Descripción del contexto y de la muestra

El conjunto óseo de Cueva de Plaza exhibe una representación diferencial de restos en donde predominan elementos de tamaño pequeño, como falanges, costillas y vértebras, y los cráneos enteros están ausentes: sólo se recuperaron algunos fragmentos de bóveda craneana, una mandíbula entera y un fragmento de maxilar (ver en ^{Scheinsohn et al., 2022}). Se identificó un número mínimo de 9 individuos que se distribuyen en un perfil etario con predominio de subadultos (N=7; 77,8% del total distribuídos entre un individuo de 6-14,5 años, dos de 7-9 años, uno de 13-14,5 años, uno de 13-15,5 años, uno >16 años y uno entre 2-6 años). Los individuos adultos son jóvenes (N=2), dentro del rango de 20-35 años. No se pudo determinar sexo en ninguno de los individuos debido a la ausencia de elementos diagnósticos. A nivel general se detectaron bajas frecuencias de indicadores de estrés metabólico-sistémico, ausencia de caries, desgaste y cálculo dental en niveles leves/moderados y ausencia de evidencias macroscópicas de enfermedades crónicas o infecciosas (^{Scheinsohn et al., 2022}).

La falange seleccionada para el análisis arqueoproteómico corresponde al pie de un individuo subadulto de 4-13 años con una alteración en el sector distal (área articular y borde lateral). Presenta una ausencia focal de un 10% de la pieza en la epífisis proximal, a la izquierda del área articular y la zona inmediatamente inferior (Fig. 2). La lesión exhibe bordes definidos, sin presencia de espículas, fisuras o astillas de hueso cortical o exposición de tejido esponjoso. El borde correspondiente a la cara plantar se observa más definido que el borde de la vista posterior. En el área afectada por la lesión se observa formación de hueso nuevo por lo cual se trataría de una lesión activa al momento del deceso, pero no presenta signos de formación de callos óseos o remodelación. No se evidencia presencia de cloaca ni de invasión en la cavidad de la médula por lo que no se habría originado allí. La reacción de tipo perióstica en la superficie del hueso permite considerarla como antemortem. Sobre esta base, se propuso atribuir esta alteración a una fractura, producto de un traumatismo directo o indirecto, originado probablemente de manera accidental por aplastamiento o por fuerza axial.

FIGURA 2 Primera falange proximal del pie de uno de los individuos subadultos. El círculo de la izquierda señala el sitio de toma de muestra de CDP02, mientras que el de la derecha corresponde a CDP01. 

Análisis arqueoproteómico

Se tomaron dos muestras del elemento óseo, una en la zona lesionada y la otra en un área próxima (CDP01 y CDP02 respectivamente, ver Fig. 2). Se tomaron en consideración dos controles: uno que evalúe factores diagenéticos implicados en el tiempo de depositación (CDP03) y otro que considere diferencias de preservación entre muestras del mismo sitio (CDP04). CDP03 es una falange primera del pie de una muestra osteológica subactual de Homo sapiens de la colección del INAPL (control diagenético) y CDP04 se obtuvo de un quinto metatarsiano de un adulto procedente del mismo conjunto óseo de CdP. En este último caso se seleccionó un adulto para garantizar que no se trata del mismo individuo que el de CDP01 y CDP02 (que es un subadulto) y, ante la ausencia de falanges, se optó por un metatarsiano para mantener la misma porción anatómica.

Para la identificación de proteínas en la muestra se eligió una estrategia de tipo shotgun (^{Alves et al., 2007}; ^{Nesvizhski, 2007}) que apunta a la identificación de la mayor cantidad de proteínas posibles en una mezcla compleja. Este método consiste en la digestión de las proteínas con tripsina, la separación de los péptidos por nano HPLC, y su posterior análisis on line en el espectrómetro de masas ESI-Orbitrap por fragmentación MSMS. Los espectros de fragmentación en tándem (MSMS) permiten su identificación por comparación contra determinadas bases de datos y posterior inferencia de las proteínas que dieron origen a los mismos. Las muestras fueron procesadas bajo dos protocolos de extracción diferentes para evaluar su efectividad relativa dado el carácter exploratorio de este trabajo (HCl y Mix, ver Información Suplementaria, Sección S1). Los datos crudos del análisis de espectrometría de masas fueron procesados con el software Proteome Discoverer, versión 2.1.1.21 y versión 2.2.0.388 (Thermo Scientific) para la identificación de proteínas en bases de datos con el algoritmo de búsqueda SEQUEST. Las búsquedas se realizaron contra la base de datos de Uniprot de Homo sapiens (UP000005640, versión de diciembre de 2019) digerida in silico con tripsina. También se realizaron otras búsquedas contra bases de datos de Uniprot correspondientes a mamíferos y a posibles patógenos humanos. Esta forma de búsqueda permite descartar los contaminantes del entorno, como proteínas del sedimento o microbiota asociada para que no afecten el resultado (ver también Tabla Suplementaria S1). La tolerancia de masa del precursor se estableció en 10 ppm y la de los fragmentos derivados en 0,05 Da. Se estableció como modificación fija la carbamidometilación de cisteínas, como dinámicas la oxidación de metioninas y de prolinas, y la deamidación de arginina como modificación postraduccional diagenética más abundante. Las proteínas reportadas corresponden a aquellas identificadas con péptidos de alta confianza, tomando en consideración una tasa máxima de falsos positivos del 1% calculada mediante el empleo de una estrategia de base de datos inversa.

Generación de datos para el análisis proteómico. Se realizaron modificaciones en las búsquedas que normalmente se hacen sobre muestras modernas, en vista de que no se esperaba obtener el mismo número de proteínas y considerando que se trata de muestras vecinas a tejido muscular y cartilaginoso (^{Colgrave et al., 2019}) y parcialmente degradadas por el paso del tiempo (^{Leo et al., 2011}). El criterio frecuentemente consensuado en la literatura, y que se utilizó en este trabajo, fue tomar como mínimo dos péptidos de alta confianza para identificar a una proteína (hit). En aquellos casos en donde el resultado se sostenía con un único péptido de alta confianza se hizo una detallada inspección manual de los espectros de MSMS para evaluar su calidad; en caso de tener una serie de fragmentos de alta calidad, la identificación fue considerada válida. Para evitar contaminantes modernos, se tomó la decisión de dejar de lado las queratinas y la dermicidina debido a que al estar presentes en la piel y en el cabello humanos (^{Hodges y Raines, 2003}) su presencia suele considerarse como contaminante (para más detalles ver Información Suplementaria, Sección S1).

Herramientas bioinformáticas

El análisis arqueoproteómico en hueso refleja solo una pequeña fracción de la totalidad de los procesos metabólicos que tuvieron lugar en las lesiones. Las herramientas bioinformáticas permiten reconstruir esos pasajes metabólicos a partir de listados incompletos de proteínas. Para ello se utilizó el Protein Analysis Through Evolutionary Relationships (PANTHER, versión 17.0 disponible en http://pantherdb.org/; ^{Thomas et al., 2022}), base de datos curada de familias de genes y proteínas y de sus subfamilias relacionadas por su función. De acceso libre en línea y de amplio uso en bioinformática, forma parte del Gene Ontology Reference Genome Project. Para este caso, de sus múltiples posibilidades, se utilizaron las listas de proteínas de cada muestra (sumando los dos protocolos) bajo las categorías protein class y pathways, a partir de las cuales se obtuvieron, para cada listado, sugerencias sobre los procesos biológicos en los que podrían haber estado involucradas, así como las vías en las que se insertan (^{Mi y Thomas, 2009}). También se utilizó Reactome (https://reactome.org), base de datos de vías biológicas que contiene múltiples referencias cruzadas con otras bases de datos (^{Fabregat et al., 2018}; ^{Sidiropoulos et al., 2017}) y que proporciona detalles moleculares de la transducción de señales de vías metabólicas y otros procesos celulares, en forma de una red ordenada de transformaciones moleculares. Esta herramienta permite reconstruir las rutas metabólicas sin tener todos los componentes, con la ventaja de contar con una representación gráfica. Cada conjunto de reacciones forma un reactoma propio de cada especie; para este caso se utilizó el de Homo sapiens.

Análisis arqueoproteómico

Como se detalló previamente, se partió del diagnóstico de la alteración presente en la falange como una fractura en proceso de reparación. En la Información Suplementaria, Sección S2 se propone, a partir de la bibliografía, una revisión de lo que sucede a nivel molecular y celular ante una fractura, para identificar las proteínas intervinientes. Sin embargo, hay que destacar que esta lesión no habría llegado a completar el proceso de reparación.

Análisis de datos. La Tabla 1 muestra la distribución de las proteínas colágenas y no colágenas obtenidas por los dos métodos practicados (HCl y Mix) para cada una de las cuatro muestras. El índice emPAI% es una estimación de la abundancia relativa de una proteína en una mezcla compleja. Esta estimación tiene en cuenta el número de péptidos identificados para cada proteína respecto al número de péptidos teóricos que podrían haberse identificado bajo las mismas condiciones de búsqueda (^{Ishihama et al., 2005}). Se observa que los colágenos representan entre el 83 y 99% de las proteínas identificadas mientras que, una vez eliminadas queratinas y dermicidina, las proteínas no colágenas (PNC en adelante) representan alrededor del 1 o 2%. La preponderancia de los colágenos se explica por el tipo de tejido analizado; sin embargo, la sensibilidad analítica de los procedimientos permite trabajar con estos pequeños porcentajes de PNC. Las muestras CDP02 con Mix y la CDP03 con HCl no arrojaron resultados significativos, probablemente por pérdida de las mismas en alguna etapa del procesamiento (Tabla 1).

Ambos métodos, con las excepciones mencionadas, fueron capaces de extraer proteínas. La Tabla 2 muestra el listado de PNC y colágenos que obtuvimos en la muestra CDP01. El método de HCl arrojó 27 PNC y el de Mix, 31 (Tabla 1). Ambos métodos identificaron 13 PNC en común, entre ellas fibronectina, proteínas de cartílago, de hueso, de músculo y de sangre. Por el método HCl se pudieron identificar 14 PNC no identificadas por el método Mix. A la inversa con el método Mix se identificaron 18 PNC que no se encontraron con el HCl. Así, los métodos funcionaron de manera complementaria en términos de poder determinar la mayor cantidad de proteínas. Las tablas correspondientes a las otras muestras se encuentran como Tabla Suplementaria S2 y puede observarse algo similar a lo que se describe aquí. Las tablas con los péptidos que justifican cada identificación se encuentran en la Tabla Suplementaria S3.

Al comparar el total de proteínas colágenas y PNC obtenidas por ambos procedimientos (Tabla Suplementaria S4) se puede observar un conjunto de proteínas común a las distintas muestras (en su mayoría relacionadas con el hecho de que se está analizando hueso humano) y proteínas específicas a cada muestra. Las dos PNC que se repiten en las cuatro muestras son la subunidad beta de la ATP sintasa mitocondrial (proteína del metabolismo basal) y el biglicano. Luego, presentes en tres muestras (CDP01, CDP02 y CDP03), están la subunidad alfa de la ATP sintasa mitocondrial, el factor derivado del epitelio pigmentario, la dermopontina y la vitronectina. Las muestras que más proteínas comparten son la CDP01 y la CDP03 con 10, seguidas por CDP01 y CDP02 y por CDP02 y CDP03 con 9 y CDP02 y CDP04 que comparten 4.

A pesar de no hallar un patrón claro de distribución de proteínas en las muestras, la hipótesis original de considerar la lesión como traumática se ve apoyada por la presencia de fibronectina en CDP01 y reforzado en algún grado por la presencia de protrombina, aunque ésta también está presente en las otras muestras. Ambas proteínas están asociadas a lo que sucede a nivel molecular y celular ante una fractura y su reparación (Información Suplementaria, Sección S2).

Herramientas bioinformáticas: PANTHER y Reactome. El análisis de datos con PANTHER muestra diferencias al incluir o excluir los colágenos (Tabla 3). De los seis criterios que ofrece PANTHER para agrupar las proteínas seleccionamos dos de nuestro interés (Clases de Proteínas y Vías de Señalización) que indicamos en esta tabla.

Si se toman en cuenta los colágenos, entre 39,30% y 45,88% de las proteínas halladas en todas las muestras corresponden a la matriz extracelular, lo que es coherente con el tipo de tejido que analizamos. Las proteínas de la vía de la coagulación se mantuvieron por debajo del 10%, salvo en CDP03 en donde representa un porcentaje un poco mayor. De todas maneras, la vía predominante en todos los casos, alrededor de un 40%, es la de la señalización por integrina, una superfamilia de glucoproteínas que participan mayoritariamente en la unión de las células con la matriz extracelular. Al comparar los resultados totales con aquellos limitados a proteínas no colágenas en las cuatro muestras queda claro que los colágenos aparecen involucrados en una gran variedad de funciones más allá de las típicamente estructurales. La matriz extracelular no es un tejido inerte y, en ella, la familia de los colágenos tiene diferentes funciones (^{Csapo et al., 2020}, ^{Ricard-Blum, 2011}). En este caso participa, además, en la cascada de coagulación y en la regulación de la inflamación.

Poniendo el foco en las muestras asociadas a la lesión, CDP01 tiene un 15% de hits correspondientes a la vía de inflamación mediada por citoquinas y quemoquinas a diferencia de CDP02, dónde esta vía está menos activa y donde la vía de la apoptosis tiene más peso relativo. Las proteínas que apoyan cada una de estas vías, según PANTHER, están en la Tabla 4.

En cuanto a los controles, fueron diseñados principalmente para evaluar la calidad de los métodos ante factores diagenéticos diferenciales. Por lo tanto, no serían relevantes para este análisis en tanto desconocemos la historia de vida y causa de muerte de los individuos de los cuales proceden. Sin embargo, notamos que en CDP03 la vía de las citoquinas y quemoquinas se presenta en una proporción similar que en CDP01 y en la muestra CDP04 destaca el aumento en el peso relativo de la vía de síntesis de ATP.

Las diferencias entre las vías activadas en cada muestra se tornan algo más evidentes si miramos exclusivamente a las PNC. En CDP01 y CDP02 las proteínas de matriz extracelular no colágenas tienen un peso relativo en torno al 15%. En CDP01, en porcentajes similares están las proteínas de adhesión celular. Es notorio que en CDP03 y CDP04, a diferencia de CDP01 y CDP02, no se presentan PNC de matriz extracelular.

Reactome en modo Reacfoam permite una visualización rápida y general de los grupos de proteínas en función de las vías biológicas en las cuales están involucradas (Información Suplementaria, Fig. S1). De todas las muestras es destacable que en CDP02 se sugiere la activación y agregación de plaquetas, asociadas a una degranulación de neutrófilos y a la activación de la vía del complemento, hecho que podría estar vinculado a la proximidad de un trauma, como se propuso más arriba, coherente a su vez con el incremento de la respiración en los eritrocitos. El reclutamiento de neutrófilos y su acción en la inflamación que sigue al trauma es fundamental para gatillar las respuestas -quimioquinesis, fagocitosis, liberación de quimioquinas, estallido respiratorio y otras- que conducen tanto a la regeneración ósea como a la reparación de otros tejidos adyacentes (^{Kovtun et al., 2018}, ^{Kovtun et al., 2016}). Las cascadas de complemento y de coagulación, cuyas señales se afectan y amplifican mutuamente, son mediadores centrales en la respuesta aguda al daño tisular (^{Satyam et al., 2019}). La degranulación de neutrófilos y inflamación mediada por quimoquinas y citoquinas también se presentan en CDP03, pero como se trata de un control que hace a factores diagenéticos, estos resultados (que pueden relacionarse con la historia de vida y causa de muerte del individuo en cuestión, ambas desconocidas) no son relevantes a los fines de este trabajo.

FIGURA S1 Vías metabólicas activas según Reacfoam de Reactome en las distintas muestras.