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Revista de la Sociedad Entomológica Argentina

versión impresa ISSN 0373-5680versión On-line ISSN 1851-7471

Rev. Soc. Entomol. Argent. v.67 n.3-4 Mendoza jul./dic. 2008

 

Caracteres moleculares para la determinación taxonómica de tres especies de Lutzomyia (Diptera: Psychodidae), vectores potenciales de Leishmania presentes en el valle de Aburrá, Colombia

Molecular characters for the taxonomic determination of three species of Lutzomyia (Diptera: Psychodidae), potential Leishmania vectors found in the Aburrá valley, Colombia

Alveiro Pérez-Doria*, Eduar Elías Bejarano*, Diana Sierra** e Iván Darío Vélez***

*Grupo de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Sucre, Carrera 14 No. 16 B-32, Apartado Aéreo 406, Sincelejo, Colombia; e-mail: eduarelias@yahoo.com
**Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, Central receiving 200 W, Lake Street Campus Delivery 1619, CO 80523, USA; e-mail: dsierra68@yahoo.com
***Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales, Universidad de Antioquia, Calle 62 No. 52-59, Apartado Aéreo 1226, Medellín, Colombia; e-mail: idvelez@udea.edu.co

RESUMEN: En Colombia están registradas 143 especies de Lutzomyia França, pero menos del 7% de éstas se encuentran incriminadas como vectores de Leishmania spp. Debido a la alta semejanza morfológica de algunas especies vectoras con otras no vectoras, se necesitan caracteres taxonómicos alternativos para identificar correctamente los flebotomíneos de cada zona geográfica del país. Con este objetivo, en el presente trabajo se secuenció el extremo 3' del gen mitocondrial que codifica para la proteína citocromo b en tres vectores potenciales de Leishmania presentes en el valle de Aburrá, Colombia, Lutzomyia hartmanni (Fairchild y Hertig), L. columbiana (Ristorcelli y Van Ty) y L. tihuiliensis Le Pont, Torrez-Espejo y Dujardin. A partir del alineamiento múltiple de nucleótidos se determinaron los sitios polimórficos, las distancias genéticas pareadas netas (p) y la entropía. Las secuencias de nucleótidos fueron trasladadas a aminoácidos para estimar el número de sustituciones sinónimas y no sinónimas. En el alineamiento múltiple de 321 nucleótidos del gen citocromo b de L. columbiana, L. hartmanni y L. tihuiliensis se detectaron 83 sustituciones. En la secuencia parcial de la proteína se encontraron 18 reemplazos de aminoácidos. Las distancias genéticas interespecíficas fluctuaron en un rango mínimo de 0,137 entre L. tihuiliensis y L. columbiana, y un máximo de 0,215 entre L. columbiana y L. hartmanni. Los polimorfismos detectados en la secuencia de nucleótidos del gen y de aminoácidos de la proteína constituyen caracteres moleculares potencialmente útiles para la determinación taxonómica de estas especies de flebotomíneos.

PALABRAS CLAVE: Psychodidae; Lutzomyia; Verrucarum; Helcocyrtomyia; Citocromo b; Colombia

ABSTRACT: To date, 143 species of Lutzomyia França are recorded in Colombia, but less than 7% is incriminated in the transmission of Leishmania spp. Alternative taxonomic characters are necessary to correctly identify the particular sand fly fauna in each Colombian region, and the separation of morphologically similar vector and non-vector species. In order to detect useful molecular characters for the taxonomic determination of three potential vectors of Leishmania present in the Valle de Aburrá, Colombia, the present work sequenced the 3' end of the mitochondrial cytochrome b gene in Lutzomyia hartmanni (Fairchild and Hertig), L. columbiana (Ristorcelli and Van Ty), and L. tihuiliensis Le Pont, Torrez-Espejo and Dujardin. Polymorphic sites, pairwise genetic distances (p), and entropy were determined from the multiple alignment of the nucleotide sequences. Numbers of silent and non silent substitutions were calculated from the amino acid sequences deduced from the nucleotide sequences of the gene. In the multiple alignment of the cytochrome b nucleotide sequences from Lutzomyia hartmanni, L. columbiana and L. tihuiliensis, 83 polymorphic sites were detected. A total of 18 amino acid replacements were found in the partial nucleotide sequences of the protein. Genetic distances varied from 0,137 between L. tihuiliensis and L. columbiana, to 0,215 among L. columbiana and L. hartmanni. Nucleotide and amino acid sequence polymorphisms within the cytochrome b gene and protein, respectively, constitute molecular characters potentially useful for the taxonomic determination of these sand fly species.

KEY WORDS: Psychodidae; Lutzomyia; Verrucarum; Helcocyrtomyia; Cytochrome b; Colombia.

Recibido: 07-08-2008;
Aceptado: 14-11-2008

INTRODUCCIÓN

El grupo de enfermedades conocidas como leishmaniasis son causadas por protozoos intracelulares obligados que pertenecen al género Leishmania Ross. En América, la transmisión de estos parásitos tripanosomatídeos ocurre a través de la picadura de dípteros hematófagos del género Lutzomyia França. En Colombia, este taxón está representado por 143 especies (Bejarano et al., 2006; Bejarano 2006; Cabrera et al., 2006; Flórez & Ferro, 2007), de las cuales, menos del 7% han sido incriminadas como vectores de Leishmania spp. (Montoya-Lerma & Ferro, 1999; Santamaría et al., 2006). La determinación taxonómica de especie, en los flebotomíneos, es importante porque en conjunto con sus antecedentes vectoriales, su bionomía y distribución geográfica, permite clasificar las zonas geográficas de acuerdo al riesgo epidemiológico que representan las especies allí presentes, lo que facilita el diseño y la implementación de medidas de control vectorial.
Por tradición, la descripción y determinación de miembros del género Lutzomyia se ha basado, casi exclusivamente, en las diferencias que presentan algunas estructuras ubicadas en la cabeza, el tórax y el abdomen del imago, las cuales han sido aceptadas como caracteres diagnósticos para la categorización del taxón en subgéneros, grupos, series, especies y subespecies (Young & Duncan, 1994; Galati, 2003). A pesar de la utilidad de estos caracteres anatómicos en la determinación taxonómica, el concepto morfológico de especie ha sido cuestionado por la aparente subjetividad a la que están expuestas las descripciones, las cuales resultan ambiguas o sutiles en algunos casos (Cazorla & Acosta, 2003). Adicionalmente, algunos taxones agrupan especies isomórficas e isométricas que no pueden ser diagnosticadas diferencialmente por los métodos convencionales, lo que constituye un reto para la taxonomía clásica.
Gracias al desarrollo de las técnicas de biología molecular se ha logrado acceder a una gran cantidad de datos moleculares que han aportado información básica para la resolución de conflictos taxonómicos (Beati et al., 2004). Los primeros estudios se desarrollaron con marcadores de tipo proteínico (Kreutzer et al., 1990; Lanzaro et al., 1993) y posteriormente con aplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como el análisis de los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLPs), análisis de los fragmentos de longitud polimórfica amplificados al azar (RAPDs) (Adamson et al., 1993), amplificación de fragmentos de longitud polimórfica (AFLP) y elementos de número variable repetidos en bloque (VNTR, STR y microsatélites) (Aransay et al., 2003). En la actualidad, las investigaciones se han enfocado en la secuenciación de genes mitocondriales, entre los cuales se destaca el gen citocromo b que es uno de los marcadores más empleados en el análisis genético de poblaciones y el estudio filogenético de especies de Lutzomyia (Esseghir et al., 1997; Ready et al., 1997; Ishikawa et al., 1999; Bejarano et al., 2002; Rojas et al., 2002; Testa et al., 2002; Hodgkinson et al., 2003; Pesson et al., 2004; Pérez-Doria et al., 2008).
A pesar de lo expuesto, los trabajos realizados con secuencias nucleotídicas en flebotomíneos no superan el 10% de la diversidad de especies conocidas en el planeta, lo que pone en evidencia la necesidad de continuar desarrollando investigaciones moleculares en este grupo de insectos vectores. El presente estudio, es parte del esfuerzo por caracterizar genéticamente las especies flebotomíneas presentes en Colombia, como parte de la búsqueda de herramientas alternativas que permitan superar las limitaciones de los caracteres morfológicos. Con este objetivo, se realizó una caracterización genética de tres potenciales vectores de Leishmania presentes en el valle de Aburrá, basados en la divergencia nucleotídica del extremo 3' del gen mitocondrial citocromo b. Aunque las especies seleccionadas pueden distinguirse entre sí con relativa facilidad, se caracterizan por pertenecer a grupos integrados por morfoespecies de difícil determinación taxonómica.

MATERIAL Y MÉTODOS

Recolección y determinación taxonómica de flebotomíneos. Se recolectaron especímenes de Lutzomyia tihuiliensis Le Pont, Torrez-Espejo y Dujardin, L. hartmanni (Fairchild y Hertig) y L. columbiana (Ristorcelli y Van Ty) con cebo humano protegido en un bosque secundario de la vereda El Vallano, municipio de Envigado (06° 08' N, 75° 34' W), valle de Aburrá, departamento de Antioquia, entre las 18:00 y las 22:00 h. Los individuos recolectados se transportaron secos hasta el Laboratorio de Entomología Médica del Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales - PECET. Cada espécimen se examinó bajo el estéreo-microscopio, revisando el patrón de coloración torácico y luego se diseccionó con una hoja de bisturí estéril, para separar la cabeza, el ala y los últimos segmentos del abdomen que alojan los órganos genitales.
Estas estructuras anatómicas fueron maceradas químicamente en lactofenol (ácido láctico/fenol, en proporción 1:1) durante 24 h, posteriormente, se fijaron sobre láminas portaobjeto usando el medio de Hoyer. La determinación de especie se realizó empleando las claves y descripciones pictóricas convencionales (Young & Duncan, 1994; Wolff & Galati, 2002; Galati, 2003; Bejarano et al., 2004). Los montajes entomológicos fueron depositados en la "Colección de Vectores y Hospedadores Intermediarios de Enfermedades Tropicales" (VHET) del Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales (PECET) de la Universidad de Antioquia en Medellín, Colombia.

Extracción, amplificación y secuenciación del ADN. A partir del tórax y los segmentos proximales del abdomen de cada espécimen se realizó una extracción del ADN total de acuerdo al protocolo descrito previamente (Collins et al., 1987) con los siguientes ajustes: maceración en 60 μl de la solución tampón de lisis (0,08 NaCl, 0,16 M Sacarosa, 0,06 M EDTA, 0,5% SDS, 0,1 M Tris-HCL a pH de 7.5), precipitación con 200 μl de etanol absoluto y resuspensión en 30 μl de agua ultrapura.
La amplificación del ADN se realizó mediante la técnica de PCR, utilizando el cebador delantero 5'-CA(T/C) ATTCAACC(A/T)GAATGATA-3' y el cebador reverso 5'-GGTA(C/T)(A/T)TTGCCTCGA(T/A) TTCG(T/A)TATGA-3' (Ready et al., 1997). La PCR fue llevada a cabo en 50 μl de mezcla de reacción que contenía solución tampón de PCR 10x (Promega Corporation, Madison, WI), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM de la mezcla de desoxirribonucleótidos (Promega), 0,3 μM de cada cebador, 1,5 U de Taq ADN polimerasa (Promega) y 6 μl de solución de ADN. Se usó un perfil térmico de amplificación de tres etapas: la primera, de desnaturalización a 94°C por tres minutos, la segunda, 35 ciclos: desnaturalización por un minuto a 90°C, alineamiento durante un minuto a 50°C y extensión a 72°C por un minuto. Finalmente, un ciclo de extensión terminal a 72°C durante diez minutos. Los productos de PCR fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de etidio (0,5 mg/ml) y se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta. Posteriormente, los amplificados se purificaron con Wizard® PCR Preps DNA Purification System Kit (Promega) y se secuenciaron, en ambos sentidos, con terminadores de cadena fluorescentes (Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, Applied Biosystems, Foster City, CA), en un equipo automático de electrofóresis capilar ABI Prism® 3730xl (Applied Biosystems).

Análisis de las secuencias. Con el programa Sequin ver. 7.6 del National Center for Biotechnology Information (NCBI), se recopiló la información descriptiva de cada secuencia, las cuales fueron sometidas a Genbank. El alineamiento múltiple de las secuencias se realizó con el programa Clustal W (Thompson et al., 1994) integrado en DAMBE 4.2.13 (Xia & Xie, 2001). Luego se determinaron los sitios polimórficos y las distancias genéticas pareadas netas (p). La distribución de la variabilidad genética a lo largo del alineamiento múltiple del gen citocromo b se evaluó infiriendo la entropía con el programa Bioedit (Hall, 1999), empleando la configuración predeterminada. Finalmente, las secuencias de nucleótidos fueron trasladadas a aminoácidos en el programa MEGA 3.1 (Kumar et al., 2004) con el propósito de identificar las sustituciones sinónimas y no sinónimas.

RESULTADOS

Un total de nueve hembras pertenecientes al género Lutzomyia fueron identificadas morfológicamente durante el presente trabajo, seis de L. columbiana, una de L. hartmanni y dos de L. tihuiliensis. A partir del material genético de estos especímenes se aislaron nueve secuencias nucleotídicas distribuidas en seis haplotipos. Los resultados del presente estudio constituyen el primer y único haplotipo nucleotídico conocido para L. hartmanni y L. tihuiliensis, así mismo, se registran cuatro nuevos haplotipos para L. columbiana (Fig. 1).


Fig. 1. Resumen del alineamiento múltiple de la secuencia parcial de nucleótidos del gen mitocondrial citocromo b de L. columbiana (haplotipos 1 al 4), L. tihuiliensis (haplotipo 5) y L. hartmanni (haplotipo 6). Haplotipo 1 = aislados Lcocenv1, Lcocenv2 y Lcocenv5, números de acceso en Genbank EF033636, EF033637 y EF033638, respectivamente. Haplotipo 2 = aislado Lcocenv3, número de acceso EF033639. Haplotipo 3 = aislado Lcocenv4, número de acceso EF033640. Haplotipo 4 = aislado Lcocenv6, número de acceso EF033641. Haplotipo 5 = aislados Lticenv1 y Lticenv2, números de acceso EF033647 y EF033648, respectivamente. Haplotipo 6 = aislado Lhacenv1, número de acceso EF033635. Los nucleótidos se representan con la primera letra del respectivo nombre. Posición del nucleótido: 1) primera posición, 2) segunda posición, 3) tercera posición. Sustituciones nucleotídicas: Transiciones (i: A<->G, C<->T), Transversiones (v: A<->C, A<->T, G<->C, G<->T). Tipo de sustituciones: sinónimas (S), no sinónimas (N).

La composición nucleotídica promedio del gen fue 32,53 % de adenina, 17,20 % de citosina, 9,31 % de guanina y 40,28 % de timina (Tabla I), consistente con lo informado para el genoma mitocondrial de insectos, que parece haberse especializado en la producción de aminoácidos hidrofóbicos tales como leucina (UUA/CUA/CUC/CUG/CUU=17,1%) e isoleucina (AUU/AUC=16,4%) (datos no mostrados), cuyos codones son ricos en adenina y uracilo.

Tabla I. Composición nucleotídica de la secuencia parcial del gen citocromo b de L. columbiana (haplotipos 1 al 4), L. tihuiliensis (haplotipo 5) y L. hartmanni (haplotipo 6).

Respecto al uso del codón, no se observaron diferencias significativas entre las distintas especies flebotomíneas. En el alineamiento múltiple de 321 pb del gen citocromo b de Lutzomyia columbiana, L. hartmanni y L. tihuiliensis (Fig. 1) se detectaron 83 diferencias nucleotídicas. Los 83 sitios variables polimórficos están representados por 37 sitios de una sola variante y 46 sitios parsimoniosamente informativos, 43 de dos variantes y tres de tres variantes. Al inferir la secuencia parcial de la proteína citocromo b (datos no mostrados), se encontraron 18 sustituciones aminoacídicas que denotaron una significativa divergencia interespecífica, especialmente al considerar que se trata de una secuencia codificadora de proteínas.
Más aún, en la longitud del extremo carboxilo terminal de la proteína citocromo b se detectaron importantes cambios entre especies. En Lutzomyia columbiana, el extremo 3' del gen homónimo tiene una longitud de 318 nucleótidos, que codifican para 105 aminoácidos y un codón de parada (UAA). A diferencia de esta especie, las secuencias homólogas de L. hartmanni y L. tihuiliensis codifican un aminoácido adicional, extendiéndose hasta el nucleótido 321. En L. tihuiliensis, el nucleótido 316 está representado por una citosina, conformando el triplete CAA que codifica para el aminoácido glutamina, lo que aumenta a 106 el número de aminoácidos del fragmento proteínico. Similarmente, la posición 318 en L. hartmanni es ocupada por una timina, constituyendo el codón UAU que codifica para el aminoácido adicional tirosina (Fig. 1). Estos hallazgos demuestran la existencia de diferencias moleculares, tanto en la secuencia del gen como en la proteína, que presentan potencial utilidad taxonómica para el género Lutzomyia.
Los valores de las distancias genéticas pareadas (p) calculadas al interior de las distintas especies, oscilaron entre 0 y 0,006 para el caso de Lutzomyia tihuiliensis y L. columbiana, respectivamente. En contraste, los valores interespecíficos fluctuaron en un rango mínimo de 0,137 entre L. tihuiliensis y L. columbiana, y un máximo de 0,215 entre L. columbiana y L. hartmanni (Fig. 2).
La entropía, en el alineamiento múltiple del gen citocromo b, muestra que la variabilidad genética está uniformente distribuida a lo largo de la secuencia de nucleótidos, salvo por la ausencia de polimorfismo entre las posiciones 52-65 y 155-170 (Fig. 3).


Fig. 2. Distancias genéticas pareadas (p) derivadas de la secuencia parcial de nucleótidos del gen citocromo b de L. columbiana (haplotipos 1 al 4), L. tihuiliensis (haplotipo 5) y L. hartmanni (haplotipo 6).


Fig. 3. Distribución y frecuencia del polimorfismo genético en las 321 posiciones del alineamiento múltiple de la secuencia nucleotídica parcial del gen citocromo b de L. columbiana, L. tihuiliensis y L. hartmanni.

DISCUSIÓN

El interés biomédico en caracterizar las especies flebotomíneas desde el punto de vista genético se origina en la necesidad de encontrar una herramienta que garantice una correcta determinación de especie, la cual resulta esencial para comprender la ecoepidemiología de la leishmaniasis. Es importante destacar que aunque hasta la fecha no existen registros de casos autóctonos de la enfermedad en el valle de Aburrá, las tres especies encontradas en el área poseen antecedentes epidemiológicos. Lutzomyia hartmanni es un vector comprobado de Leishmania colombiensis (Kreutzer et al., 1991) y L. columbiana es considerada como un transmisor potencial de Leishmania mexicana (Kreutzer et al., 1991; Montoya-Lerma et al., 1999). Del mismo modo, L. tihuiliensis es un probable vector de Leishmania en Bolivia y Perú (Le Pont et al., 1997; Cáceres et al., 2001).
Desde el punto de vista de la taxonomía clásica, Lutzomyia columbiana y L. tihuiliensis son incluidas en series diferentes del grupo verrucarum. L. columbiana pertenece a la serie verrucarum caracterizada por agrupar especies que poseen dos espinas mediales pareadas y dos distales en el estilo, con espermatecas estriadas en forma de saco; mientras que L. tihuiliensis se incluye en la serie pia que reúne especies que presentan cinco espinas entre la región media y distal del estilo, y cuyas espermatecas exhiben un prominente botón terminal liso de bordes casi rectos. Al comparar los dos taxones desde el punto de vista genético, se observan distancias pareadas que oscilan entre 0,137 y 0,143, divergencia molecular que es consistente con la diversidad morfológica antes descrita. Los valores obtenidos al confrontar estas especies son similares a los encontrados entre otros miembros del grupo verrucarum, de los que se dispone de secuencias homólogas en Genbank, y que oscilan entre 0,111-0,137, 0,111-0,152 y 0,127, para los pares de especies L. evansi/ L. ovallesi, L. ovallesi/ L. columbiana y L. spinicrassa/ L. ovallesi, respectivamente (Rojas et al., 2002). Estos resultados ratifican la utilidad del marcador citocromo b para la determinación genética de especies de flebotomíneos.
Al confrontar la morfología de las estructuras anatómicas de Lutzomyia hartmanni, agrupada en el subgénero Helcocyrtomyia Barreto, con los taxones anteriores, se aprecian considerables diferencias interespecíficas. Mientras que las hembras del grupo verrucarum exhiben espermatecas estriadas en forma de saco, en L. hartmanni estas estructuras son alargadas y con anulaciones completas. Tal diversidad morfológica resulta consistente con la divergencia observada en sus distancias genéticas, que arrojó los valores más altos obtenidos en este estudio, correspondiendo 0,210 entre L. hartmanni y L. columbiana y 0,168 entre L. hartmanni y L. tihuiliensis. Estas cifras superan ampliamente las distancias genéticas interespecíficas que se presentan al interior de grupo verrucarum, mostrando una notable diferenciación subgenérica de L. hartmanni, que está de acuerdo con la propuesta taxonómica de Young & Duncan (1994). Los presentes resultados permiten preliminarmente establecer intervalos interespecíficos característicos de diferentes grupos taxonómicos del género Lutzomyia, constituyendo referentes genéticos para el diagnóstico de especies basado en caracteres moleculares.
La diversidad genética que exhiben estas especies también se refleja en la presencia de un aminoácido adicional, en el extremo 3' de la proteína citocromo b en Lutzomyia hartmanni y L. tihuiliensis, respecto a L. columbiana que carece del mismo. Es probable que la ausencia de este aminoácido en L. columbiana corresponda al estado derivado de un carácter, que evolucionó independientemente en diferentes linajes terminales luego de la separación del ancestro del grupo verrucarum y el subgénero Helcocyrtomyia. Lo anterior está respaldado por el hallazgo de tales diferencias entre especies del mismo taxón como L. columbiana y L. ovallesi del grupo verrucarum, y de grupos diferentes como L. hartmanni y L. pia (Fairchild & Hertig).
Es importante señalar además, que en las secuencias de L. columbiana aparecieron dos codones de parada consecutivos; se plantea que en algunos animales este hecho puede estar relacionado con una reconfirmación de la señal de terminación durante la síntesis de algunas proteínas. Al realizar la traducción a proteínas de la secuencia parcial del gen citocromo b de los flebotomíneos del valle de Aburrá, se evidenciaron 18 sustituciones aminoacídicas, a pesar de las 83 diferencias que se encuentran en su secuencia nucleotídica. Estos resultados están de acuerdo con lo esperado para regiones codificadoras de proteínas, las cuales se caracterizan por presentar una alta tasa de mutación neutral. Del mismo modo, la teoría de la deriva genética plantea que la mayoría de la variación a nivel molecular tiene poco efecto sobre la generación, dado que las diferencias en segundas y terceras posiciones del codón en una secuencia, no implican necesariamente cambios en la proteína (Futuyma, 1998).
Al analizar las características químicas de los aminoácidos implicados en las sustituciones no sinónimas, se determinó que la mayoría fueron de la misma naturaleza eléctrica. No obstante, se encontraron sustituciones no sinónimas que involucraron aminoácidos que difieren en su naturaleza eléctrica, tal es el caso de la metionina ubicada en la posición 73 del segmento proteínico, la cual es reemplazada en L. hartmanni por treonina. Lo mismo se observa en la posición 102, ocupada por el ácido glutámico, que es reemplazado por el aminoácido lisina de carácter básico; diferencias que podrían conducir a cambios en la configuración tridimensional de la proteína.
La utilidad potencial de este estudio responde no sólo a la necesidad de diferenciar las especies en la zona de estudio, sino también a las dificultades derivadas del isomorfismo que éstas presentan en el interior de sus correspondientes grupos. En este sentido se aprecia que Lutzomyia tihuilienis muestra isometría e isomorfismo con L. pia y sólo puede ser diferenciada por un detalle sutil en la pleura, la cual es totalmente pigmentada en L. pia, mientras que en L. tihuiliensis la pigmentación está restringida a la porción basal del catepímero y catepisterno. Es probable que por esta razón haya sido informada inicialmente como L. pia en el país (Agudelo et al., 2002).
Sin embargo, los análisis morfológicos y moleculares basados en la pigmentación de la pleura y los genes mitocondriales soportan su estatus específico, demostrando correspondencia entre la morfología y los caracteres moleculares (Bejarano et al., 2006; Pérez-Doria et al., 2008). Se debe destacar que pese a los informes previos de introgresión en otras morfoespecies del grupo verrucarum, como L. youngi Feliciangeli y Murillo y L. townsendi Ortiz (Testa et al., 2002), el gen citocromo b ha demostrado su eficacia en la discriminación de L. tihuiliensis y L. pia.
Un caso similar ocurre entre Lutzomyia columbiana y L. disiuncta Morales, Osorno y Osorno-Mesa, dos miembros de la serie verrucarum del grupo verrucarum, cuyas hembras no presentan rasgos morfológicos diferenciales. A pesar de ello, en este estudio se pudo confirmar molecularmente la identidad específica de L. columbiana gracias al análisis genético, que permitió asociar correctamente las secuencias obtenidas de los especímenes recolectados en el valle de Aburrá, con una secuencia aislada a partir de un individuo de L. columbiana (numero de acceso AF403485) capturado en La Cumbre, valle del Cauca; localidad donde se constató la presencia de machos de esta especie (Rojas et al., 2002).
Las distancias genéticas obtenidas entre estos aislados oscilaron entre 0 y 0,066, lo cual revela una variación intraespecífica típica de flebotomíneos, comparable a la observada entre poblaciones colombianas de L. evansi (Bejarano et al., 2002). Los valores de divergencia genética intraespecífica de L. columbiana inferiores al 1% corroboran la eficacia del gen citocromo b, al asociar correctamente individuos de un mismo taxón procedentes de localidades geográficas distantes. Por su tasa de mutación, este gen podría ser tan útil como el gen citocromo oxidasa I (denominado el "código de barras de ADN") para caracterizar la diversidad de la subfamilia Phlebotominae. Considerando lo anterior, el gen citocromo b debería tenerse en cuenta al momento de escoger un marcador molecular para distinguir especies del género Lutzomyia.

AGRADECIMIENTOS

A Boris René Zuleta por su ayuda con el trabajo de campo en Antioquia. Este trabajo fue financiado por la Fundación para la Promoción de la Investigación y la Tecnología del Banco de la República (código no. 1606).

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