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INTRODUCCIÓN
La producción mundial de plantas ornamentales y sus industrias subsidiarias generan anualmente un valor agregado aproximado de entre 250 a 400 000 millones de dólares, alrededor del 0,5 % del producto bruto mundial (Mata et al. 2013). Para Argentina se estima que el valor bruto de la producción está entre 220 y 240 millones de dólares (Morisigue, D. 2011). En cuanto a la diversidad biológica, los recursos genéticos nativos y los mercados globales asociados a ello, forman la base de una proporción significativa de la actividad económica mundial. Una estimación de las ventas de los mercados globales anuales, para el área de los productos hortícolas ornamentales derivados completamente de recursos genéticos, se encuentra entre 16 y 19 billones de dólares (Kate y Laird, 2000). En Argentina el desarrollo comercial de recursos fitogenéticos nativos se centró en especies de hábito herbáceo, mientras que las leñosas (géneros Tecoma y Handroanthus híbridos interespecíficos entre Jacaranda mimosifolia D. Don y J. cuspidifolia Mart), se desarrollaron para obtener floración temprana y porte compacto para uso en macetas (Soto et al. 2011). Sin embargo, existen otras especies con alto valor paisajístico para arbolado urbano o jardines, que actualmente no se encuentran desarrolladas económicamente como Croton urucurana, Taberbaemontana catharinensis (ambas de porte arbóreo) y Paullinia elegans (de tipo apoyante).
Para el desarrollo económico de especies ornamentales, la propagación vegetativa es un aspecto crucial ya que permite clonar individuos con superioridad en su valor paisajístico (atractivo ornamental, tolerancia a estrés, adaptabilidad a ambientes restrictivos, etc.) (Dole y Gibson 2006). Dentro de las ventajas más importantes que presenta este método se encuentran la producción de clones, la superación de problemas de la propagación sexual (baja viabilidad, baja energía germinativa, baja producción de semillas, etc.) y la ausencia del período juvenil en las plantas propagadas vegetativamente (Hartmann et al. 2002). En el género Paullinia existen evidencias de especies con semillas recalcitrantes como P. pinnata L. (Francis 2004) y P. cupana Kunth “Guaraná” (de Carvalho et al. 1982), por lo tanto la propagación vegetativa representa una oportunidad para ampliar el período productivo, además de mantener clones. Esta situación también se observó en P. elegans (Ghio et al. 2018). En T. catharinensis no existen problemas relacionados a la propagación sexual, no obstante es interesante estudiar la propagación vegetativa con el objetivo de evitar el período juvenil de esta especie, dado que su principal atractivo es su floración. En C. urucurana debe realizarse una selección de la semilla por color para aumentar el porcentaje de germinación y además las semillas se deben someter a alternancia de temperatura (Scalon et al. 2012). En este caso la propagación vegetativa podría ser una técnica más sencilla que la propagación sexual.
El éxito comercial de la reproducción asexual por estacas depende de factores endógenos y exógenos que influyen en el potencial de enraizamiento de las estacas. Dentro de los factores exógenos, uno de los más importantes es la utilización de auxinas sintéticas que se aplican en concentraciones de 500 a 10000 ppm dependiendo del grado de lignificación de la estaca y la presencia o ausencia de hojas (Dole y Gibson 2006). Otro factor importante es el tiempo de inmersión en la solución que va desde segundos a días, dependiendo de la concentración utilizada. El Ácido Naftalén Acético (ANA) es una auxina sintética barata, potente y móvil, por lo que su uso requiere de un ajuste preciso de la dosis y el tiempo de inmersión (Hartmann et al. 2002). Dentro de los factores endógenos, la especie tiene gran relevancia. La bibliografía muestra resultados inconsistentes en el enraizamiento de especies del género Croton que dependen de la posición de la estaca utilizada en la rama (apical, sub-apical, basal), de la presencia de hojas, la inclinación de la estaca en cámara de enraizamiento, del tipo de sustrato utilizado y el tipo y dosis de hormona (Chaves 2016; da Gama et al. 2015; Osakada y Yuyama 2008; Santos et al. 2011). Sumado a esto, antecedentes dentro de la misma familia (Euphorbiaceae) muestran que dosis de 3000 ppm de AIB y 2500 ppm de ANA inducen el enraizamiento y elevan la uniformidad en la producción de raíces (Dole y Gibson 2006). En cuanto al género Tabernaemontana la bibliografía muestra que dosis de 3000 a 5000 ppm de AIB indujeron un alto porcentaje de enraizamiento en estacas semi-leñosas con hojas de T. coronaria, una especie de fácil enraizamiento (Rawat et al. 2014). Por otro lado, los antecedentes en el género Paullinia muestran resultados contradictorios en el enraizamiento de estacas herbáceas con la utilización de AIB entre 0 y 6000 ppm, siendo el factor determinante el clon (Albertino et al. 2012; Arruda et al. 2007; Atroch et al. 2011; Rodrigues y Lucchesi 1987). Trabajos previos muestran que en la familia Sapindaceae existe una falta de respuesta de estacas a promotores de enraizamiento (Amorim et al. 2019).
Por lo mencionado anteriormente, el objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial de enraizamiento y la calidad de raíces en estacas en Croton urucurana, Paullinia elegans y Tabernaemontana catharinensis sometidas a diferentes dosis de ANA.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y área de recolección de muestras
Los propágulos de “Sangre de drago” (C. urucurana), “Horquetero” (T. catharinensis) y “Ojo de muñeca” (P. elegans) se recolectaron en diferentes áreas de su distribución natural, en los departamentos La Capital, Juan de Garay y San Javier de la provincia de Santa Fe, en los primeros días del mes de Julio del año 2017 (Figura 1). Las especies mencionadas fueron seleccionadas en función de su valor paisajístico representado por su floración, fructificación, follaje, bajos requerimientos de mantenimiento y aptitud para el uso en parques, jardines y/o arbolado urbano de alineación.
Para cada una de las tres especies, se colectaron 200 estacas caulinares, leñosas, homogéneas, de 15 centímetros de longitud aproximadamente, sin tener en cuenta su posición a lo largo del ramo, diámetro de la estaca, ni la posición del ramo en las plantas madres. La tarea de recolección comenzó durante las primeras horas de la mañana. Los propágulos de cada especie se extrajeron de 8 a 10 plantas adultas y en estado silvestre. Estos genotipos se seleccionaron visualmente teniendo en cuenta a aquellos de mejor comportamiento fitosanitario.
Se procedió a la extracción de las estacas, realizando un corte recto en la base, dejando un nudo inmediatamente por encima del mismo y un corte en bisel en el extremo apical. También se llevó a cabo el deshojado de las estacas. Para todos los cortes se utilizaron tijeras correctamente desinfectadas en una solución de hipoclorito de sodio al 50% v/v. Las estacas se desinfectaron realizando dos enjuagues en una solución de hipoclorito de sodio 8% (v/v), posteriormente, se colocaron en bolsas con cierre hermético, identificando cada genotipo y se almacenaron en conservadora termoeléctrica portátil Coleman® en condiciones de baja temperatura 2 ± 3,8 ºC y 90% de HR hasta la aplicación de hormonas.
Tratamientos hormonales y ambiente de propagación
Antes de la inmersión en ANA se efectuó un nuevo lavado del material mediante la inmersión de las estacas en solución de agua con hipoclorito de sodio al 8% (v/v) durante diez minutos. Luego, se realizó una inmersión en fungicida sistémico Carbendazim (50% SC- suspensión concentrada) a una concentración de 3 ml.L-1 durante el mismo tiempo. Se formaron grupos de 50 estacas con aproximadamente la misma proporción de los genotipos recolectados, para eliminar el efecto genotipo sobre el enraizamiento. A cada uno de estos grupos se le asignó al azar uno de los tratamientos hormonales que se muestran en la tabla 1. Dentro de cada grupo, cada estaca fue individualizada con un número progresivo empezando en el 1 en el primer tratamiento y terminando en 200 en el último tratamiento de cada especie.
Para los tratamientos hormonales se usó como hormona enraizante al ácido naftalenacético (ANA), sal sódica, pureza 99%, hidrosoluble, marca Dalton®. Aunque la sal es hidrosoluble, en algunas concentraciones se observaba un residuo sólido de la sal que fue disuelto con hidróxido de potasio (KOH) 1 N, en cantidades suficientes y se llevó al volumen deseado con agua destilada. El tiempo de inmersión en la solución hormonal fue de 5 segundos, independientemente de la concentración utilizada. Se optó por el ANA por su mayor actividad hormonal y por su menor costo, en comparación con el AIB, teniendo presente la futura utilización por parte de viveristas.
En una primera instancia las estacas se llevaron a cámara de crecimiento a temperatura controlada (22 ± 1 ºC), y alta HR (90%) para inducir la formación del callo, etapa de “callusing” según Dole y Gibson (2006). Para ello se utilizaron bandejas de 30 x 60 x 20 cm, con perlita agrícola como sustrato, la que previamente fue esterilizada en estufa a 60 ºC durante 3 días y humedecida. Para mantener elevada la HR, cada bandeja fue tapada con bolsas de polietileno negro. Esta etapa tuvo una duración de 60 días durante la cual se monitoreó y registró la aparición de raíces en cada estaca y la presencia de enfermedades, y se realizaron aplicaciones preventivas de Captan.
Una vez formado el callo y detectado el desarrollo inicial de las raíces (largo ≥ 1 mm), las estacas fueron trasladadas a un invernadero de dimensiones 3 x 3 x 3 m para su crecimiento posterior. En esta etapa de crecimiento de raíces, las estacas fueron colocadas en tubetes numerados de 250 cm3 dispuestos en bandejas de 54 unidades, donde se utilizó el sustrato MultiPro™ de la marca GrowMix®, compuesto por turba de musgo Sphagnun spp. de fibras finas, compost de corteza fina, perlita, corrector de pH y fertilizantes. Se instaló un sistema de riego automático (15 minutos de riego por hora, con un volumen de 12 L/h). Se registró la temperatura y HR del ambiente en invernadero a través de datalogger i-Button® (modelo Thermochron. Rango: - 40 a 85 °C y 0 a 100% HR. Resolución: 0,1 °C y 0,5% HR; error: +/- 0,5 °C y +/- 3 %HR) cada 15 minutos. Esta etapa tuvo una duración de 45 días. La duración del experimento completo fue de 105 días.
Variables respuesta analizadas
Una vez finalizado el experimento se registró el enraizamiento de cada estaca (presencia o ausencia de raíces) y el diámetro de las estacas a la altura del cuello (DAC). Por otro lado, se evaluaron las variables de calidad de enraizamiento (longitud total de raíces, diámetro medio de la raíz y volumen de raíces) mediante el software WinRhizoTM (2016) y un escáner compatible. Para ello se extrajo el total de la masa radicular de aquellas estacas que enraizaron satisfactoriamente y se las conservó en recipientes individuales con FAA (formaldehido, ácido acético, alcohol 96° y agua destilada, en una relación 2:1:10:7). Para cada especie se utilizó un diseño completamente aleatorizado con 4 tratamientos y 50 repeticiones por tratamiento, siendo la unidad experimental una estaca. Los datos de enraizamiento se analizaron mediante el ajuste de Modelos Lineales Generalizados y regresiones logísticas con la función glm del paquete stats del lenguaje de programación estadística R (R Development Core Team 2017), utilizando la función de enlace logit. Dichos modelos tuvieron la forma PE = ANA + DAC + ANA*DAC + Ɛ, donde PE es la probabilidad de enraizamiento, ANA es el efecto de la aplicación de ANA, DAC es el efecto del DAC y ANA*DAC es el efecto de la interacción sobre la probabilidad de enraizamiento, mientras que Ɛ es el error del modelo. Cuando los modelos lineales generalizados mostraron efecto significativo del ANA, se realizó la comparación entre niveles de ANA aplicados mediante la función emmeans del paquete emmeans de R (Lenth 2020). La calidad de enraizamiento se analizó mediante el ajuste de regresiones lineales múltiples con la función lm del paquete stats del lenguaje de programación estadística R (R Development Core Team 2017). La forma de los modelos fue la misma que para probabilidad de enraizamiento y se eligieron las variables a retener por el modelo mediante el procedimiento “stepway” utilizando la función ols_step_both_p del paquete olsrr (Hebbali 2018). Las figuras se realizaron utilizando el paquete ggplot2 de R (Wickham 2016).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto de dosis crecientes de ANA en el porcentaje de enraizamiento
“Sangre de drago” (C. urucurana)
La aplicación de ANA a dosis ≥ 1000 ppm, aumentó a casi el doble la probabilidad de enraizamiento de las estacas (p = 0,01) en comparación con el control (Figura 2). El diámetro a la altura del cuello de la estaca (DAC) no tuvo un efecto significativo la probabilidad de enraizamiento (p = 0,54) y tampoco la interacción DAC×ANA (p = 0.63). Este modelo clasificó correctamente al 70% de las estacas, como enraizada o no enraizada en función de la dosis de ANA. Como se observa en la Figura 2, las dosis de ANA superiores a 1000 ppm mostraron una diferencia significativa en la probabilidad de enraizamiento en comparación con el control (p < 0,05), pero no hubo diferencias entre las concentraciones de ANA utilizadas (p = 0,90). Una probabilidad de enraizamiento de 36% sin la aplicación de hormonas demuestra que C. urucurana es una especie de fácil enraizamiento. Esto concuerda con lo observado por Santos et al. (2011) quienes obtuvieron un 23% de enraizamiento sin aplicación de hormonas, pero contrasta con lo obtenido por Chaves (2016) quien no observó enraizamiento en el tratamiento control. Otras especies del género Croton mostraron una tasa moderada de enraizamiento (20-30%) sin la aplicación de hormonas (Amaya et al. 2019; Cunha et al. 2012). De acuerdo con Santos et al (2011) la aplicación de AIB no tuvo efecto significativo en la formación de raíces en C. urucurana, posiblemente debido a las bajas dosis aplicadas (100-300 ppm) y a que utilizaron AIB en polvo, una hormona con menor capacidad para inducir raíces que el ANA. Osakada y Yuyama (2008) detectaron un efecto perjudicial de la aplicación de hormonas (200 ppm de ANA y AIB) en estacas de C. lechleri con inmersión durante 14 horas. Sin embargo, en Croton zehntneri la inmersión por 10 segundos en dosis crecientes de AIB desde 0 a 5000 ppm elevó de 20% a 90% el porcentaje de enraizamiento (Cunha et al. 2012), demostrando que la aplicación de hormonas es crucial para la viabilidad de la propagación por estacas de Croton a nivel comercial, tal como se demuestra en el presente trabajo. La variabilidad observada en la Figura 2 puede deberse a diversos factores endógenos como el genotipo de donde se obtuvo la estaca, la edad y el nivel nutricional del mismo y, el tipo de estaca, tal como fue demostrado en otras especies como Eucalyptus cloeziana F. Muell. (Almeida et al. 2007), Olea europaea (Silva et al. 2012) y Nothofagus alessandrii (Santelices 2005). No obstante, debido al diseño experimental utilizado en nuestro trabajo, no puede separarse del error el componente asociado a los factores antes mencionados.
Figura 2 Efecto de la concentración de ácido naftalén acético (ANA) sobre la probabilidad de enraizamiento de estacas de Croton urucurana. Las barras verticales sobre las columnas indican en intervalo de confianza de la probabilidad estimada. Letras distintas indican diferencia estadística por el test de Tukey.
“Horquetero” (T. catharinensis)
Los tratamientos realizados en estacas de “Horquetero” no fueron efectivos para inducir su enraizamiento, dado que fue nula la formación de raíces en todos los tratamientos aplicados. No obstante, se pudo observar, que gran parte de las estacas que no emitieron raíz pero que permanecían vivas durante los recuentos) emitieron brotes que murieron al poco tiempo; lo que se debería a que las condiciones ambientales óptimas para el enraizamiento desencadenan la brotación en yemas sin latencia (Chaves 2016). Esta brotación, anterior a la formación de raíces, dificulta el enraizamiento de las estacas debido a que las reservas energéticas son destinadas a la brotación, en lugar de la inducción y crecimiento de raíces, además de provocar desbalances hormonales que también afectan el proceso de enraizamiento (Hartmann et al. 2002).
Los resultados de este trabajo demuestran que T. catharinensis es una especie de difícil enraizamiento a través de la propagación por estacas leñosas sin hojas. Esto contrasta con lo observado en T. coronaria, donde se obtuvo un 90% de enraizamiento de estacas sub-leñosas con hojas sin aplicación de hormonas (Rawat et al. 2014). En esta especie, la inmersión de estacas con hojas de plantas jóvenes en AIB (≥ 3000 ppm) por 10 minutos aumentó al 100% el porcentaje de enraizamiento, y mejoró significativamente el largo, diámetro y número total de raíces. En T. catharinensis, la propagación in vitro de microestacas con hojas a partir de plantas madres jóvenes, produjo un enraizamiento superior al 70 %. Dado que las estacas del presente trabajo se mantuvieron vivas durante el experimento es posible que la ausencia de inducción radicular haya sido consecuencia de una baja concentración de hormona exógena, un corto período de inmersión, la utilización de tejido muy lignificado o la selección de plantas adultas con baja capacidad de enraizamiento, factores muy importantes para la inducción radical en estacas (Hartmann et al. 2002).
“Ojo de muñeca” (P. elegans)
En “Ojo de muñeca” se observó inducción radical en un bajo porcentaje de estacas (13%), como efecto de la aplicación de ANA, sin diferencia entre las concentraciones (p > 0,05). No obstante, existió una relación positiva entre el DAC y la probabilidad de enraizamiento (p = 0,0001); esta última aumentó 0,30 veces por cada milímetro de aumento en el DAC, observándose valores superiores al 50 % con diámetros mayores a 13 mm. (Figura 3). Por otro lado, no hubo efecto de la interacción DAC×ANA (p = 0.56). Este modelo clasificó correctamente al 95% de las estacas como enraizada o no enraizada en función de su DAC. Esto pone de relevancia que P. elegans es una especie de fácil enraizamiento, ya que se indujo la formación de raíces sin utilización de hormonas exógenas en más del 50% de los casos en los que las estacas tenían un diámetro mayor a 13 mm (Figura 3). Esto concuerda con lo demostrado para P. cupana donde el enraizamiento de estacas semi-leñosas con o sin hojas y sin aplicación de hormonas va del 30% al 90% (Albertino et al. 2012; Arruda et al. 2007; Atroch et al. 2011; Rodrigues y Lucchesi 1987). La relación ascendente entre el DAC y la probabilidad de enraizamiento podría ser una consecuencia de la escasez de reservas para abastecer los cambios anatómicos que se desencadenan luego de la inducción a la formación de raíces, en estacas cuyo DAC es inferior a 13 mm. Esta relación entre el porcentaje y calidad de enraizamiento y el tamaño de la estaca fue demostrada para diversas especies (Dias et al. 2013; Martins et al. 2015; Santos et al. 2011). En cuanto a la aplicación de hormonas exógenas, los antecedentes en P. cupana indican que dosis superiores a 50 ppm de AIB inhiben la formación de raíces (Atroch et al. 2011); para esta especie el mayor enraizamiento se produce utilizando estacas con hojas y sometiéndolas a etiolización previo a la disposición en camas de enraizamiento (Rodrigues y Lucchesi 1987). La falta de respuesta de las estacas a promotores exógenos de enraizamiento en el género Paullinia parece ser una característica de la familia Sapindaceae (Amorim et al. 2019) y podría deberse a la presencia de un adecuado balance hormonal para promover el enraizamiento, o a la presencia de raíces adventicias preformadas, como ocurre en otras especies (Hartmann et al. 2002). Nuevos experimentos de enraizamiento con P. elegans deberían realizarse en estacas semi-leñosas con DAC superior a 13 mm y presencia de hojas, o previa etiolización de los ramos que darán origen a las estacas.
Efecto de dosis crecientes de ANA en la calidad de enraizamiento
Los datos que se muestran son los de “Sangre de drago” (C. urucurana), ya que en las otras dos especies el enraizamiento provocado por las dosis de ANA fue nulo o despreciable.
Largo total de raíces
El largo total de raíces fue afectado únicamente por el DAC de la estaca (p = 0.0051, R2 = 0,32). Por cada milímetro de aumento del DAC, el largo total de raíces se incrementó en 1,77 cm (Figura 4). Nuestros datos concuerdan con los de Santos et al. (2011), quienes no observaron un efecto del tratamiento hormonal sobre la calidad de enraizamiento de C. urucurana. Tampoco fue observado un efecto directo de la hormona sobre la calidad de enraizamiento en antecedentes con otras especies forestales (Richmond 1984).
No obstante, en estudios previos se observó una relación directa entre el DAC de la estaca y la calidad de enraizamiento, particularmente en la longitud total de raíces (Santos et al. 2011). Dado que la formación de raíces se produce a partir de las reservas acumuladas en las estacas que aún no tienen hojas, la relación directamente proporcional entre el diámetro de las mismas y el largo total de raíces, indica que estacas con mayor tejido de reserva (mayor diámetro) tienen mayor contenido de energía y nutrientes, que son utilizados para la formación de raíces, lo cual es independiente del nivel de hormonas exógenas aplicadas (Ming 1996).
Figura 4 Efecto del diámetro de la estaca sobre la longitud total de raíces en Croton urucurana. (●), sin aplicación de ANA, (▲) 1000 ppm de ANA, (■) 2500 ppm de ANA y (+) 3500 ppm de ANA. Modelo = 1,775 * DAC - 7,314.
Diámetro medio de raíces
El diámetro medio de las raíces no fue influenciado por el tratamiento hormonal (p > 0,05), ni por el DAC (p > 0,05), ni por la interacción DAC*ANA (p > 0,05). El diámetro medio de las raíces, independientemente del tratamiento hormonal recibido, fue de 0,80 mm.
Figura 5 Diámetro medio de raíces en estacas de Croton urucurana. (●) sin aplicación de ANA, (▲) 1000 ppm de ANA, (■) 2500 ppm de ANA y (+) 3500 ppm de ANA.
Volumen de raíces
El volumen total de raíces por estaca no fue influenciado por la aplicación de dosis crecientes de ANA (p = 0,58), tampoco por el DAC (p =0,30), ni por la interacción ANA*DAC (p = 0,35). Como se observa en la Figura 6, la gran variabilidad observada en el volumen medio de raíces por estaca impide la detección de diferencias entre tratamientos. El volumen promedio de raíces por estaca, independientemente de la concentración de ANA aplicada y del DAC, fue de 0,066 mL.
CONCLUSIONES
La especie “Sangre de drago” (Croton urucurana Baill.,) es una especie de fácil enraizamiento, ya que la probabilidad de enraizamiento sin aplicación de ANA fue del 35%. No obstante, dicha probabilidad aumentó al doble con el uso de ANA (≥1000 mg.L-1), sin afectar la calidad de dicho enraizamiento. Dado que no se detectaron diferencias entre concentraciones de ANA en cuanto a la probabilidad de enraizamiento, una dosis de 1000 ppm se considera suficiente para promover el enraizamiento de estacas leñosas en C. urucurana. Desde el punto de vista comercial, es importante notar que la mayor longitud de raíces se obtuvo en estacas de aproximadamente 20 mm de diámetro basal, lo que indica que un diámetro superior a éste, sería el recomendado para la propagación asexual por estacas sin hojas.
Las estacas leñosas sin hojas de “Horquetero” (Tabernaemontana catharinensis A. DC.) no mostraron potencial para enraizar en las condiciones evaluadas. De acuerdo a los antecedentes bibliográficos, debería elevarse el tiempo de inmersión en ANA de 10 segundos a 10 minutos y evaluar estacas sub-leñosas con hojas.
Paullinia elegans Cambess (“Ojo de muñeca”) se comportó como una especie de fácil enraizamiento dado que se obtuvo una probabilidad de enraizamiento superior al 50% en estacas sin hojas y con DAC superiores a 13 mm. Desde el punto de vista comercial, nuestro estudio demuestra la factibilidad de la producción por estacas sin la aplicación de hormonas, utilizando estacas leñosas con diámetro mayor a 13 mm. No obstante, restaría evaluar el efecto de la etiolización sobre el enraizamiento de estacas con DAC superior a 13 mm para la producción a nivel comercial.
