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Revista de la Sociedad Entomológica Argentina

versión impresa ISSN 0373-5680versión On-line ISSN 1851-7471

Rev. Soc. Entomol. Argent. v.62 n.1-2 Mendoza ene./jul. 2003

 

Niveles de esporulación experimentales y naturales de Nosema locustae (Microsporidia) en especies de tucuras y langostas (Orthoptera: Acridoidea) de la Argentina

Levels of experimental and natural sporulation of Nosema locustae (Microsporidia) in grasshopper and locust species (Orthoptera: Acridoidea) of Argentina

Lange, Carlos E.

Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores (CEPAVE), CIC – UNLP – CONICET, Calle 2 nro. 584, 1900 La Plata, Argentina; e-mail: lange@mail.retina.ar

RESUMEN. Nosema locustae Canning, un patógeno intracelular esporogénico del cuerpo graso de ortópteros utilizado para el control biológico de acridios, se estableció en ciertas comunidades de éstos de la Argentina luego de ser introducido hace poco más de 20 años. En el presente estudio se midieron, siguiendo metodología estandarizada para la estimación del número de esporos por insecto individual afectado, los niveles de esporulación alcanzados por N. locustae en tres especies de acridios naturalmente infectados [ Dichroplus elongatus Giglio-Tos, Dichroplus pratensis Bruner, Baeacris punctulatus (Thunberg)] y en seis especies infectadas experimentalmente [ Dichroplus maculipennis Blanchard, Dichroplus schulzi Bruner, D. elongatus, B. punctulatus, Ronderosia bergi Stal, Schistocerca cancellata (Serville)]. Los niveles de esporulación fueron importantes en todas las especies de la subfamilia Melanoplinae (el promedio varió entre 2 x 108 y 3,2 x 109), mientras que la producción de esporos fue rara (9,5 % de los ejemplares infectados) y baja (máxima de 9,6 x 106) en S. cancellata. No ocurrió desarrollo de infección en el acridio Romaleidae Elaeochlora viridicata (Serville). Los valores de esporulación alcanzados en los melanoplinos concuerdan con el establecimiento de N. locustae en comunidades de acridios de la Argentina, pues una alta disponibilidad de unidades infectivas transmisibles (propágulos) es un factor central para la transmisión y persistencia de una enfermedad en una población de insectos susceptibles. Aunque los niveles de esporulación más elevados se alcanzaron en D. maculipennis, R. bergi parece, por la falta de diapausa embrionaria obligatoria en su ciclo y por su comportamiento poco reactivo que facilita el manejo de la colonia, la especie más adecuada de las probadas en este estudio para la producción in vivo de N. locustae.

PALABRAS CLAVE. Acridios. Melanoplinae. Patógeno. Transmisión.

ABSTRACT. Nosema locustae Canning, an intracellular sporogenic pathogen of the fat body of orthopterans used for the biological control of grasshoppers, became established in some grasshopper communities of Argentina after its introduction more than 20 years ago. Following standard methods for counting spores per individual insect affected, the levels of spore production by N. locustae was measured for three species of grasshoppers naturally infected [ Dichroplus elongatus Giglio-Tos, Dichroplus pratensis Bruner, Baeacris punctulatus (Thunberg)], and for six species experimentally infected [ Dichroplus maculipennis Blanchard, Dichroplus schulzi Bruner, D. elongatus, B. punctulatus, Ronderosia bergi Stal, Schistocerca cancellata (Serville)]. The levels of sporulation were relatively high in all species of the subfamily Melanoplinae (mean values varied from 2 x 108 to 3,2 x 109), while the production of spores was rare (9,5 % of the infected individuals) and low (maximum of 9,6 x 106) in S. cancellata. There was no infection development in the Romaleidae grasshopper Elaeochlora viridicata (Serville). The values of sporulation reached by the melanoplines agree with the establishment of N. locustae in communities of grasshoppers in Argentina because a high availability of infective transmissible units (propagules) is a central factor for the transmission and persistence of a disease in a population of susceptible insects. Although the highest sporulation levels were reached in D. maculipennis, R. bergi appears to be, among the species used in this study, the best choice for in vivo production of N. locustae, because there is no obligatory embrionic diapause in its cycle, and its less reactive behaviour makes the handling of colony easier.

KEY WORDS. Acridians, Melanoplinae, pathogen, transmission.

INTRODUCCIÓN

El principal factor responsable de la emergencia o persistencia de una determinada enfermedad infecciosa en una población de insectos susceptibles es la capacidad de transmisión del agente etiológico involucrado (Anderson & May, 1981; Harper, 1987). Aunque son muchos, a su vez, los factores que en un sistema patógeno–huésped–ambiente gobiernan dicha capacidad, una alta producción de unidades infectivas transmisibles (propágulos) del agente infeccioso es uno de los elementos centrales (Andreadis, 1987).

Nosema locustae Canning es un patógeno intracelular esporogénico utilizado para el control biológico de acridios (Johnson, 1997; Lockwood et al., 1999). Infecta los adipositos del cuerpo graso, interfiriendo en el metabolismo intermedio del huésped y compitiendo con éste por reservas energéticas vitales. Aunque causa un aumento en las tasas de mortalidad (Lockwood & Debrey, 1990), dependiendo fundamentalmente de la susceptibilidad de la especie afectada y de la dosis recibida, los efectos suelen ser de tendencia debilitante y crónica, como ocurre con la mayoría de los protozoos patógenos de insectos (Brooks, 1988; Lange, 1996). Luego de ser introducido en nuestro país desde América del Norte para el control de tucuras hace poco más de 20 años, N. locustae se estableció en ciertas comunidades de acridios, operando como un enemigo natural adicional de algunas especies (Lange, 2002). Si bien la transmisión directa desde progenitores a la descendencia inmediata (vía vertical) es bien conocida para N. locustae (Raina et al.,1995), la principal ruta de transmisión es por ingestión de propágulos (esporos) (Henry, 1972). En efecto, esta vía horizontal de diseminación de un agente a nuevos huéspedes es particularmente efectiva para el caso de N. locustae, hecho que en gran medida posibilitó su desarrollo como agente de control. Hasta el presente, N. locustae fue diagnosticado en 14 especies de acridios del país (Lange & de Wysiecki, 1996; Lange, 2002). Dado que en los microsporidios no se ha demostrado la producción de toxinas (Maddox et al., 2000), conocer los niveles de producción de esporos es de importancia porque, por un lado, proveen una medida del grado de intensidad o severidad que puede alcanzar la enfermedad a nivel individual, dando una idea a su vez de la patogenecidad relativa respecto de cada especie y, por otro, sugieren las posibilidades de persistencia y dispersión de la dolencia a nivel poblacional, a través de la disponibilidad de nuevas unidades infectivas. Desde un punto de vista estrictamente aplicado, la relevancia radica en que se podría determinar cuál sería la especie huésped más adecuada para intentar la producción in vivo del patógeno en el país.

El objetivo central del estudio aquí presentado fue conocer los niveles de esporulación alcanzados por N. locustae en forma experimental en siete especies de acridios de la Argentina. También, determinar, para complementar y corroborar los resultados experimentales, los niveles de esporulación alcanzados en tres especies infectadas naturalmente.

MATERIAL Y MÉTODOS

Insectos. Para determinar los niveles naturales de esporulación de N. locustae se utilizaron ejemplares infectados de los melanoplinos (Acrididae: Melanoplinae) Baeacris punctulatus (Thunberg), Dichroplus elongatus Giglio–Tos y Dichroplus pratensis Bruner capturados con redes entomológicas en pastizales y pasturas en localidades del Este de La Pampa (Macachín, Santa Rosa, Eduardo Castex) y Oeste de Buenos Aires (Trenque Lauquen, América, Carhué), una de las dos zonas del país donde el patógeno se ha establecido (Lange & de Wysiecki, 1996; Lange, 2002). Las tres especies mencionadas son las que suelen hallarse infectadas con mayor frecuencia (Lange & de Wysiecki, 1999).

Para el estudio de los niveles de esporulación experimentales (inducidos en laboratorio) se utilizaron acridios provenientes de colonias de cría desarrolladas en los bioterios del Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores (UNLP – CONICET) a partir de insectos recolectados en distintas regiones del país. Para el inicio y mantenimiento de las colonias se siguieron los procedimientos generales descriptos por Henry (1985a). Se trabajó con siete especies: los melanoplinos B. punctulatus, D. elongatus, Dichroplus maculipennis Blanchard, Dichroplus schulzi Bruner y Ronderosia bergi Stal, la langosta Schistocerca cancellata (Serville) (Acrididae: Cyrtacanthacridinae) y el romaleido (Romaleidae: Romaleinae) Elaeochlora viridicata (Serville). Los lugares de captura de los insectos que originaron las colonias fueron campos naturales o cultivos en las inmediaciones de San Pedro en la provincia de Misiones (R. bergi), Coneta (D. schulzi) y Telaritos (S. cancellata) en Catamarca, Las Lomitas en Formosa (B. punctulatus, S. cancellata) y Brandsen (D. elongatus), Coronel Suárez (D. maculipennis) y Estación Bavio (Mansilla) (E. viridicata) en Buenos Aires.

La elección de los acridios utilizados para los estudios experimentales, que podría parecer arbitraria a primera vista considerando que se conocen unas 180 especies para la Argentina (Cigliano & Lange, 1998), surgió de compatibilizar las limitaciones inherentes a cualquier experimentación con organismos vivos (facilidad / dificultad de colonización de especies en bioterios) con las características propias de cada especie considerada (susceptibilidad conocida o potencial a la enfermedad, tamaño). Estudios previos realizados en América del Norte (Henry, 1969; Henry et al., 1973; Bomar et al., 1993) y en la Argentina (Lange & de Wysiecki, 1996, 1999; Lange, 1997, 2002) coincidían en señalar a los melanoplinos como de mayor susceptibilidad relativa que especies de otras subfamilias, siendo éste el motivo principal por el cual cinco de las especies utilizadas fueron Melanoplinae. En tal sentido, la evidencia a priori, inferida a partir de información proveniente de estudios en campo, sugería que D. elongatus, D. maculipennis y B. punctulatus eran probablemente las más susceptibles. Dado que las dos primeras no son de crianza sencilla por poseer diapausa embrionaria obligatoria (COPR, 1982; Cigliano & Lange, 1999) y la segunda, aunque sin diapausa obligatoria, es de tamaño relativamente pequeño (lo cual limitaría las cantidades producibles de esporos), se decidió extender los estudios a otras especies estrechamente relacionadas pero con características más adecuadas, pensando en simplificar las etapas necesarias a los efectos de maximizar los niveles de esporulación. Así, se optó por probar a R. bergi y D. schulzi, otros dos melanoplinos con posibilidad de desarrollo contínuo (sin diapausa embrionaria obligatoria) y tamaño intermedio que se conocen en el país (COPR, 1982; Turk & Barrera, 1979). También se tuvo en cuenta que las especies de melanoplinos constituyen la tercera parte del total de acridoideos conocidos para la Argentina, incluyendo a varias causantes de considerables pérdidas para el agro (Cigliano & Lange, 1998). El gran tamaño de E. viridicata y el hallazgo de otros romaleidos [ Diponthus argentinus Pictet, Zoniopoda tarsata (Serville)] naturalmente infectados (Lange, 2002), motivó ampliar las inoculaciones a tal especie, a pesar de la desventaja de poseer diapausa embrionaria obligatoria. Los criterios que guiaron la decisión de hacer pruebas también con S. cancellata fueron la falta de diapausa embrionaria, el gran tamaño y su importancia como plaga (Sánchez et al., 1997).

Patógeno. Los esporos de N. locustae utilizados para las inoculaciones experimentales fueron obtenidos de acridios naturalmente infectados capturados en localidades del Este de la provincia de La Pampa y el Oeste de Buenos Aires. Recientes estudios comparativos a nivel ultraestructural evidenciaron la homogeneidad morfológica de los esporos y estados del ciclo de desarrollo de N. locustae (merontes, esporontes, esporoblastos) prescindiendo del huésped en el cual se desarrolle (Sokolova & Lange, 2002). Se prepararon suspensiones esporales por homogenización de acridios enfermos en agua destilada de acuerdo a la metodología descripta por Lange & Henry (1996). La cuantificación de los esporos se hizo con un hemocitómetro, siguiendo el protocolo de Undeen & Vávra (1997).

Inoculaciones experimentales. Para la inducción de infecciones se siguió el método de inoculación experimental per os sobre ninfas de tercer estadio utilizado por Habtewold et al. (1995) y Lange et al. (2000). Un día antes de comenzar cada experimento, las ninfas fueron individualmente colocadas en pequeños frascos de vidrio (20 ml) con tapa de espuma de goma y desde ese momento se dejó de brindarles alimento. Luego del ayuno de 24 hs se les ofreció a cada individuo dentro del frasco un cebo (disco de lechuga de 5 mm de diámetro) impregnado en una de sus caras con 105 esporos. Sólo los insectos que ingirieron todo el disco se consideraron entonces tratados y el resto fue descartado. La dosis de N. locustae empleada y la edad de los acridios experimentales fueron elegidas con el criterio de compatibilizar el estudio con procedimientos estandarizados de amplia utilización (Henry, 1990; Habtewold et al., 1995). Inmediatamente después de consumir los cebos, las ninfas fueron transferidas, en grupos de 5 a 10 ejemplares, a tubos de cría de acetato transparente (Henry, 1985a) y dispuestos en ambientes con condiciones controladas (30 °C; 14 horas luz – 10 horas oscuridad; aproximadamente 40% HR). Fueron mantenidos hasta su muerte o terminación de la experiencia luego de 35 días de inoculados.

Cuantificación de los niveles de esporulación. Una vez diagnosticada la presencia de N. locustae por examen microscópico (contraste de fases, X400, X1000) de muestras del tejido adiposo con solución salina (Poinar & Thomas, 1984), cada insecto infectado fue homogenizado individualmente en 2,5 a 4 ml de agua destilada. La suspensión resultante fue purificada por repetidos filtrados y centrifugaciones (Lange & Henry, 1996) y los esporos fueron contados con un hemocitómetro (Undeen & Vávra, 1997). Para los conteos de los esporos producidos por ejemplar inoculado experimentalmente no se consideraron los individuos muertos antes de los 21 días posteriores al momento de inoculación pues estudios realizados por Henry (1985b) y observaciones previas propias mostraron que son despreciables las cantidades producidas durante las tres primeras semanas.

RESULTADOS

En las cinco especies de melanoplinos empleadas en las inoculaciones experimentales se alcanzaron niveles considerables de esporulación (Tabla 1). La esporulación máxima en un individuo (5,3 x 109) ocurrió en un ejemplar hembra de D. maculipennis y la mayor esporulación promedio (3,2 ± 0,29 x 109) también en las hembras de dicha especie. En las cinco especies, los promedios de producción de esporos de los huéspedes hembra fueron mayores que los de los machos. La esporulación promedio de los machos de D. maculipennis (1,8 ± 0,27 x 109) fue mayor que la esporulación promedio de las hembras de D. schulzi (1,2 ± 0,28 x 109) y D. elongatus (1,2 ± 0,44 x 109) e igual que la de las hembras de B. punctulatus y R. bergi. La mínima producción de esporos en un individuo fue 1,1 x 108 (hembra de B. punctulatus).

Tabla 1. Niveles experimentales de esporulación de Nosema locustae en ejemplares de cinco especies de acridios melanoplinos (Acrididae: Melanoplinae) de la Argentina.

En sólo dos ejemplares de S. cancellata se observó producción de esporos (n = 21) y en ambos casos la cantidad de propágulos fue muy baja (9,6 x 106 en una hembra y 6,4 x 106 en un macho). El resto de los ejemplares de S. cancellata no mostró formación de esporos, aunque sí existió desarrollo de infección, pues se observaron estados de desarrollo previos (merontes y esporontes diplocarióticos, algunos esporoblastos) característicos de N. locustae (Sokolova & Lange, 2002).

Elaechlora viridicata resultó refractaria (no susceptible) a N. locustae ya que la presencia del agente no se detectó en ninguno de los individuos tratados (n = 40) y tampoco se observaron signos o síntomas típicos de la dolencia (Lange, 2002) a lo largo de la experiencia.

El nivel de esporulación máximo (3,1 x 109) registrado a partir de infecciones naturales (Tabla 2) ocurrió en una hembra de D. pratensis. La esporulación máxima promedio (1,2 ± 3,3 x 109) se registró en las hembras de D. pratensis y D. elongatus.

Tabla 2. Niveles de esporulación de Nosema locustae en ejemplares naturalmente infectados de tres especies de melanoplinos (Acrididae: Melanoplinae).

DISCUSIÓN

El presente constituye el primer estudio en que se cuantifican las cantidades de esporos provenientes de infecciones producidas por N. locustae en individuos de especies argentinas de acridios. Las contribuciones previas sobre el tema se limitaron a establecer la susceptibilidad (desarrollo o no de infección) de algunas especies (Luna et al., 1981; Lange, 1997) y conocer ciertos efectos causados por la dolencia (Lange et al., 1999, 2000), pero en ninguna de ellas se midieron los niveles de esporulación alcanzados. Tal tipo de estudios fueron realizados en India y China utilizando el oedipodino (Acrididae: Oedipodinae) Locusta migratoria (Linn.) (Raina et al., 1987; Wang & Yu, 1994; Yan, 1997), en EE.UU. con los melanoplinos Melanoplus bivittatus (Say) y Melanoplus differentialis (Thomas) (Henry, 1985b) y en Australia con el Cyrtacanthacridinae Valanga irregularis Walker (Moulden & D'Antuono, 1984) (Tabla 3). Aunque los niveles obtenidos en las dos especies de Melanoplus (Henry, 1985b) y al menos en un caso en L. migratoria (Wang & Yu, 1994) son mayores que los aquí reportados para las cinco especies de melanoplinos, las cantidades alcanzadas en estas cinco son de todos modos considerables si se tiene en cuenta que Hildreth & Walgenbach (1990) estimaron que tan solo 5 X 103 esporos de N. locustae serían suficientes para producir infección (dosis infectiva) en el melanoplino neártico Melanoplus sanguinipes (Fabricius). Los niveles de esporulación experimentales alcanzados en las cinco especies argentinas de melanoplinos, sumado a las infecciones de similar intensidad registradas en condiciones naturales en areas de establecimiento del patógeno, confirman que la mayoría de las especies constituyentes de la subfamilia son substratos adecuados para el desarrollo de N. locustae. Este hecho explicaría en buena medida el establecimiento del patógeno en ciertas comunidades acridianas de nuestro país pues, como ya se mencionó, la alta disponibilidad de nuevas unidades infectivas es el requisito primordial para el mantenimiento de una enfermedad infecciosa en una población de insectos susceptibles (Andreadis, 1987).

Tabla 3. Niveles de esporulación experimentales de Nosema locustae en ejemplares de especies no argentinas de acridios (Acrididae).

Los resultados obtenidos a partir de las inoculaciones en S. cancellata parecen representar una respuesta intermedia entre la alta susceptibilidad de los melanoplinos y la aparente inmunidad innata de E. viridicata. A pesar de que ocurrió desarrollo de infección en S. cancellata, N. locustae llegó a esporular sólo en el 9,5% de los ejemplares infectados, haciéndolo además en niveles muy bajos, no acordes con el potencial esperable de una especie de gran tamaño. A diferencia de los melanoplinos, S. cancellata, si bien susceptible, no parece representar entonces una especie adecuada para la esporulación de N. locustae, hecho que reduciría grandemente la posibilidad de reciclado de la enfermedad en el hipotético escenario de su utilización a campo para el control de S. cancellata. Según Solter & Becnel (2000), es poco probable que ocurra transmisión cuando un patógeno se reproduce de manera subóptima en un huésped, precisamente de la manera que la pobre esporulación de N. locustae en S. cancellata parece sugerirlo.

Aunque se ha logrado la propagación de algunas especies de microsporidios de insectos en cultivos celulares (Jaronski, 1984; Kurtti & Munderloh, 1987; Kurtti et al.,1990), hasta el presente la producción en masa de esporos microsporidianos in vitro no ha resultado viable. Los intentos hechos en este sentido con N. locustae tampoco dieron resultados alentadores (Raina & Ewen, 1979). De este modo, no es posible apartarse aún de la metodología de producción clásica en insectos vivos, que fuera originalmente desarrollada y gradualmente optimizada por Henry (1985b) utilizando especies neárticas de melanoplinos. En principio, a juzgar por los niveles obtenidos en el presente estudio, cualquiera de las cinco especies de melanoplinos utilizadas podría ser apta para iniciar una producción de N. locustae, al menos en forma preliminar o en pequeña escala. Un emprendimiento de tal tipo debería quizás basarse en la utilización, como substrato, de las especies con posibilidad de desarrollo continuo R. bergi o B. punctulatus, empleando particularmente a las hembras, que promediaron 1,8 x 109 esporos por individuo. Dado que el principal factor limitante de la esporulación en microsporidios del cuerpo graso es el volumen de dicho órgano (Weiser, 1976), las hembras, que en los acridoideos son de mayor tamaño que los machos, suelen ser más productivas. Otra posibilidad sería la utilización de los machos y hembras de D. maculipennis, que son más productivos, pero la presencia de diapausa embrionaria obligatoria alarga sustancialmente los tiempos de cría. En este sentido, es posible obtener hasta cuatro generaciones de R. bergi bajo condiciones controladas en un año, pero no más de dos de D. maculipennis. Una ventaja adicional de R. bergi es que su comportamiento general, al menos en condiciones de bioterio, es también conveniente, pues es mucho menos reactiva que D. maculipennis, facilitando un manejo más sencillo y rápido de los insectos de la colonia.

AGRADECIMIENTOS

A la Comisión de Investigaciones Científicas (CIC) de la provincia de Buenos Aires, al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) (PIP 4015/96) y al Centro Argentino – Brasileño de Biotecnología (CABBIO) por el apoyo económico brindado.

BIBLIOGRAFÍA CITADA

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Recibido: 31-VII-2002
Aceptado: 21-I-2003

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