de cepas control. Calles 1, 13 y 14: E. coli 2348/69 (eae), calles 2, 9 y 16: E. coli KNH-172 (lt y stp), calles 3, 18 y 19: ausencia de factores de virulencia (pacientes), calle 4: E. coli C-481 (ipaH), calles 5 y 12: aislamientos de pacientes (aggR), calle 6: aislamiento de paciente (stx2), calles 7 y 15: aislamientos de pacientes (eae), línea 8: E. coli EDL933 (stxl y stx2), calle 10: E. coli O126-53 (sth), calle 17: E. coli 17-2 (aggR), calle 20: E. coli ATCC 25922 (16S rRNA). Calle 11: marcador de PM (100 pb). 

El patotipo EAEC fue prevalente y presentó una frecuencia cercana al 10%, mientras que los patotipos ETEC, EPEC y STEC fueron hallados en menor proporción. El predominio de EAEC está en concordancia con lo que informan diversos trabajos realizados en Argentina, Bolivia, Brasil, India, México, Paraguay y Perú^{4,5,9,12,20,21,27}.

La frecuencia de ETEC fue menor del 2% y todos los aislamientos presentaron la toxina termolábil. La presencia de aislamientos de ETEC con dicha toxina fue coincidente con lo que señalan otros estudios de Argentina12,19,29. Sin embargo, el porcentaje de niñnos infectados con el patotipo ETEC fue menor que el informado en otros trabajos del país. Al respecto, un estudio de cohorte realizado en ninos menores de dos años de Misiones reportó que ETEC estuvo presente en un 13% de los casos29. Asimismo, otro relevamiento en niños de Corrientes reportó una frecuencia de infección con dicho patotipo del 8%12. La menor frecuencia de ETEC hallada en el presente estudio podría deberse a diferencias en la edad de los individuos, al período estudiado o al sesgo de selección poblacional. Por ejemplo, el trabajo de Misiones evaluó la presencia de ETEC solamente en lactantes, el grupo etario con mayor prevalencia del patógeno, mientras que el estudio correntino solamente realizó la pesquisa de ETEC en las heces de los ninños con diarrea cuyos coprocultivos habían sido negativos para otras bacterias.

Figura 3: Número de niños con Escherichia coli diarreogénica (DEC) según grupo etario y patotipo detectado. EAEC: E. coli ente-roagregativa, ETEC: E. coli enterotoxigénica, STEC: E. coli productora de toxina Shiga, EPEC: E. coli enteropatogénica, ETEC/EAEC y EPEC/EAEC: coinfección de dos patotipos en el mismo nino con diarrea. La Plata, Argentina. Mayo-octubre de 2017. 

La presencia de EPEC en niñnos con diarrea fue menor del 1%. Este resultado coincide con el reportado en México2. Sin embargo, estudios realizados en varias localidades de la Argentina han mostrado valores de infección del 6 al 25%5,7,12,15,19. La menor frecuencia de EPEC en este estudio comparado con los antedichos podría deberse a la aplicación de distintas técnicas de diagnóstico para la búsqueda de EPEC (serotipificación o métodos moleculares), a la selección de otros grupos etarios, a la época del año o a la presencia variable de este patógeno en las distintas regiones del país4,11,21.

En este estudio se detectó un solo aislamiento de STEC, con una frecuencia cercana al 0,5%. Diversos estudios han reportado valores entre el 0,3 y el 13% en la población estudiada2,4,5,12,14,17,21,22,24. Esta amplia variación encontrada en la bibliografía podría deberse a diferencias en los criterios de inclusión, en el método de diagnóstico o a factores socioeconómicos, entre otros. El aislamiento STEC presentó los genes de la toxina Shiga 2 y de la intimina en su genoma. El hallazgo de dichos genes fue coincidente con lo publicado por diversos autores de Argentina14,17,21,22.

La distribución de los patotipos DEC presentó diferencias según la edad de los ninños con diarrea; EAEC fue observado en todos los grupos etarios, mientras que ETEC, EPEC y STEC solamente fueron detectados en niños de menor edad. El patotipo EAEC ha sido reconocido como un patógeno emergente, tanto por su reciente descripción como por su relevancia en cuadros gastrointestinales agudos y persistentes9,14,16,20,25. En esta investigación, la presencia de EAEC en ninños de mayor edad podría deberse a sus características patogénicas, ya que dicha bacteria es capaz de adherirse a la pared intestinal, favorecer la producción de moco, liberar enterotoxinas, estimular la respuesta inflamatoria intestinal, evadir el sistema inmunitario y persistir en el intestino por períodos prolongados4,14,21.

El predominio de infecciones con ETEC, EPEC y STEC hallado en niños menores de 5 años coincide con lo reportado en diversos estudios18,22,25,29. La evidencia ha señalado que, en las áreas endémicas, la disminución de las infecciones por dichos patotipos a medida que se incrementa la edad podría deberse al desarrollo de la inmunidad adquirida, a determinantes genéticos individuales o a factores ambientales4,18.

La presente investigación estuvo sujeta a varias limitaciones. En principio, no se contó con información sobre la presentación clínica o la duración del cuadro diarreico que motivó la consulta médica. En segundo lugar, este estudio no incluyó la detección de otras infecciones intestinales. En tercer lugar, no se investigaron las cepas de EAEC atípicas por la alta diversidad de sus genes de virulencia. Por último, este trabajo fue conducido en la población pediátrica de un área urbana durante un período de seis meses y puede no representar exactamente las frecuencias de infección entéricas de la región.

Este estudio constituye el primer reporte de detección de Escherichia coli diarreogénica mediante técnicas de amplificación molecular en una población pediátrica ambulatoria con diarrea asistida en La Plata. En las últimas décadas, se han hecho grandes avances en el diagnóstico de los agentes productores de diarrea. Sin embargo, la investigación de todos los patotipos diarreogénicos de E. coli por métodos moleculares no se realiza en forma rutinaria en la mayoría de los laboratorios de diagnóstico clínico. Por tal motivo, estos resultados revisten particular interés. De todos modos, sería importante realizar estudios más amplios, que incluyeran la caracterización de los aislamientos a partir de un mayor número de genes, controles asintomáticos, distintas épocas del año y población de diversas áreas geográficas, para esclarecer la relevancia de la infección por E. coli diarreogénica en niñnos de la Argentina.

Financiación

El presente trabajo ha sido financiado por un subsidio a la investigación clínica de la Fundación Alberto J. Roemmers.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no presentan conflictos de intereses en esta investigación.

Anexo. Material adicional

Se puede consultar material adicional a este artículo en su versión electrónica disponible en doi:10.1016/j.ram.2021.02.006