FORO

Wolbachia, una pandemia con posibilidades

Wolbachia, a pandemic with potential

 

Rodriguero, Marcela S.

Departamento de Ecología, Genética y Evolución, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, IEGEBA (CONICET-UBA), Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. rodriguero@ege.fcen.uba.ar

 

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RESUMEN. La infección causada por Wolbachia es la más extendida entre los animales. La capacidad de esta bacteria para manipular la reproducción de sus hospedadores la posicionan en el centro de la biología de los organismos, influyendo en procesos tan capitales como la determinación del sexo, el ciclo celular, la formación y extinción de especies y el comportamiento de artrópodos entre los que se cuentan varias plagas y vectores de enfermedades. Cualidades tales como la herencia vertical de Wolbachia, la velocidad a la que se propaga en las poblaciones que afecta, la capacidad de bloquear la actividad patogénica de diversos microorganismos o de acortar el ciclo de vida de sus hospedadores la señalan como un potencial instrumento para el control de poblaciones de insectos y nematodos perjudiciales. ¿Cuáles son las posibilidades que nos ofrece esta pandemia?

En la presente contribución se presenta una revisión de los aspectos fundamentales de esta infección y sus implicancias prácticas para el manejo de insectos plaga. Esta revisión está basada en el simposio del mismo nombre acontecido en el VIII Congreso Argentino de Entomología.

PALABRAS CLAVE: Wolbachia; Pandemia; Transferencia horizontal; Técnica del insecto incompatible; Incompatibilidad citoplasmática; Partenogénesis telitóquica; Feminización; Androcidio; Parásito reproductivo.

ABSTRACT. Wolbachia infection is the most widespread in animals. Its ability to manipulate insect reproduction places it at the center of organismal biology, affecting such important processes like sex determination, cell cycle, generation and extinction of species and behaviour of arthropods, including several pest and disease vector insects. Attributes like vertical transmission, the speed at which it drives in the population, the ability to block the pathogenic activity of several microorganisms and the ability to shorten the lifespan of its host point to this bacterium as a potential tool to control harmful insects and nematodes. What are the possibilities offered by this pandemic?

In the present work a detailed and updated review of the main aspects of this infection is presented, as well as the practical implications for managing pest and disease vector insects and nematodes. This review is based on the symposium of the same title held in the VIII Argentinean Meeting of Entomology.

KEYWORDS: Wolbachia; Pandemic; Horizontal Transfer; Incompatible Insect Technique; Cytoplasmic Incompatibility; Thelytokous Parthenogenesis, Feminization; Male Killing; Reproductive Parasite.

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El género Wolbachia está integrado por bacterias gram-negativas intracelulares obligadas de transmisión maternal (= vertical) que infectan a artrópodos y nematodes (Werren et al., 1995b). Este género pertenece a la familia Anaplasmataceae, orden Rickettsiales, subdivisión α2 de la clase Proteobacteria.

Como no pueden vivir fuera del ambiente celular, estas bacterias se consideran endosimbiontes. En los artrópodos se localizan principalmente en las gónadas y son capaces de inducir alteraciones en la reproducción de sus hospedadores que producen un incremento de su frecuencia en la población, por lo que se las considera parásitos reproductivos (Werren et al., 1995b). Por el contrario, en los nematodes se comportan como mutualistas.

Wolbachia (como se la conoce en la literatura especializada y como la llamaremos de aquí en más) constituye la pandemia más grande desde el origen de la vida y es la bacteria más abundante, más diversa y más versátil de toda la biota (Werren et al., 2008). Sus sorprendentes características la han colocado en un sitio de honor en la investigación biológica, no solo básica, sino también aplicada, ya que posee varias propiedades que la señalan como una potencial herramienta para el control de poblaciones de insectos plaga y vectores de enfermedades (Brelsfoard & Dobson, 2009). Por eso, Wolbachia se presenta como una alternativa novedosa para combinar con otras estrategias ya existentes como el control genético para el manejo integrado de insectos nocivos de una manera amigable con el ambiente.

1.- Breve cronología de los hechos que condujeron al descubrimiento de Wolbachia

La especie tipo del género Wolbachia fue descrita por Samuel Wolbach y Marshall Hertig en 1924 como una rickettsia que residía en los ovarios del mosquito Culex pipiens (Hertig & Wolbach, 1924). Pasaron doce años hasta que Hertig (1936) la bautizó "Wolbachia pipientis" en honor a su mentor (nombre genérico) y al hospedador de la bacteria (epíteto específico).

En la década del '50, los investigadores Ghelelovitch (1952) y Laven (1951, 1959) descubrieron que ciertos cruzamientos entre individuos de C. pipiens resultaban incompatibles (i.e. la progenie era escasa o nula). Laven (1959, 1967) concluyó que el factor causante de esta incompatibilidad exhibía un patrón de herencia citoplasmática (i.e. herencia a través de las hembras). Este tipo de esterilidad se conoce como incompatibilidad citoplasmática. En la década del '70 Yen & Barr (1971) lograron una conexión formal entre los descubrimientos de Hertig y Wolbach y los de de Laven y Ghelelovitch, al establecer que Wolbachia pipientis era la causa de las incompatibilidades en los cruzamientos entre machos infectados y hembras no infectadas de C. pipiens. Mediante un experimento consistente en la administración de antibióticos a los hospedadores para eliminar al microbio (Wolbachia es sensible a los antibióticos tetraciclina y rifampicina, y tambien a las altas temperaturas), Yen & Barr (1971) determinaron que los huevos no infectados fertilizados por el esperma de machos infectados morían. Pero curada la infección, la incompatibilidad desaparecía.

Desde los '70 hasta entrados los '90 prácticamente nadie se ocupó de resolver si Wolbachia pipientis intervenía de algún modo en la incompatibilidad reproductiva de C. pipiens, debido a que no es fácil trabajar con esta bacteria, ya que su naturaleza endosimbiótica hace imposible cultivarla. La solución a este problema llegaría a mediados de la década del '80 cuando se desarrollaron dos métodos que revolucionaron la Biología Molecular. Uno de ellos fue la Reacción en Cadena de la Polimerasa (técnica más conocida como "PCR" por sus siglas en inglés), que permite obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular. El otro método fue la secuenciación de fragmentos de ADN (técnicas de Sanger y de Maxam y Gilbert), que permitió la caracterización de las cepas de Wolbachia mediante su análisis filogenético. Estos avances tecnológicos reavivaron el interés por esta bacteria, al vislumbrarse que el fenómeno observado en C. pipiens se extendía a otras especies (Werren et al., 1995a).

2.- Abundancia de Wolbachia

Al convertirse la técnica de PCR en una rutina de laboratorio, se comprobó la presencia de Wolbachia al menos en el 17% de los insectos neotropicales (Werren et al., 1995a). Fue detectada en los principales órdenes de insectos, incluyendo Coleoptera, Diptera, Hemiptera/Homoptera, Hymenoptera, Lepidoptera y Orthoptera. Relevamientos subsiguientes al trabajo seminal de Werren et al. (1995a) demostraron que los hospedadores de Wolbachia no estaban restringidos solo a los insectos. También infecta arácnidos (e.g. Baldo et al., 2007), hexápodos primitivos como los colémbolos (Vandekerckhove et al., 1999), crustáceos como los isópodos terrestres (Bouchon et al., 1998; Cordaux et al., 2001; Cordaux et al., 2012), anfípodos (Cordaux et al., 2001, 2012), ostrácodos no marinos (Baltanás et al., 2007) y cirripedios (Cordaux et al., 2012), nematodes filariales de importancia médica y veterinaria (Sironi et al., 1995; Taylor et al., 1999) y algunos nematodes no filariales (Tsai et al., 2007; Haegeman et al., 2009).

Según recientes meta-análisis, la infección por Wolbachia está presente en el 40% de las especies de insectos (Zug & Hammertein, 2012), el 45% de las especies de ácaros (Breeuwer & Jacobs, 1996), el 35% de las especies de isópodos terrestres (Bouchon et al., 1998; Cordaux et al., 2001) y el 47% de los nematodes filariales (Ferri et al., 2011).

3.- Diversidad de Wolbachia

El estudio de múltiples cepas que infectan a distintos hospedadores permitió describir la enorme diversidad de Wolbachia. El análisis filogenético de diversas regiones de su genoma permitió dividir al género en varios supergrupos (grupos de cepas relacionadas filogenéticamente) llamados arbitrariamente A-N (Fig. 1). Los supergrupos A y B infectan artrópodos en forma exclusiva (Werren et al., 1995a, b), mientras que los supergrupos C y D son específicos de los nematodes filariales (Bandi et al., 1998). Además se han descripto algunos supergrupos menos abundantes como el E, que infecta a colémbolos (Vandekerckhove et al., 1999); el F, único que infecta tanto a artrópodos como a nematodes filariales (Baldo et al., 2007); el G, que infecta a un grupo de arañas australianas y a un nematode no filarial (Rowley et al., 2004; Tsai et al., 2007) y el H, que infecta a un género de termitas (Bordenstein & Rosengaus, 2007). Recientemente se han adicionado el supergrupo I, que se encuentra en las pulgas (Augustinos et al., 2011); el J, en nematodes filariales (Augustinos et al., 2011); el K, en ácaros araña (Ros et al., 2009); el L, que se localiza en un nematode parásito de plantas (Haegeman et al., 2009); y los supergrupos M y N, que infectan áfidos (Augustinos et al., 2011). Esta clasificación no está exenta de controversias: aún falta estudiar con mayor profundidad algunos agrupamientos (Haegeman et al.,2009; Ros et al. 2009; Augustinos et al., 2011), mientras que otros podrían ser artificiales debido a la frecuente ocurrencia de eventos de recombinación intragénica e intergénica que experimentan las cepas de Wolbachia, como se sospecha del supergrupo G (Baldo & Werren, 2007).

Fig. 1. Arbol filogenético no enraizado de los principales supergrupos de Wolbachia según lo ilustraron Werren et al. (2008). El supegrupo G se ha removido porque podría ser espurio. La diversidad filogenética adicional representada por estos autores actualmente se engloba en los supegrupos I (pulgas) y J (nematodes filariales). Los grupos determinados con posterioridad a Werren et al. (2008) no se han graficado. Crédito de la figura: John Werren, Laura Baldo y Michael Clark.

4.- Transmisión materna de Wolbachia

Para explicar la permanencia de una infección en un hospedador a través de tiempos evolutivos es necesario invocar alguna de estas alternativas: parasitismo reproductivo, que implica un aumento de la frecuencia de la infección en el tiempo y en el espacio a través de la manipulación de la reproducción del hospedador, o mutualismo, que implica un beneficio directo al organismo que actúa como "alojamiento" (Werren et al., 2008). Cualquiera de estas trayectorias evolutivas evitará la pérdida de la infección, ya que en términos de fitness, no resulta económico "mantener" durante muchas generaciones a un organismo neutro.

Wolbachia se transmite por vía maternal o vertical: la bacteria es transferida de madres a hijos, independientemente del sexo de la descendencia, por medio del citoplasma del huevo. Por lo tanto, los "intereses reproductivos" de Wolbachia se relacionan únicamente con los hospedadores de sexo femenino (Hurst & Randerson, 2002).

Como el sexo masculino impide la transferencia de la bacteria entre dos generaciones de individuos (o sea, de padres a hijos e hijas), representa un "callejón sin salida" evolutivo para Wolbachia. Sin embargo, mediante la alteración de la reproducción de sus portadores, Wolbachia incrementa la cantidad de individuos que tienen la capacidad de transmitirla (i.e. hembras infectadas). El arsenal por medio del cual Wolbachia manipula a sus hospedadores incluye las siguientes estrategias i) androcidio o matanza masculina; ii) feminización; iii) partenogénesis telitóquica; iv) incompatibilidad citoplasmática (véase Werren et al., 2008 y Engelstädter & Hurst, 2009). Justamente el vínculo de Wolbachia con el sistema reproductivo y las estrategias puestas en práctica para evitar el callejón sin salida que representan los machos le han hecho merecedora del mote de "titiritera del sexo" (Hurst & Randerson, 2002).

5.- Versatilidad de Wolbachia

Las alteraciones reproductivas que induce Wolbachia otorgan una ventaja a las hembras infectadas sobre los individuos no involucrados en la transmisión (hembras no infectadas y machos). Este comportamiento ha señalado a Wolbachia como un elemento genético egoísta. Por lo tanto, cualquier variante bacteriana que

i) induzca a las hembras infectadas a producir más hijas que las no infectadas,

ii) produzca hijas que tengan más chances de sobrevivir,

será capaz de invadir las poblaciones no infectadas y expandirse.

Existen dos tipos de alteraciones reproductivas producidas por Wolbachia: las estrategias que distorsionan la relación de sexos (de una relación 1:1 se pasa a una relación en la que los individuos del sexo femenino son mayoría), y las que no lo hacen. En este último caso, la cantidad de hembras infectadas supera ampliamente a las que no lo están. El primer grupo incluye la partenogénesis telitóquica (de aquí en más PT; los huevos no fertilizados se desarrollan dando lugar a individuos del sexo femenino), el androcidio o matanza masculina (muerte de las larvas o de los embriones masculinos en aquellas especies en las que el canibalismo aumenta la posibilidad de supervivencia de las hermanas) y la feminización (la reproducción sexual persiste, pero aquellos individuos que se desarrollarían como machos en condiciones normales, lo hacen como hembras). En el segundo grupo se encuentra la incompatibilidad citoplasmática (de aquí en más IC), que es la alteración reproductiva más extendida entre los artrópodos. En este caso, el esperma de los machos infectados causa la esterilidad de las hembras que no portan la infección.

Existen algunas cepas que no inducen anormalidades reproductivas en sus hospedadores, que sin embargo pueden invadir a las poblaciones y expandirse con éxito. En estos casos Wolbachia establece relaciones mediadas por el "trueque de utilidades" en artrópodos, como la producción de vitaminas (Hosokawa et al., 2010) o nutrientes (Brownlie et al., 2009) y la resistencia contra patógenos (Hedges et al., 2008; Teixeira et al., 2008; Osborne et al., 2009; van den Hurk et al., 2012). Adicionalmente, Wolbachia aumenta la fecundidad de diversas especies (e.g. Vavre et al., 1999) e interviene en la ovogénesis (Dedeine et al., 2001).

Considerando que más del 40% de los insectos están infectados con Wolbachia, es probable que el mutualismo nutricional y los efectos beneficiosos en la fecundidad y en la resistencia a enfermedades no sean meras excepciones, sino una regla que espera ser descubierta y formulada.

Tanto el parasitismo reproductivo como el mutualismo, ya sea nutricional o de cualquier otro tipo, explican la persistencia de Wolbachia en una misma especie. ¿Pero de qué manera esta epidemia se transformó en una pandemia? La respuesta a este enigma subyace en la transferencia horizontal de cepas entre hospedadores no relacionados, un fenómeno muy frecuente (Werren et al., 1995b).

6.- Wolbachia y la conquista del phylum Arthropoda: de epidemia a pandemia

La incongruencia entre las filogenias de hospedadores y endosimbiontes observada inicialmente por Werren et al. (1995b) sugirió indirectamente que la amplia distribución de Wolbachia en artrópodos se debía claramente a la transmisión horizontal. Pero… ¿cómo pasa una entidad bacteriana de una especie hospedadora a otra? Uno de los posibles "vehículos" propuestos para la transmisión intertaxónica podría ser el parasitismo (parasitoides, parásitos foréticos como los ácaros o endoparásitos como los nematodes). De ello se desprende que tales parásitos y sus artrópodos hospedadores deberían compartir linajes de Wolbachia estrechamente emparentados. Solo se han encontrado evidencias a favor de los dos primeros de los casos mencionados (Werren et al., 1995b; Vavre et al., 1999; Cordaux et al., 2001).

Otras rutas potenciales de intercambio podrían incluir predadores, presas y competidores asociados (Werren, 1997). En un principio se creía que la posibilidad de que Wolbachia no sobreviviera al pasaje por el tracto digestivo era elevada (Cordaux et al., 2001). Pero recientemente se demostró su presencia en varios órganos de las especies de bicho bolita armadillidium vulgare and Porcellio dilatatus dilatatus, inicialmente no infectados, después de devorar especímenes de A. vulgare infectados con Wolbachia (Le Clec'h et al., 2013).

Meta-análisis recientes han revelado que el ambiente ecológico constituiría un factor explicativo de suma importancia en la transferencia horizontal de Wolbachia, pero el parentesco filogenético no lo sería menos (Simoes et al., 2012).

8.- ¿Por qué Wolbachia es la bacteria más abundante, diversa y versátil de toda la biota?

Wolbachia es la bacteria más abundante del planeta por su mecanismo de transmisión vertical, que asegura la expansión de la infección en el tiempo y en el espacio dentro de una misma especie, pero también por sus capacidades para transferirse horizontalmente y pasar desapercibida para el sistema inmune del hospedador (Bourtzis et al., 2000), lo que posibilita la expansión de la infección a otras muchas especies, convirtiendo la epidemia inicial en una pandemia global (Werren, 1997). Además, los fenómenos de recombinación, y la presencia de fagos y de secuencias de inserción, que señalan un genoma extraordinariamente dinámico, posibilitan el aumento de la diversidad genética (Baldo et al., 2005). La capacidad de inducir diferentes fenotipos, ya sea como parásito reproductivo o como mutualista, demuestra la gran versatilidad de esta bacteria. Veamos ahora cuales son estos fenotipos…

8.1.- Incompatibilidad citoplasmática

La IC es un defecto post-fertilización en la cromatina que resulta en altos niveles de muerte embrionaria y promueve el esparcimiento de Wolbachia. Es la alteración más común en los artrópodos (Engelstädter & Hurst, 2009). Su amplia distribución sugiere que Wolbachia adquirió esta capacidad varias veces durante su evolución en los artrópodos (Werren et al., 1995b).

Un cruzamiento resulta incompatible cuando un macho infectado se cruza con una hembra no infectada, lo que determina la muerte del embrión en desarrollo: el cruzamiento fue incompatible. Por el contrario, el cruzamiento entre un macho sano y una hembra infectada y el cruzamiento entre dos individuos infectados con la misma cepa son totalmente compatibles.

Mediante esta alteración reproductiva, Wolbachia elimina las hembras no infectadas: la esterilidad de los machos infectados que se cruzan con hembras que carecen de la bacteria determinará que no nazcan individuos no infectados, y así la proporción de la progenie que no posee la bacteria irá disminuyendo con el correr del tiempo. Este tipo de incompatibilidad recibe el nombre de unidireccional (ICU), puesto que los apareamientos son incompatibles en un único sentido: hembra sana y macho infectado; el cruzamiento entre una hembra infectada y un macho sano resulta compatible (Werren et al., 2008; Engelstädter & Hurst, 2009).

Por otro lado, si el macho y la hembra que se cruzan poseen dos cepas diferentes de Wolbachia, por ejemplo w1 y w2, el apareamiento es incompatible en ambas direcciones, aún cuando estos individuos pertenezcan a la misma especie y sean totalmente compatibles en ausencia de la infección. En este caso se habla de la incompatibilidad citoplasmática bidireccional (ICB), ya que ambas direcciones del cruzamiento (hembra w1 con machos w2 y hembra w2 con machos w1) resultan en abortos masivos. Para un resumen actual del estado del arte de esta alteración, véase LePage & Bordenstein (2013).

8.2.- Androcidio o Matanza masculina

En las especies de artrópodos que presentan esta alteración reproductiva, los machos mueren en una etapa temprana del desarrollo embrionario, a menudo antes de la eclosión de los huevos. La evolución del androcidio es una adaptación muy importante si las hembras de una especie obtienen un beneficio directo de la muerte de los machos, por ejemplo la posibilidad de alimentarse de los cadáveres de esos machos y mejorar su crecimiento, o de reducir o evitar el canibalismo entre hembras. Así, la muerte del macho hospedador aumenta las chances de supervivencia de sus hermanas, que aunque comparten la misma bacteria, son las únicas que pueden transmitirla a la siguiente generación.

Wolbachia tiene que ser capaz de reconocer el sexo de los embriones, porque la muerte ocurre de manera selectiva. Pero aún no se conoce ni el mecanismo por el que las bacterias reconocen el sexo de los embriones, ni la manera en la que ocurre la matanza (Hurst & Jiggins, 2000).

8.3.-Feminización

La feminización es un fenómeno por el cual un macho genético es convertido en una hembra funcional. Mediante esta alteración las hembras infectadas producen hasta un 90% de individuos del sexo femenino, aunque genéticamente muchas de ellas sean machos, permitiendo que su citoplasma sea transmitido al doble de las nietas a las que se transmitiría bajo condiciones normales (o sea, sin infección). Como consecuencia, la frecuencia relativa de las hembras infectadas aumentará en la población a través de las generaciones (Engelstädter & Hurst, 2009). Aparte de los ácaros y de varios órdenes de insectos, la feminización inducida por Wolbachia ha sido reportada en isópodos terrestres (Bouchon et al., 1998).

En los isópodos terrestres los órganos reproductores no están diferenciados en el embrión en desarrollo. Si se desarrolla la glándula androgénica, libera hormona masculina y se forman testículos; de lo contrario, se forman ovarios (Martin et al., 1990). Se he propuesto que Wolbachia interfiere este sistema mediante la inhibición de los genes determinantes de la masculinidad que controlan el desarrollo y diferenciación de la glándula androgénica. De esta manera, los machos se convierten en hembras reproductivamente competentes. Pero si la relación de sexos se desplaza hacia las hembras, se darán las condiciones para un conflicto genético en la determinación del sexo. Esto podría conducir a la evolución de factores supresores de la infección (Hatcher, 2000).

8.4.- Partenogénesis telitóquica

Esta es una de las estrategias más eficaces de Wolbachia. La partenogénesis es un tipo particular de reproducción en el que el huevo no fecundado se desarrolla dando lugar a una cría. En el caso de la PT, la progenie está compuesta "exclusivamente" por hembras.

La inducción de PT por Wolbachia es una manipulación casi perfecta de la reproducción del hospedador: una hembra adulta infectada produce una progenie consistente en hembras infectadas solamente, que a su vez producirán más hembras infectadas. De este modo, si una hembra infectada produce más hijas que una hembra saludable, la infección se extenderá a través de la población, en tanto la transmisión de Wolbachia sea perfecta (Stouthamer et al., 2010). En caso de transmisión imperfecta, se alcanzará un polimorfismo estable. A menudo, las infecciones jóvenes implican una transmisión imperfecta de la bacteria a la próxima generación, tal como lo demuestra la ocurrencia ocasional de machos en la avispa Encarsia formosa (Reumer et al., 2011), aunque la tasa de transmisión de la infección puede evolucionar en tiempos increíblemente cortos (Weeks et al., 2007).

8.5.- Efecto popcorn

Este efecto de Wolbachia, descubierto por azar en una cepa de D. melanogaster (Min & Benzer, 1997), no es una alteración reproductiva pero es tan impresionante que merece ser explicado con detalle, sobre todo por el potencial que encierra como una herramienta para la aplicación de Wolbachia al control de plagas y vectores.

La cepa inductora de popcorn fue descubierta mientras Min & Benzer (1997) trataban de identificar mutaciones causantes de una degeneración cerebral en la mosca antes mencionada. Esta cepa de Wolbachia es muy virulenta y ocasiona una reducción sorprendente del ciclo de vida a través de una rápida y masiva degeneración de los tejidos corporales concomitantemente con una enorme proliferación de Wolbachia en tejidos nerviosos y musculares hacia la mitad de la adultez, lo que resulta en la muerte prematura del insecto. De aquí el nombre de esta "patología": la acumulación de Wolbachia es tan violenta, que recuerda al comportamiento del pochoclo (popcorn en inglés) en un horno de microondas. Como no podía ser de otra manera, la mosca muere repentinamente. El mecanismo molecular que dispara este "estallido replicativo" se desconoce por completo. Hasta el momento, la cepa popcorn no ha sido detectada en otra especie.

9.- Otros parásitos reproductivos

Wolbachia no es el único parásito reproductivo (Duron et al., 2008). Hace unos pocos años se descubrió otra bacteria de características muy similares a Wolbachia: Cardinium hertigii, a quien de aquí en más llamaremos Cardinium (Zchori Fein et al., 2001; Hunter et al., 2003). Esta bacteria pertenece al phylum Bacteroidetes (no es una rickettsia) (Zchori Fein et al., 2004) y produce IC, feminización y PT en insectos y ácaros (Zchori Fein et al., 2001; Hunter et al., 2003). Hasta el momento se ha detectado en el 7,2% de los insectos (Weeks et al., 2003). Al igual que Wolbachia, se transfiere horizontalmente (Gruwell et al., 2009). Aunque es vulnerable a los mismos antibióticos que Wolbachia (rifampicina y tetraciclina), la penicilina G, la ampicilina y el cloranfenicol también resultan letales para su desarrollo, lo que es muy útil para discernir el papel que juega cada una de estas bacterias cuando se las encuentra en el mismo hospedador (White et al., 2011).

Recientemente se registraron otros parásitos reproductivos bacterianos en los géneros Arsenophonus (hasta ahora se ha visto que induce androcidio en una avispa, [Ferree et al., 2008]), Rickettsia (que induce PT y androcidio [Werren et al., 1994; Lawson et al., 2001]), y Spiroplasma (que produce androcidio tanto en embriones como en larvas de escarabajos, chicharras y mariposas (Majerus et al., 1998; Hurst et al., 1999).

También existen algunos otros parásitos reproductivos por fuera del dominio procariótico, entre los que se cuentan protozoos, nematodes y virus de ARN (Vance, 1996; Terry et al., 2004; Nakanishi et al., 2008). Los estudios sobre estos organismos son incipientes y pueden abrir nuevas posibilidades.

10.- Consecuencias evolutivas de la infección

Debido a su rol en la reproducción, Wolbachia tiene una influencia capital en el destino evolutivo de sus hospedadores. De acuerdo al fenotipo que despliegue, Wolbachia puede incidir en cuestiones tan importantes como la determinación del sexo (Cordaux et al., 2011; Kageyama et al., 2012), el ciclo celular (Stouthamer, 1997) o la gametogénesis (e.g. Dedeine et al., 2001). También puede constituir el punto de partida para la adquisición de una novedad evolutiva al contribuir a ciertas funciones del hospedador (e.g. Hosokawa et al., 2010), o al transferir porciones de su genoma al genoma de la especie hospedadora (e.g. Dunning Hotopp et al., 2007). Todo esto al margen de otros efectos como la reversión de los roles sexuales (e.g. Jiggins et al., 2000) o el surgimiento (Bordenstein 2003; Brucker & Bordenstein, 2012) y la extinción de especies (Charlat et al., 2003), y la influencia en los genomas de herencia vertical como el ADN mitocondrial (Hurst & Jiggins, 2005).

11.- Wolbachia y biología aplicada: una pandemia con posibilidades

La resistencia a los insecticidas, sumada a la toxicidad de estas sustancias en organismos que no son plagas y a la crisis ambiental que estamos viviendo enfatizan la necesidad de implementar metodos alternativos al control químico para reducir o erradicar poblaciones de insectos plaga, entre los que se cuentan los vectores de enfermedades. La amplia distribución de Wolbachia, así como la capacidad de manipular la reproducción de sus hospedadores la convierten en una buena candidata como potencial herramienta para el control de plagas (Saridaki & Bourtzis, 2009). Los avances producidos en las últimas décadas proveen el punto de partida para la aplicación de este microbio al control de insectos y también de nematodos parásitos (Brelsfoard & Dobson, 2009; Saridaki & Bourtzis, 2009; LePage & Bordenstein, 2013; McGraw & O'Neill, 2013).

Algunos de los fenotipos inducidos por Wolbachia han servido como fuente de inspiración para estrategias tendientes a controlar los niveles poblacionales de sus hospedadores. Se han propuesto dos estrategias basadas en la IC: 1) la supresión poblacional o Técnica del Insecto Incompatible, que utilizaría a Wolbachia como un factor esterilizante, y 2) el reemplazo poblacional o estrategia de impulso, que la utilizaría como un simple vehículo para impulsar fenotipos deseables en poblaciones naturales como el efecto popcorn, que podría ser utilizado para reducir la longevidad de insectos adultos. También la PT podría ser empleada en los programas de control biológico que utilizan avispas parasíticas, sin dejar de lado a los mutualismos nutricionales.

Para aplicar estas técnicas, es necesario conocer cuáles son las plagas y vectores que están infectados y qué fenotipos poseen, cuáles no lo están y porqué, y qué efectos pueden inducirse en estos últimos. Aunque parezca sorprendente, a pesar de la distribución global de Wolbachia, importantes plagas agrícolas como la mosca del olivo Bactrocera oleae y la mosca del Mediterráneo Ceratitis capitata y algunos vectores de severas enfermedades humanas, como Aedes aegypti y Anopheles gambiae no están naturalmente infectados con Wolbachia. Sin embargo, la bacteria puede ser transferida y establecida en algunos hospedadores noveles, operación conocida como transinfección.

Aunque algunas veces se obtiene la expresión del fenotipo reproductivo esperado (Braig et al., 1994; Zabalou et al., 2004), a menudo ocurren resultados totalmente inesperados. Un ejemplo notable lo constituye la transinfección de la cepa feminizante del lepidóptero Ostrinia scapulalis al lepidóptero Ephestia kuehniella, en el que induce androcidio (Fujii et al., 2001). El fenotipo expresado por Wolbachia es una función de la cepa bacteriana en sí, de la densidad de esa cepa en particular, del fondo genético del hospedador y de sus capacidades fisiológicas (Braig et al., 2002). El impacto de cada factor diferirá en cada caso. Con el tiempo se ha sumado evidencia a favor de la importancia del fondo genético en la expresión de un fenotipo dado (revisada en Dobson, 2003).

11.1.- Técnica del Insecto Incompatible

La "Técnica del Insecto Incompatible" (TII) se basa en la esterilidad que resulta de la IC entre hembras silvestres no infectadas y machos liberados infectados con una cepa de Wolbachia inductora de ese trastorno reproductivo y podría ser utilizada como una alternativa a la Técnica del Insecto Estéril (TIE). Como Wolbachia no se transmite por vía paterna, la infección no llegaría a establecerse en el lugar.

Zabalou et al. (2004) lograron la infección estable de una línea naturalmente no infectada de C. capitata con una cepa inductora de IC. A partir de este hallazgo se han logrado suprimir completamente varias poblaciones de laboratorio de esta mosca con una única liberación de machos infectados. Posteriormente, Zabalou et al. (2009) optimizaron esta técnica y obtuvieron resultados muy satisfactorios en las pruebas de supresión de la plaga en condiciones seminaturales (> 99%). Cabe aclarar que estos resultados no son extrapolables a todas las líneas de C. capitata (Sarakatsanou et al., 2011): la interacción entre el fondo genético de la bacteria y el del hospedador es fundamental para el establecimiento exitoso de la infección.

Respecto a los vectores de enfermedades humanas, Laven (1967) suprimió una población aislada de C. pipiens quinquefasciatus en la India. La Organización Mundial de la Salud (OMS) y el Consejo Médico de Investigación de la India aplicaron la técnica a mayor escala en ese país no solo para diversas especies de Culex sino también para Ae. aegypti, aunque el esfuerzo no pudo ser continuado debido a reclamos de los medios de comunicación, que relacionaron este procedimiento con un programa de guerra biológica (Curtis & Von Borstol, 1978; Curtis & Reuben, 2007). Recientemente, Atyame et al. (2011) retomaron los estudios para la implementación de la TII en el sur de la India y produjeron el colapso demográfico de una población de la Isla Reunión. Otros sujetos de evaluación de la TII son Ae. polynesiensis, vector en el que se logró una supresión del 75% de la población original (Brelsfoard et al., 2008; O'Connor et al., 2012), y Ae. albopictus (Calvitti et al., 2010).

La TII podría constituir una herramienta adicional para el control de numerosas especies de moscas y mosquitos perjudiciales para las poblaciones humanas, con el aditamento de que no resulta agresiva para el ambiente. Pero para que la técnica sea aplicada exitosamente, se debe cumplir una serie de condiciones. A saber, una alta tasa de IC en la cepa liberada (es decir, que no haya descendencia de ningún cruzamiento entre hembras silvestres y machos liberados); similar o mayor competitividad sexual de los machos liberados respecto a los machos silvestres, de modo que el macho silvestre no resulte más atractivo para la hembra a la hora de elegir compañero; que no haya riesgo de efectos colaterales indeseados en el ecosistema a causa de la liberación; que solo se liberen machos para que la infección no se establezca en la naturaleza y que así no se produzca el reemplazo de la población no infectada por la infectada. Otra preocupación de tipo ética se refiere al caso especial de los mosquitos, ya que solo la hembra pica a los humanos y por ende se comporta como vector de enfermedad. Por eso, se deberían extremar los esfuerzos para determinar el sexo de los insectos liberados. Aun contando con líneas de sexado genético, se ha contabilizado hasta un 0,25% de contaminación de hembras (Franz, 2005). Este valor es pequeño en términos absolutos, pero la enorme cantidad e insectos liberados aumenta su valor relativo. Aunque se han propuesto algunas soluciones provisionales (Zabalou et al., 2004, 2009), el desarrollo de una línea de sexado genético 100% efectiva será clave para la aplicación de esta estrategia de control de plagas.

A pesar de algunos escollos iniciales, la TII se perfila como una alternativa interesante para reemplazar o combinar con la TIE. El éxito de los ensayos mencionados constituye un estímulo para la aplicación de la TII a otras especies de mosquito de importancia sanitaria y de plagas agricolas.

11.2.- Técnicas de reemplazo poblacional

Si bien hasta el momento no se ha detectado la presencia de Wolbachia en especies de importancia sanitaria como los mosquitos del género Anopheles (el vector de la malaria) o el mosquito Ae. aegypti, Wolbachia podría ser utilizada como un sistema de "para-transformación". Esta técnica consistiría en el reemplazo de una población de vectores no infectados por una población portadora de Wolbachia que posea alguna característica deseable. A continuación se describen los casos más relevantes.

11.2.1.- Paratransgénesis

Una meta muy ambiciosa de los programas de control implica la producción de organismos genéticamente modificados o "transgénicos" en los que su material genético es manipulado a fin de que produzcan alguna característica deseada. Wolbachia podría resultar de utilidad como un medio de esparcimiento de insectos genéticamente modificados en poblaciones naturales.

Actualmente se está intentando la producción de esta clase de organismos en insectos vectores, de manera que ya no sean capaces de actuar como vehículos de los patógenos que portan (se les introduce un "gen antivector" que bloquea la transmisión del parásito). Si además el insecto transgénico está infectado con una cepa de Wolbachia inductora de IC, estos podrían reemplazar al vector natural en la población. Wolbachia sería la fuerza de impulso del sistema transgénico. Aunque a nivel teórico este sistema de control parece promisorio, hasta el momento no se han logrado avances significativos en la combinación de una cepa que cause IC y un insecto transgénico. Una de las posibilidades para lograr esto es introducir los genes de interés en un cultivo de bacterias e incorporar dichas bacterias en el insecto vector, objetivos que no se han alcanzado hasta ahora por la imposibilidad de cultivar a Wolbachia. También se podrían introducir los genes responsables de la IC en el genoma del hospedador, aunque por el momento no se sabe cuáles son ni donde se ubican. Pero se podría combinar la introducción del gen de interés a través de una bacteria cultivable en combinación con una cepa de Wolbachia inductora de IC que esparza esta característica. La cooperación entre diferentes microorganismos simbióticos puede ser la clave para la implementación de esta técnica, por ejemplo para controlar la "enfermedad del sueño".

Las moscas tsetse (Diptera, Glossinidae) son los vectores cíclicos de los protozoos que causan la tripanosomiasis humana africana (o "enfermedad del sueño") y la tripanosomiasis animal africana (o "nagana"). Recientemente se demostró la inducción de una fuerte IC en Glossina morsitans morsitans (Alam et al., 2011). Este estimulante descubrimiento abre una nueva ruta hacia el control de las poblaciones de los vectores de estas tripanosomiasis (Doudoumis et al., 2013). Una posibilidad es la ya mencionada TII. Pero la IC también podría esparcir moscas paratransgénicas resistentes a los tripanosomas, reemplazando las poblaciones originales susceptibles.

Las moscas tsetse poseen un simbionte cultivable, la bacteria Sodalis glossinidus. La posibilidad de cultivar a Sodalis abre al camino hacia la paratransgénesis, i.e. la modificación de esta bacteria para que exprese productos que confieran resistencia a los tripanosomas (Aksoy et al., 2008). Además, Sodalis reside muy cerca de donde se ubican los tripanosomas, por lo que tiene el potencial de bloquear el desarrollo del parásito a través de la expresión de productos nocivos para ellos y es además muy resistente a la mayoría de los péptidos tripanosomicidas. Las bacterias modificadas podrían ser impulsadas en las poblaciones de Glossina sp. por medio de la IC inducida por Wolbachia, una verdadera estrategia cooperativa para la erradicación de esta enfermedad. Un paso crucial en la tecnología paratransgénica es la identificación de sustancias efectoras, i.e. productos génicos que tengan un efecto adverso en el desarrollo del patógeno. A la fecha se han producido algunos avances en este campo (Nantulya & Moloo, 1988; Hu & Aksoy, 2005; Caljon et al., 2013).

Los modelos matemáticos predicen que la paratransgénesis tiene el potencial para eliminar la enfermedad del sueño, siempre y cuando la modificación genética sea efectiva en proteger contra la transmisión del tripanosoma y que la especie de mosca tsetse blanco sea mayoritaria respecto a otras tsetse en la localidad de la liberación (Medlock et al., 2013).

11.2.2.- Reemplazo poblacional y acortamiento del ciclo de vida

El efecto popcorn detallado más arriba podría ser utilizado como un método de control de ciertos vectores de enfermedades infecciosas, de modo que estos mueran antes de que finalice el período de incubación de la enfermedad que van a transmitir o "período de incubación extrínseco" (i.e. tiempo transcurrido entre el consumo de sangre infectada con un patógeno por un insecto vector y el escape del patógeno del tubo digestivo y la consiguiente colonización de las glándulas salivales) (Sinkins & O'Neill, 2000).

Este escenario requiere además que la cepa de Wolbachia inductora del efecto popcorn produzca una fuerte IC. Para implementar esta estrategia de control habría que lograr la infección estable del vector con una cepa con estas características.

Mediante la transinfección de la cepa inductora de popcorn de D. melanogaster a Ae. aegypti, McMeniman et al. (2009) redujeron la duración del ciclo de vida del vector a la mitad bajo condiciones de laboratorio. Además, esta cepa indujo IC, lo que facilitaría la invasión de una población natural por parte de estos insectos modificados. Por otra parte, tuvo otros efectos deseables, como el bloqueo de los virus que producen dengue y chikungunya (artritis epidémica) (Moreira et al., 2009a), de nematodes filariales (Kambris et al., 2009) e incluso de un protozoo como Plasmodium cuando esta misma cepa de Wolbachia fue transinfectada a An. gambiae (Kambris et al., 2010). Pero también se notaron efectos negativos en el fitness del hospedador (Turley et al., 2009), lo que iría en detrimento del reemplazo poblacional, particularmente en regiones con estaciones secas (McGraw & O'Neill, 2013). Se notaron además una elevada actividad locomotora (Kambris et al., 2009) y una elevada tasa metabólica (Evans et al., 2009), así como temblores y proboscis deformadas que revelaron cambios fisiológicos que no se ajustan a una patogénesis bacteriana estándar en insectos (Moreira et al., 2009b). Una densidad exagerada de la bacteria podría explicar desajustes tales como un exceso de dopamina, responsable del aumento en la locomoción (Moreira et al., 2011). En síntesis, los efectos negativos producidos en el fitness del hospedador podrían ser contraproducentes para el establecimiento de esta cepa en poblaciones naturales (Turelli, 2010).

En Ae. albopictus, vector de varios tipos de encefalitis y también del dengue, los resultados fueron menos promisorios que en Ae. aegypti: la elevadísima densidad de Wolbachia sería la responsable de una disminución en la fecundidad (Suh et al., 2009). Además, la IC es incompleta y débil, y la reducción de la longevidad en la hembra no es tan severa como la conseguida en Ae. aegypti. Por lo tanto, es muy poco probable que esta simbiosis no adaptativa se expanda en una población no infectada de Ae. albopictus.

En cuanto a la efectividad de esta técnica como método de control de insectos vectores, Schraiber et al. (2012) desarrollaron modelos matemáticos y computaron los parámetros demográficos para mosquitos infectados y no infectados y la velocidad de expansión de la infección, y los resultados distan de ser optimistas. La lentitud de la expansión sería tal (0,43 m/día), que se requeriría una cantidad de puntos de liberación prohibitiva. Así, a partir de una única liberación en el centro de Bangkok (Tailandia), tomaría unos 130 años la propagación de la infección por la ciudad. Para resultar efectiva, la campaña de expansión de esta cepa de WolbachiaI alcanzaría costos siderales. De cualquier manera, las predicciones del modelo podrían subestimar la velocidad real en la naturaleza, dado que falta aún la evaluación del desempeño de la población de insectos modificados en condiciones de campo y la evaluación de los riesgos de la liberación para el ecosistema.

11.2.3.- Reemplazo poblacional y bloqueo de la enfermedad I

En los últimos años se ha descubierto que algunas cepas de Wolbachia proveen defensas contra patógenos a sus hospedadores. Una cepa que además induzca IC (o en combinación con alguna otra cepa que lo haga) podría inmunizar a los insectos vectores de las enfermedades que transmiten.

La malaria es una enfermedad vectorial causada por el parásito Plasmodium, que es transmitido a través de la picadura de mosquitos del genero Anopheles. Aunque estos mosquitos no están naturalmente infectados (e.g. Kittayapong et al., 2000, Ricci et al., 2002), se podría ensayar la transinfeccion de la bacteria. Factores como la edad del embrión al momento de la inyección y el nivel de desecación son cruciales para el éxito del experimento. Aunque se ha conseguido la infección en líneas celulares inmunocompetentes (Rasgon et al., 2006) y en tejidos somáticos de Ae. gambiae (Rasgon et al., 2006; Jin et al., 2009), no ha ocurrido lo mismo con los tejidos germinales, lo que impide una infección estable.

Recientemente, se han identificado algunas barreras que impiden a Wolbachia la colonización de los tejidos reproductivos (Rasgon & Hughes, 2012). Estos autores determinaron que Wolbachia es capaz de invadir los tejidos germinales tanto in vitro como in vivo, pero la microflora intestinal de An. gambiae impide la transmisión de la bacteria a las siguientes generaciones. Eliminada la microflora endógena del mosquito, la transmisión vertical de Wolbachia es posible a niveles comparables a los de las infecciones naturales. Estos resultados son cruciales no solo para la obtención de líneas de An. gambiae con infecciones estables, sino para comprender por qué algunos posibles hospedadores no poseen la infección en la naturaleza.

La evidencia indica que es probable que Wolbachia provea protección contra Plasmodium sp. en el caso de lograr una transinfección estable (Moreira et al., 2009a; Kambris et al., 2010; Hughes et al., 2012b; Zele et al., 2012), aunque el efecto de Wolbachia sería cepa-específico (Hughes et al., 2012a, b).

Recientemente se ha logrado la infección estable de An. stephensi: la infección con esta cepa indujo IC, una altísima tasa de transmisión vertical gracias a la infección de los ovarios y resistencia a P. bergei a través del estrés oxidativo (Bian et al., 2013).

El uso de Wolbachia para el control de la malaria requiere líneas con una infección estable de los principales vectores de la enfermedad: An. gambiae (Africa), An. stephensi (India) y An. darlingi (América del Sur y Central), además de una extensa evaluación de los efectos protectivos contra los parásitos de la malaria humana como P. falciparum y P. vivax (Walker & Moreira, 2011). Por el momento no es posible contar con un sistema que invada fácilmente poblaciones naturales de Anopheles, con excepción de An. stephensi, pero se están comenzando a identificar las barreras biológicas para este propósito. La enorme complejidad biológica de los vectores de la malaria dificulta la implementación de Wolbachia como mecanismo de control, limitándose a áreas endémicas en las que un único vector transinfectable esté presente. No obstante, el hallazgo de Bian et al. (2013) sugiere buenas expectativas.

11.2.4.- Reemplazo poblacional y bloqueo de la enfermedad II

El dengue es una enfermedad viral transmitida por el mosquito Ae. aegypti. Las estimaciones más recientes de la OMS predicen que los casos de dengue oscilarán entre los 50-100 millones por año (McGraw & O'Neill, 2013). "Eliminemos el Dengue" ("Eliminate Dengue Project" [EDP], http://www.eliminatedengue.com) es un esfuerzo de alcance mundial para eliminar al virus de esta temible enfermedad a través de la diseminación de mosquitos infectados con Wolbachia. De origen australiano, el proyecto posee centros de investigación también en Colombia, China, Indonesia, Vietnam y Brasil, aumentando la influencia de la liberación de mosquitos modificados en algunas de las áreas más afectadas. La base de este proyecto es bastante simple, no así su implementación.

El grupo de Scott O'Neill logró la infección estable de Ae. aegypti con una cepa aislada de D. melanogaster que no sólo induce IC, sino que además produce resistencia contra ciertos virus. El resultado es un vector del dengue en el que se ha bloqueado la transmisión del virus y que gracias a la IC puede expandir rápidamente esta característica, reemplazando la población inicial en unas pocas generaciones (Walker et al., 2011).

Hasta el momento solo se han realizado pruebas en jaulas de campo y liberaciones en dos puntos suburbanos de la ciudad de Cairns (Queensland, Australia) (Hoffman et al., 2011). Se liberaron hasta 275 mosquitos transinfectados con Wolbachia por semana durante un período de diez semanas. La infección alcanzó una prevalencia del 80% al mes de la liberación, y la fijación a los tres meses. El reemplazo de la población nativa se mantiene aún después de 18 meses (McGraw & O'Neill, 2013). Estos guarismos sugieren que se podría liberar un menor número de mosquitos, abaratando los costos (Hoffman et al., 2011) sobre todo en grandes regiones geográficas.

De hecho, ya se está pensando en la liberación a una escala mayor, considerando que no se han detectado efectos perjudiciales para el ecosistema (Murphy et al., 2010). Por ejemplo, no hubo evidencia de transferencia de Wolbachia a los humanos por la picadura de los mosquitos, ni a predadores como las arañas o los geckos (Popovici et al., 2010).

Hace algún tiempo se comenzaron a desarrollar los ensayos necesarios para examinar el desempeño de la cepa inductora de popcorn, que también mostró poseer la capacidad de bloquear al virus del dengue en Vietnam. Después de liberar mosquitos transinfectados una vez por semana durante cuatro semanas en la isla de Tri Nguyen, la infección se había extendido al 30% de la población. En la semana 11, los niveles de infección se elevaban al 59%. Al final de la experiencia (principios de septiembre de 2013), Wolbachia había colonizado el 80% de la población. El carácter insular de esta liberación promueve la creencia de que la infección se fijará en poco tiempo. En Indonesia y en Brasil han comenzado las "negociaciones" a nivel regulatorio con el gobierno y con la comunidad a fin de liberar mosquitos en algunos puntos de Rio de Janeiro durante 2014.

A corto plazo, el desafío para este tipo de tecnologías será la sostenibilidad, por el peligro que representa el restablecimiento de la población nativa, ya sea por supresión incompleta o por la migración (McGraw & O'Neill, 2013). Este efecto deberá ser evaluado en cada contexto geográfico y ecológico donde ocurran las liberaciones. En poblaciones aisladas, especialmente en las insulares, la eliminación podría ser permanente. Quizás, una vez lograda la supresión, solo se deban realizar pequeñas liberaciones para mantener la población libre de virus. Aun no se ha probado si la expansión de Wolbachia podría alcanzar a las especies que no son blanco. Los cuerpos de agua, las autopistas y las áreas de cultivo podrían constituir barreras efectivas para la propagación de los mosquitos modificados, dado el carácter antropofílico del vector y su escasa capacidad de dispersión (Harrington et al., 2005).

Como ocurre con cualquier estrategia de control de plagas, uno de los grandes problemas de este sistema es la aparición de resistencia a la bacteria, que reduciría su densidad o restringiría su distribución a ciertos tejidos (McGraw et al., 2002). Liberaciones subsecuentes de Ae. aegypti infectados con múltiples cepas de Wolbachia podrían contrarrestar los efectos de la resistencia, al reemplazar la infección que se volvió ineficaz por medio de ICB (Cook et al., 2008). Además, el patógeno podría desarrollar resistencia al bloqueo ocasionado por Wolbachia. El desconocimiento del mecanismo que elimina los agentes virales impide cualquier tipo de predicción sobre la evolución de este tipo de resistencia, además de la estabilidad de dicho mecanismo en el campo. Aparentemente, el grado de bloqueo del parásito depende de la densidad de la bacteria y/o de su distribución en los tejidos del hospedador (Moreira et al., 2009a; Mousson et al., 2010; Walker et al., 2011; Lu et al., 2012). Aunque el estímulo de la inmunidad innata en el hospedador por parte de la bacteria podría contribuir al bloqueo del parásito, particularmente en transinfecciones jóvenes, otros mecanismos deben estar implicados en esta compleja interacción (Rances et al., 2012).

11.3.- Mutualismo nutricional como base del mecanismo de control

Los mutualismos nutricionales relacionados con Wolbachia, que podrían ser muchos más de los que aún se conocen, constituyen la base de otra potencial técnica de control. En el caso de la chinche Cimex lectularius, a la que Wolbachia suministra vitamina B (Hosokawa et al., 2010) ¿cómo sobrevivir siendo hematófago sin esa preciosa sustancia?

Recientemente, C. lectularius resurgió como una amenaza a nivel mundial, quizás como consecuencia de la mayor frecuencia en los viajes, el cambio climático y la resistencia a los insecticidas. Aunque este insecto no es un vector (al menos no se conoce la transmisión de ninguna enfermedad asociada a su picadura), se han descubierto patógenos humanos tanto en la superficie de su cuerpo como en sus excrementos (Delaunay et al., 2011). Debido a su carácter antropofílico, puede generar reacciones en la piel, anafilaxis, ansiedad y otros problemas, lo que la convierte en un caso preocupante desde un punto de vista sanitario (Rossi & Jennings, 2010).

El mutualismo nutricional reportado por Hosokawa et al. (2010) podría ser el instrumento de control de este insecto cosmopolita, aunque se necesita mucha información sobre esta interacción, especialmente sobre la comunidad microbiana que alberga C. lectularius. La caracterización del microbioma (i.e. la comunidad ecológica de microorganismos comensales, mutualistas y patogénicos que habitan en un espacio corporal) de este hospedador de Wolbachia es uno de los primeros pasos para su utilización como medio de biocontrol (Meriweather et al., 2013), ya que para empezar, es necesario conocer cómo podría impactar la estructura de la comunidad en las acciones necesarias para su erradicación.

En los nematodes productores de filariasis Wolbachia se comporta como mutualista, por lo que podrían ser blanco de esta técnica de control. Cuando se administra un antibiótico que cura la infección, la filaria hospedadora experimenta problemas en el desarrollo, disminuye su supervivencia a largo plazo y experimenta una marcada disminución de la fecundidad. Se cree que Wolbachia proveería de vitaminas, nucleótidos, cofactores y grupos hemo al gusano hospedador (Foster et al., 2005; Ghedin et al., 2007). En compensación recibe metabolitos específicos que ya no puede generar debido a que el genoma de estos endosimbiontes, en los que la dependencia es recíproca, va sufriendo una degradación severa (Foster et al., 2005; Ghedin et al., 2007).

Las filariasis son difíciles de sanar, ya que la mayoría de los tratamientos tienen efectos colaterales severos. Además, los protocolos corrientes están perdiendo eficacia, y la resistencia a los fármacos se está volviendo preocupante (Slatko et al., 2010). Una posible solución benigna para estas terribles enfermedades tropicales fue ensayada por Saint Andre et al. (2002), quienes comprobaron que el endosimbionte cumple un rol fundamental en la respuesta inflamatoria de la dolencia conocida como "ceguera del río", la cual disminuye cuando se administra un tratamiento con antibióticos efectivos contra Wolbachia (doxiciclina). Más allá de la dependencia del gusano con la bacteria, esta última jugaría un papel primario en la inflamación: aparentemente la ceguera estaría causada por Wolbachia, no por la filaria. Así, la terapia "anti-Wolbachia" se perfila como una herramienta prometedora, no solo para eliminar al gusano parásito, sino para mitigar el efecto de la infección.

Los caminos metabólicos involucrados en la interacción gusano-Wolbachia son blancos potenciales de diversas drogas (LePage & Bordenstein, 2013). Incluso existe la esperanza para una vacuna antifilarial: la inmunización de ratones con una proteína recombinante de Wolbachia mostró una resistencia fuerte, aunque incompleta, al vector de la elefantiasis Brugia malayi (Nag et al., 2013). Finalmente, el Consorcio Anti-Wolbachia (A-WOL, http://www.a-wol.net) ha comenzado el escrutinio de diversos compuestos que podrían eliminar la infección en una línea celular de mosquitos con el propósito de identificar drogas para tratar las filariasis (Taylor et al., 2013) La urgencia por encontrar una terapia anti-Wolbachia es grande a pesar de la doxiciclina, en parte por la duración del tratamiento, la potencial generación de resistencia en la microflora endógena y las contraindicaciones en niños y mujeres embarazadas.

11.4.- Partenogénesis telitóquica como un medio para la reducción de los costos del control biológico

Las cepas de Wolbachia inductoras de PT pueden ser de utilidad en el campo del control biológico de plagas. Esta estrategia consiste en la liberación de "enemigos naturales" (predadores, parásitos) que reducen la población de la plaga en cuestión. Muchos de los enemigos naturales que se usan son avispas parasitoides que están naturalmente infectadas con Wolbachia (géneros Trichogramma o Nasonia, por ejemplo). Las avispas infectadas con cepas de Wolbachia inductoras de PT podrían ser más eficientes en el control biológico de plagas porque toda la progenie consistiría en hembras (recordemos que la hembra del parasitoide es la que deposita los huevos en el cuerpo de la víctima). De esta manera, los costos de producción de la cría masiva por hembra serían menores, las avispas infectadas podrían tener una mayor tasa de crecimiento poblacional y podrían causar una disminución más marcada de la población plaga respecto a su contraparte sexual (Stouthamer, 1993; Stouthamer et al., 1999). Sin embargo, hay un costo. Debido a la reproducción asexual, se acumularán mutaciones deletéreas y se erosionará la variabilidad genética (Brelsfoard & Dobson, 2009). Si estos efectos pudieran disminuirse, los programas de control biológico podrían beneficiarse con las cepas inductoras de PT. Hasta el momento solo se ha logrado una introducción exitosa de Wolbachia de una especie de Trichogramma en otra, aunque los resultados no han sido enteramente satisfactorios (Grenier et al., 1998).

Como en cualquier plan de control que se plantee seriamente, un factor muy importante a tener en cuenta es el efecto del uso de Wolbachia en las especies que no constituyen un blanco del plan de acción.

11.5.- Bacteriófagos como vectores de paratransformación de Wolbachia.

Una de las mayores limitaciones en la investigación básica y aplicada de Wolbachia es la imposibilidad de cultivarla y transformarla exitosamente. Los fagos existentes en el genoma de Wolbachia (Masui et al., 2000) ofrecen una alternativa para resolver estos problemas, utilizándolos como vectores transgénicos para Wolbachia. Incluso, ¿podrían tales partículas ser utilizadas en una terapia anti-Wolbachia para tratar las filariasis?

El fago WO resulta un candidato interesante para llevar a cabo la manipulación del genoma de Wolbachia, tomando como punto de partida las recombinasas y los sitios de anclaje para la integración de los WO identificados (Tanaka et al., 2009), aun a pesar de su gran diversidad (Kent et al., 2011). Aunque los obstáculos para lograr este cometido son muchos, el potencial del fago WO como vector de transformación es enorme (Metcalf & Bordenstein, 2012).

En cuanto a las aplicaciones terapéuticas, el genoma de los fagos WO contiene algunos productos génicos que podrían inhibir a Wolbachia, como lisozimas (enzimas que lisan la pared celular) y patatinas (proteínas con actividad fosfolipasa) (Kent et al., 2011). Estas sustancias podrían aislarse o bien sintetizarse por medios artificiales para su administración a pacientes de filariasis (Metcalf & Bordenstein, 2012).

12.- Consideraciones finales y perspectivas: ¿Qué se podría hacer en la Argentina?

El simposio presentado en el VIII Congreso Argentino de Entomología, "Wolbachia, una pandemia con posibilidades", trató de difundir el potencial de la bacteria como "insecticida biológico"para el control de poblaciones de insectos. En los próximos párrafos me referiré a los avances acontecidos en el país y las posibilidades que se podrían explorar.

En cuanto al control de plagas agrícola, el relevamiento de la infección en poblaciones naturales y en líneas de laboratorio de la mosca sudamericana de la fruta Anastrepha fraterculus y de su parasitoide Diachasmimorpha longicaudata se halla en progreso (Conte et al., 2012), así como el estudio del fenotipo inducido por la bacteria a partir de experimentos de cura con antibióticos. Estos estudios básicos sentarán las bases para una futura implementacion de la TII o de algún otro tipo de control, si la bacteria cumpliera un rol en la respuesta inmune frente a la parasitación, como ocurre en el par hospedador-parasitoide D. simulans - Leptopilina heterotoma (Fytrou et al., 2006).

Por otro lado, se ha reportado la infección con Wolbachia en numerosas especies de gorgojos partenogenéticos de origen sudamericano que se comportan como plagas de la soja, los cítricos, la alfalfa y otros cultivos (Rodriguero et al., 2010a). Las especies asexuales de gorgojos poseen mayor capacidad colonizadora que las bisexuales (Rodriguero et al., 2010b; Guzmán et al., 2012; Lanteri et al., 2013). Dado que la bacteria guarda una relación con la partenogénesis (Rodriguero et al., 2010a; Rodriguero et al., en prep.), la conquista de nuevos ambientes por parte de estos destructivos gorgojos es una consecuencia indirecta de la infección. El estudio de estas cepas puede conducir a estrategias de control novedosas y contribuir a desentrañar muchos de los interrogantes que guarda la colonización de los ambientes marginales.

Respecto a la chicharrita Delphacodes kuscheli Fennah, vector de importantes virosis que diezman los cultivos de maíz, los primeros estudios desarrollados por Mattio (2011) sugirieron que Wolbachia aumenta la eficiencia de transmisión de los agentes etiológicos mencionados. Wolbachia podría liberar alguna proteína similar a la simbionina de los endosimbiontes de pulgones y moscas blancas, que protegería a las partículas virales del ataque de las enzimas presentes en la hemolinfa del insecto, favoreciendo la transmisión de virus (e.g. Morin et al., 1999). Es importante profundizar en la interacción tripartita chicharrita-Wolbachia-virus e identificar las cepas que potencian la transmisión del virus y las que lo bloquean, lo que podría conducir a mecanismos de control novedosos.

Pasando al terreno de las enfermedades vectoriales, además de las dolencias mencionadas en estas páginas, existen muchas otras que afectan a los sectores más pobres del planeta, como la leishmaniasis o el mal de Chagas, cuyas prevalencias son importantes en Argentina. ¿Será posible aplicar métodos de control como los discutidos en este trabajo a las poblaciones de los insectos vectores de estas y otras enfermedades?

Son muchas las especies de mosquitos (Osei-Poku et al., 2012), pulgas (e.g. Gorham et al., 2003) y piojos (e.g. Perotti et al., 2004) en las que Wolbachia ha sido detectada y en los que se podría utilizar como agente de control a medida que los conocimientos sobre la biología, el status de infección y la distribución de los vectores se incremente (e.g. Díaz Nieto et al., 2013a, b). La meta puede ser más o menos fácil de cumplir, dependiendo de la especie hospedadora en cuestión. Por ejemplo, en los vectores asiáticos de la leishmaniasis, Wolbachia fue detectada en unas pocas especies, entre las que se cuenta Phlebotomus papatasi, y se demostró que induce IC (Benlarbi & Ready, 2003; Parvizi et al., 2003). Sin embargo, la transinfección de individuos no infectados no resultó exitosa debido a la escasa tasa de transmisión maternal (Kassem & Osman, 2007). Por lo tanto, el control de Phlebotomus sp. por medio del reemplazo poblacional de Wolbachia podría ser inaplicable, aunque la TII en poblaciones no infectadas sería una alternativa. En nuestro continente Wolbachia fue descubierta, concomitantemente con Leishmania naiffi (que en Sudamérica produce lesiones cutáneas), en dos vectores de la leishmaniasis, los flebótomos Lutzomyia trapidoi y Lu. gomezi, en la zona del canal de Panamá (Azpurua et al., 2010). Los patrones de transmisión deberían ser estudiados en estas especies, a fin de decidir la estrategia más adecuada. Además, sería deseable expandir el muestreo a otros países centroamericanos y ciertamente a las zonas afectadas de Sudamérica, a fin de relevar el status y la prevalencia de infección en todas las especies vectoras de esta enfermedad.

En cuanto al mal de Chagas, Wolbachia fue detectada en poblaciones panameñas de Rhodnius pallescens, uno de los reservorios mas importantes de Trypanosoma cruzi y T. rangeli en esa región (Espino et al., 2009). Otra bacteria muy emparentada con Arsenophonus que se mantuvo en una línea celular de Ae. albopictus fue descubierta en Triatoma infestans, el principal vector del Chagas en Argentina (Hypša & Dale, 1997). Aunque los simbiontes bacterianos extracelulares ingeridos durante la coprofagia han resultado ser diseminadores muy eficientes para el esparcimiento de genes exógenos en redúvidos (Durvasula et al., 1997), aún se debe que indagar el potencial de Wolbachia en las vinchucas. Ensayar transinfecciones, evaluar fenotipos, conseguir métodos de cría eficientes en el laboratorio... El hallazgo de Espino et al. (2009) abre el camino, aunque todavía hay un largo trecho por recorrer. La vinchuca es muy diferente del mosquito, organismo en el que se ha trabajado con verdadero ahínco en los últimos años. Conseguir resultados exitosos puede demandar un período de tiempo igual o mayor que el que se ha invertido en la liberación de Ae. aegypti transinfectados…

Las cepas de Wolbachia varían en forma considerable respecto a la protección viral que conceden a sus hospedadores y a la magnitud de la IC que producen. Estos factores pueden afectar la capacidad de la bacteria para expandirse espacialmente y para bloquear agentes patogénicos. Además, la transinfección de la bacteria a especies noveles puede deparar más de una sorpresa. Por ello, la detección de infecciones naturales es importante. Con seguridad, la transferencia de Wolbachia desde un hospedador a otro resultará más fácil en términos técnicos si ambos están emparentados. Además, la dinámica de una cierta cepa que se introduce en un insecto puede verse alterada por las cepas ya existentes en esa población.

Aunque para muchas de las alternativas descriptas sólo se ha demostrado la factibilidad en términos teóricos, son varias las posiblidades que brinda Wolbachia como medio de control amigable con el ambiente, sin olvidar a otros endosimbiontes, ya sean parásitos reproductivos (como Cardinium o Arsenophonus) o no (como Sodalis). Se deberá dedicar un gran esfuerzo por parte de los investigadores a la aplicación de este extraordinario microorganismo en pos del bienestar de este planeta y de quienes lo habitamos.

AGRADECIMIENTOS

Deseo agradecer al comité organizador del VIII Congreso Argentino de Entomología por el apoyo en la organización y realización del simposio "Wolbachia, una pandemia con posibilidades", al comité editorial de la Revista de la Sociedad Entomológica Argentina por la invitación para escribir este artículo, a Analía Lanteri por el estímulo para organizar el simposio y para difundir a Wolbachia en Argentina, a María Fernanda Mattio, Corina Berón y Claudia Conte por participar en el simposio con entusiasmo y dedicación, a Viviana Confalonieri y Analía Lanteri por haber hecho posible el sueño de investigar a Wolbachia en Argentina durante mis estudios de doctorado, postdoctorado y en la actualidad y por acompañarme en este proceso y a Diego Segura por haber despejado algunas dudas sobre la Técnica del Insecto Estéril.

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