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Diferentes autores han definido a la alimentación como un fenómeno social complejo en el cual intervienen no sólo aspectos biológicos sino también ecológicos, demográficos, tecnológicos, económicos, sociopolíticos y culturales (Aguirre, 2005 y 2010; Demonte, 2016). La alimentación adecuada es aquella suficiente en términos de cantidad y calidad que responde a las tradiciones culturales de la población y que garantiza una vida psíquica y física, tanto individual como colectiva, libre de angustias, satisfactoria y digna (Demonte, 2016). Una alimentación “aceptable, suficiente y adecuada” resulta restringida para amplios sectores de la población. En Argentina la equidad alimentaria no está garantizada (Aguirre, 2005), lo que compromete no sólo la salud de los sectores de recursos más bajos (Bergel Sanchís et al., 2017) sino que atraviesa de manera transversal a toda la sociedad (Demonte, 2016).
La deficiencia de micronutrientes, definida como desnutrición oculta, se extiende a nivel global aunque presenta un mayor impacto en los países en desarrollo (Carrero et al., 2016).
Este tipo de desnutrición surge como consecuencia de una alimentación inadecuada, homogénea, o deficiente en relación a algún nutriente, lo cual determina que las reservas corporales resulten insuficientes para afrontar los requerimientos del crecimiento o de una infección (Varea et al., 2006). Dada la elevada velocidad de crecimiento durante los primeros años de vida, la selección de alimentos con escaso valor o calidad nutricional puede afectar la ingesta de micronutrientes críticos y constituir uno de los factores involucrados en el retraso de crecimiento en los niños (Carmuega, 1999).
Los micronutrientes participan en la prevención de enfermedades degenerativas, tales como Alzheimer y envejecimiento prematuro, cáncer y enfermedades cardiovasculares, por el rol que desempeñan en el mantenimiento de la estabilidad genómica (Ambrosone et al., 1999; Giovannucci et al., 1998; Morris et al., 1998; Zhang et al., 1999; Selhub et al., 2000; Watkins et al., 2000). Niveles inadecuados de micronutrientes imposibilitan la actividad de enzimas requeridas para la estabilidad genómica al provocar fracturas de doble o simple cadena del ADN y/o estrés oxidativo (Fenech, 2001 y 2005).
El estrés oxidativo celular puede producirse por un exceso de radicales libres y/o por la falta de antioxidantes enzimáticos y no-enzimáticos para contrarrestarlos. Como consecuencia, éste puede dañar componentes celulares tales como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (Jomova y Valko, 2011; Lin et al., 2011; Prá et al., 2012). El daño puede ser permanente (Aksu et al., 2010) y es aceptado como uno de los principales mecanismos subyacentes de ciertas enfermedades crónicas, daños por intoxicación y lesiones tisulares (Fraga y Oteiza, 2002; Toxqui et al., 2010).
Los estudios actuales se centran en el análisis de la suplementación de micronutrientes y su interacción en el fenotipo. El mayor reto en las próximas décadas será definir la ingesta apropiada de micronutrientes combinados (nutriomas) para optimizar el funcionamiento celular y del organismo, favoreciendo la adaptación del individuo. Debido a las numerosas consecuencias producidas por desbalances en los micronutrientes, éstos deben ser una prioridad en las políticas de salud. Para ello es necesario conocer la interacción de las vitaminas y los minerales, así como su biodisponibilidad y su absorción intestinal (Guevara et al., 2017).
El cobre (Cu) y el zinc (Zn) son elementos esenciales en las células de los mamíferos (Suttle, 2010). El Cu participa en la formación de la hemoglobina, el metabolismo del oxígeno, la síntesis de neurotransmisores y de tejido conectivo, y el desarrollo de huesos y tendones, entre otros. Interviene también en reacciones de óxido-reducción provocando la formación de especies reactivas al oxígeno, por lo que aumenta el estrés oxidativo cuando se halla en exceso. Asimismo, el Cu disminuye la viabilidad y aumenta el daño en el ADN (Singh et al., 2006).
Por su parte, el Zn contribuye a la replicación del ADN y la eficacia del sistema inmunológico, es fundamental para el crecimiento, la diferenciación celular, la integridad estructural de proteínas y membranas, y participa en la unión de hormonas a sus receptores. La deficiencia de Zn se asocia con el retraso en el crecimiento y el aumento en la morbilidad de enfermedades infecciosas que afecta más frecuentemente a niños en sus primeros años de vida (Rahn-Chique et al., 2012; Carrero et al., 2016; Maury et al., 2010). En el año 2002 los reportes de salud alimentaria de la OMS advirtieron que, a nivel mundial, el 16% de las infecciones del tracto respiratorio superior, el 18% de la malaria y el 10% de los episodios de diarrea infecciosa se correspondieron con deficiencias de este micronutriente (OMS, 2002). El Zn tiene efectos antioxidantes, ya que induce la síntesis de metalotioneína, la cual disminuye el daño genético (fracturas de doble cadena) provocado por el Cu (Haldsrud y Krøkje, 2009).
Algunas enzimas tales como la citocromo C oxidasa, la tirosinasa, la hidroxifenil piruvato hidrolasa, la dopamina beta hidroxilasa, la lisil oxidasa y la superóxido dismutasa Cu-Zn (CuZn-SOD) incluyen estos minerales como cofactores necesarios para su acción catalítica y su estructura (Gaetke y Chow, 2003). En este sentido, existe evidencia que indicaría que tanto la deficiencia como el exceso de Cu y Zn podrían inducir citostasis, citotoxicidad y daño en el ADN (Johnson y Thomas, 1999; Kasprzak, 2002; Picco et al., 2004 y 2020; Kambe et al., 2008; Padula et al., 2014 y 2017).
El balance o la proporción Cu/Zn es más importante que la concentración individual de cada uno de estos micronutrientes (Jerez et al., 2021). La concentración plasmática Cu/Zn es uno de los parámetros asociados al mantenimiento y la recuperación de la homeostasis frente a un evento desestabilizador (Osredkar y Sustar, 2011; Malavolta et al., 2015). La homeostasis alterada del Cu y el Zn puede influir en el sistema de defensa antioxidante y, en consecuencia, provocar estrés oxidativo (Antwi-Boasiako et al., 2019). Por lo tanto, la proporción Cu/Zn es un buen indicador de estrés oxidativo (Fedor et al., 2017). Cuanto mayor es la relación Cu/Zn en suero, mayor es el contenido plasmático de peróxidos lipídicos. Asimismo, existe una relación estricta entre la relación Cu/Zn y la carga oxidante sistémica (Mezzetti et al., 1998).
Las deficiencias y los excesos de micronutrientes no se detectan por técnicas antropométricas. Debido a ello es de suma importancia el diseño de modelos experimentales que permitan investigar sus efectos y que aporten información que favorezca el desarrollo de políticas de prevención adecuadas. Estas políticas deben estar orientadas a mejorar el estado nutricional de los individuos, de modo que se reduzcan las consecuencias negativas de las deficiencias de micronutrientes en el genoma y en el crecimiento y el desarrollo de los individuos. Dichas políticas deben enfatizar la educación nutricional abocada a la concientización del problema y la generación de una vigilancia social que traspase los marcos de los programas prediseñados (Padula et al., 2021). En este contexto, el objetivo de este trabajo es analizar el efecto de la suplementación combinada con Cu y Zn sobre el genoma, teniendo en cuenta la proporción entre ambos en un modelo experimental con sangre periférica cultivada in vitro.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo celular
Los ensayos in vitro proveen información rápida acerca de los efectos de un determinado compuesto o agente. En particular, el modelo in vitro de cultivo de sangre periférica es muy eficaz para determinar el efecto de los micronutrientes sobre el daño genómico y la citotoxicidad (Kimura et al., 2004; Wu et al., 2009; Fenech, 2010). Este modelo es esencial para definir la concentración óptima y el límite superior más seguro de los micronutrientes (Fenech, 2010).
Diseño experimental
Se obtuvieron muestras de sangre periférica de mujeres entre 20 y 35 años (donantes sanas), luego de la firma del consentimiento informado, ya que las concentraciones fisiológicas coinciden con las de los niños y la extracción resulta más sencilla. Los protocolos in vitro no han establecido un número mínimo de donantes, pero considerando que para los trabajos in vivo se utiliza un mínimo de 5 donantes se decidió trabajar con un pool génico (teniendo en cuenta grupo y factor sanguíneo) de 10 individuos. La sangre se recogió por punción venosa con jeringa heparinizada y se cultivó en frascos Falcon utilizando como medio base al HAM F12 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) suplementado con 10% de suero bovino fetal y antibióticos (60UI de Penicilina y 50µg/ml de Estreptomicina) (Bagó Laboratorio, Buenos Aires, Argentina) para evitar el crecimiento bacteriano. La estimulación de los linfocitos se logró con 100μg/ml de fitohemaglutinina (Gibco Thermo Fisher Scientific, Buenos Aires, Argentina). Las muestras se cultivaron a 37ºC en 5% de CO2 durante 5 días (Fenech, 2010 y 2014). Para lograr la deficiencia de Zn y Cu el medio HAMF12 (HF12) fue quelado (HF12Q). Para tal fin, se utilizó Chelex-100 (95577 Sigma) al 10%, según el procedimiento descrito por Sharif et al. (2011; 2012), con algunas modificaciones. Los cultivos se suplementaron desde el inicio con sulfato de zinc (SO4Zn) y sulfato de cobre (SO4Cu). De este modo, se establecieron 8 puntos experimentales:
Control negativo (CN): cultivo estándar (HF12)
Suplementación con zinc (Zn): HF12Q + 180µg/dl SO4Zn
Suplementación con cobre (Cu): HF12Q + 165µg/dl SO4Cu
CuZn1: HF12Q + 78µg/dl SO4Cu + 180µg/dl SO4Zn
CuZn2: HF12Q + 165µg/dl SO4Cu + 180µg/dl SO4Zn
CuZn3: HF12Q + 250µg/dl SO4Cu + 180µg/dl SO4Zn
Control positivo (CP): bleomicina 1µg/ml
Control deficiente (CD): cultivo deficiente (HF12Q)
La concentración de Zn fue establecida en base a los resultados obtenidos en trabajos previos y se corresponde con el valor medio del rango fisiológico normal establecido para niños (Padula et al., 2014;.2017). Para el Cu se tomaron 3 puntos del rango fisiológico normal (Feliu et al., 2005). Las mediciones sobre la concentración exacta de los micronutrientes se realizaron en la Cátedra de Fisiología de la Facultad de Ciencias Veterinarias (UNLP).
Ensayo de electroforesis en gel de célula única (ensayo cometa)
El ensayo cometa permite visualizar los fenómenos de daño en el ADN a nivel individual. Este ensayo consiste en someter a electroforesis a una muestra de células previamente embebida en agarosa, colocada sobre un portaobjetos y lisada en una solución conteniendo detergente. La electroforesis produce la migración del ADN nuclear de cada célula a lo largo del campo eléctrico, en forma proporcional a la cantidad de daño presente. El ensayo se realizó en condiciones alcalinas, de acuerdo al método de Singh et al. (1988). Brevemente, las células se embebieron en agarosa de bajo punto de fusión (0,5%) y se depositaron en portaobjetos previamente cubiertos con 150 ml de agarosa de punto de fusión normal 0,5%. Posteriormente, los portaobjetos se sumergieron en solución de lisis a pH 10 (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, 10% DMSO, 1% Triton X-100) durante 24 h. A continuación, se procedió a un tratamiento alcalino (300mM NaOH, 1mM Na2EDTA) por 20 min antes de la electroforesis. Esta se realizó a 4ºC, 20V y 250mA durante 20 min. Una vez finalizada la electroforesis, los portaobjetos se lavaron con una solución de neutralización y las células se colorearon con SYBR Green. Se realizó el análisis cualitativo de 200 células por punto experimental utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus BX40, equipado con filtros de excitación de 515-560 ηm. La asignación de niveles o grados de daño fue realizada según la extensión de la cola del cometa a partir de la medición visual.
Cada una de las 200 células analizadas por punto experimental fueron clasificadas en 5 categorías: grado 0 (G0) células sin daño en el ADN, cola no visible; grado 1 (G1) células con daño leve en el ADN, pocos fragmentos en la cola; grado 2 (G2) células con daño intermedio, varios fragmentos en la cola del cometa; grado 3 (G3) células con daño severo, muchos fragmentos en la cola del cometa; grado 4 (G4) células con daño grave, casi la totalidad del ADN se encuentra formando su cola (Olive, 1999; Collins, 2004). A partir de esta clasificación se estableció para cada uno de los preparados un índice de daño genético (ID), según la siguiente fórmula (Collins, 2004).
De este modo, el puntaje total obtenido para cada preparado podría oscilar entre 0 ¨unidades arbitrarias¨, cuando todas la células analizadas se encuentran sin daño (G0); y 400 ¨unidades arbitrarias¨, cuando todas las células analizadas tienen el mayor de los daños (G4).
Análisis estadístico
Se realizaron 3 repeticiones y se calcularon los promedios y las desviaciones estándar. Debido a que el ID siguió una distribución normal, determinado a partir del coeficiente de curtosis tipificada (-0,919685), se utilizó la prueba de ANOVA simple. Posteriormente se realizó un contraste de múltiples rangos a través del método LSD de Fisher. Estos cálculos se llevaron a cabo utilizando el programa Statgraphics® 5.1 (Manugistics Inc., Rockville, MD) considerando un P <0,05.
RESULTADOS
En la Tabla 1 se observan las concentraciones de SO4Cu y SO4Zn junto con las proporciones Cu/Zn para las tres combinaciones establecidas.
TABLA 1 Concentraciones de SO4Cu y SO4Zn y proporción Cu/Zn para las tres combinaciones
| Combinación | Concentración SO4Cu | Concentración SO4Zn | Proporción Cu/Zn |
| CuZn1 | 78µg/dl | 180µg/dl | 0,43 |
| CuZn2 | 165µg/dl | 180µg/dl | 0,92 |
| CuZn3 | 250µg/dl | 180µg/dl | 1,39 |
En la Tabla 2 y la Figura 1 se presentan los resultados correspondientes al análisis del ensayo cometa. Se detallan los promedios del ID y las desviaciones estándar, producto de la suplementación combinada de SO4Cu y SO4Zn. Los resultados obtenidos mediante esta técnica mostraron frecuencias de ID significativamente aumentadas a medida que la proporción Cu/Zn se incrementó (coeficiente-F: 13,83; p<0,001).
TABLA 2 Promedio del índice de daño (ID) y desvío estándar para cada punto experimental. Grupos homogéneos (método LSD de Fisher)
| Tratamiento | ID (desvío estándar) | Grupos homogéneos |
| CN | 2,42 (0,62) | a |
| Zn | 4,17 (1,62) | a |
| Cu | 8,08 (3,99) | a, b |
| CuZn1 | 4,95 (3,12) | a |
| CuZn2 | 13,92 (2,26) | b, c |
| CuZn3 | 19,94 (4,1) | c, d |
| CP | 23,08 (7,14) | d |
| CD | 26,25 (6,94) | d |
Grupos homogéneos: a- CN, Zn, CuZn1 y Cu; b- Cu y CuZn2; c- CuZn2 y CuZn3; d- CuZn3, CP y CD
Figura 1 Promedio del índice de daño (ID) y desvío estándar para cada punto experimental. Se observaron frecuencias significativamente aumentadas a medida que la proporción Cu/Zn se incrementó (coeficiente-F: 13,83; P<0,001). CN: control negativo; CP: control positivo y CD: control deficiente.
A través del método LSD de Fisher quedaron conformados 4 grupos homogéneos: a) CN, Zn, CuZn1 y Cu; b) Cu y CuZn2; c) CuZn2 y CuZn3; d) CuZn3, CP y CD. En este sentido, se observó que la combinación con la proporción más baja de Cu/Zn (CuZn1) presentó valores de ID similares a los de CN, Cu y Zn; y significativamente inferiores a los observados para las combinaciones CuZn2 y CuZn3. De esta manera, las combinaciones con las mayores proporciones Cu/Zn (CuZn2 y CuZn3) mostraron valores de ID significativamente aumentados respecto de CN, Zn, Cu y CuZn1. Es de remarcar que la combinación 3 (CuZn3) presentó valores de ID semejantes a los observados para CP y CD.
DISCUSIÓN
El concepto de seguridad alimentaria, definido como el derecho de todas las personas en todo momento al acceso físico y económico a alimentos inocuos y nutritivos para satisfacer sus necesidades nutricionales y sus preferencias a fin de llevar una vida sana, supone el reconocimiento de la causalidad estructural del problema del acceso y la necesidad de soluciones intersectoriales (Demonte, 2016). En este contexto, el objetivo del presente trabajo es analizar el efecto de la suplementación combinada de Cu y Zn, micronutrientes importantes para el crecimiento y desarrollo de los niños, sobre el genoma. El estudio evalúa la proporción entre ambos micronutrientes y sus efectos en el daño génico, a través un modelo experimental con sangre periférica cultivada in vitro. Los resultados obtenidos pueden ser utilizados para informar políticas de prevención adecuadas. El aumento de las enfermedades y los problemas sociales ligados a la alimentación muestra la importancia de trabajar en la prevención y promoción de la salud, haciendo hincapié en los aspectos educativos y comunicacionales orientados a toda la población (Borrás y García, 2013).
En esta investigación se observó un aumento del daño citomolecular con el incremento de la proporción Cu/Zn utilizando concentraciones correspondientes a los rangos fisiológicos normales establecidos para niños. De esta manera, las combinaciones CuZn2 y CuZn3 (proporción 0,92 y 1,39, respectivamente) presentaron un aumento significativo del ID en relación a la combinación con la proporción más baja (CuZn1= 0,43). Nuestro trabajo previo (Picco et al., 2020), realizado en células del cúmulus de ganado bovino, también halló un aumento tanto del efecto genotóxico como de la muerte celular programada (apoptosis) con una proporción Cu/Zn >0,5 (Picco et al., 2020). En pacientes con fibrosis quística se encontró que una proporción Cu/Zn >1,00 señalaba un riesgo de deficiencia de Zn y generaba una alta respuesta inflamatoria (Escobedo-Monge et al., 2020).
Existe evidencia de que el Cu y el Zn tienen propiedades prooxidantes y antioxidantes, respectivamente, por lo que se puede esperar que su desequilibrio condicione el estado de estrés oxidativo (Mezzetti et al., 1998). El daño provocado por el Cu sobre el ADN, el estrés oxidativo y la disminución de la viabilidad puede ser permanente y es posible que se relacione con los mecanismos subyacentes de ciertas enfermedades crónicas, daños por intoxicación y lesiones tisulares (Fraga y Oteiza, 2002; Toxqui et al., 2010). El Zn puede disminuir el daño genético provocado por el Cu en diversos tipos celulares (hepatocitos, células intestinales y células mononucleares de sangre periférica), ya que a mayores niveles de Zn aumenta la concentración de glutatión y metalotioneína. Esta última juega un papel importante en la quelación del Cu dentro de las células y podría ser una de las razones del efecto citoprotector del Zn contra la toxicidad del Cu (Singh et al., 2006).
La relación Cu/Zn ha sido poco estudiada en las enfermedades aun cuando ésta se modifica más drásticamente que las concentraciones individuales de estos micronutrientes (Jerez et al., 2021). Sin embargo, se ha comprobado que la elevada proporción Cu/Zn puede ser un biomarcador del estrés oxidativo en células falciformes y de las complicaciones asociadas a esta patología (Antwi-Boasiako et al., 2019). El desbalance de metales es determinante en la producción de estrés oxidativo, por consiguiente, se ha observado un aumento de daño en el tubo renal en poblaciones expuestas crónicamente al cadmio y con proporciones Cu/Zn muy bajas o muy altas (Eom et al., 2020). En un estudio llevado a cabo en niños y adolescentes con miopía se constató que la proporción Cu/Zn resultó significativamente aumentada (Fedor et al., 2017). Lo mismo en pacientes con hemodiálisis, donde se observó una proporción Cu/Zn alta junto con altos niveles de estrés oxidativo y citoquinas pro-inflamatorias, en comparación con individuos sanos. En este caso, la suplementación con Zn mejoró las proporciones plasmáticas de Cu/Zn y redujo el estrés oxidativo, el estado inflamatorio y mantuvo la función inmunológica en dichos pacientes (Guo y Wang, 2013). Asimismo, se constató que la proporción Cu/Zn influyó en el funcionamiento cognitivo durante la vida temprana (Böckerman et al., 2016).
De este modo, se observa la importancia del balance Cu/Zn, ya que niveles adecuados permiten prevenir el daño oxidativo, las fracturas de doble o simple cadena de ADN y los efectos fenotípicos que resultan de una ingesta inadecuada, tal como el desarrollo de enfermedades degenerativas. Cualquier desbalance podría provocar la alteración de varios sistemas orgánicos (Osredkar y Sustar, 2011). En esta investigación, cabe destacar que las concentraciones utilizadas fueron establecidas dentro del rango fisiológico normal para niños (Feliu et al., 2005). Con lo cual, se torna importante la revisión de dicho rango teniendo en cuenta la interacción entre ambos micronutrientes y su impacto en el genoma.
CONCLUSIONES
El Zn y el Cu juegan un rol fundamental en el mantenimiento de la estabilidad genómica, el crecimiento de los niños, el desarrollo de enfermedades y el proceso de envejecimiento. El mayor desafío será establecer la ingesta adecuada de micronutrientes a través de mejores dietas, fortificación de alimentos y/o suplementación farmacológica, con el propósito de optimizar el funcionamiento celular y del organismo, favoreciendo la adaptación del individuo y de las poblaciones humanas. En este sentido, la adición de vitaminas y minerales a los alimentos comunes puede ser una excelente estrategia para corregir las deficiencias en grandes sectores de la población, pues no se requiere la modificación de la dieta habitual. Esto se vuelve especialmente importante en la infancia, ya que los requerimientos nutricionales únicos de los niños los hacen altamente susceptibles a una ingesta inadecuada. Definir la ingesta adecuada de nutrientes de manera combinada (nutriomas), teniendo en consideración su proporción y la posible interacción entre ellos, será el principal camino para minimizar el daño en el ADN, mejorando la salud y prolongando la esperanza de vida.
