TRABAJOS ORIGINALES

Actinomycetes saprofíticos asociados a la rizósfera y rizoplano de Discaria trinervis

Mariana Solans*& Gernot Vobis

Departamento de Botánica, Centro Regional Universitario Bariloche, Universidad Nacional del Comahue, Río Negro, Argentina

* Dpto. de Botánica, Centro Regional Universitario Bariloche, Univ. Nac. del Comahue, Quintral 1250, 8400 S. C. de Bariloche, Río Negro, Argentina. Email: msolans@crub.uncoma.edu.ar

Recibido: 30 julio 2002;
Revisado: 9 diciembre 2002;
Aceptado: 5 febrero 2003

RESUMEN. Se aislaron 122 cepas de actinomycetes de la rizósfera y rizoplano de la especie Discaria trinervis (Hook et Arn.) Reiche. Según criterios morfológicos, fueron agrupadas en seis géneros: Streptomyces (54 cepas), Actinoplanes (27), Micromonospora (20), Actinomadura (7), Pilimelia (4) y Streptosporangium (1), además de una categoría de organismos nocardioformas (9). La población de actinomycetes presentó variaciones en su cantidad y composición según sus dos orígenes. El 62.3% de las cepas fueron aisladas de la rizósfera, principalmente representantes de los géneros Streptomyces, Actinoplanes, Pilimelia y Nocardioformas. El 37.7% restante se encontró en el rizoplano y correspondió a los géneros Streptomyces, Micromonospora, Actinomadura y Streptosporangium. Las cepas de Streptomyces fueron distribuidas en igual cantidad en ambas zonas. En todas las cepas se estudió su capacidad de degradar varios biopolímeros. Solamente en 14 cepas no se registraron efectos de degradación de material de origen vegetal. El resto se estimaron como activas, en casos extremos con capacidad para descomponer hasta cinco sustratos diferentes. Un total de 68% de las cepas mostró actividad enzimática para degradar almidón, 65.6% pectina, 59% celulosa, 28.7% hemicelulosa, 3.3% queratina y 15.6% presentó una fuerte afinidad para usar preferiblemente lignina como sustrato.

Palabras clave: Actinomycetes saprofíticos; Actividad enzimática; Rizósfera; Rizoplano.

ABSTRACT. Saprophytic actinomycetes associated to the rhizosphere and rhizoplane of Discaria trinervis. A total number of 122 strains of actinomycetes were isolated from both rhizosphere and rhizoplane of the plant Discaria trinervis (Hook et Arn.) Reiche. By employing morphological criteria, the strains could be arranged into six genera: Streptomyces (54 strains), Actinoplanes (27), Micromonospora (20), Actinomadura (7), Pilimelia (4), and Streptosporangium (1), along with a category of nocardioform organisms (9). The actinomycetes population varied in number and composition according to the two different sources. Most of the strains (62.3%) were isolated from the rhizosphere, predominantly belonging to Streptomyces, Actinoplanes, Pilimelia, and nocardioforms. The remaining 37.7% derived from the rhizoplane, belonging to Streptomyces, Micomonospora, Actinomadura, and Streptosporangium. Strains of the genus Streptomyces were distributed in equal numbers in both habitats. All isolates were examined concerning their ability to degrade various biopolymers. Only 14 strains were recorded without any effect to degrade plant material. The rest of the strains could be estimated as active, in extreme cases being able to decompose up to five different substrates. A total of 68% of strains showed enzymatic activity to degrade starch, 65.6% pectin, 59% cellulose, 28.7% hemicellulose, 3.3% keratin, and 15.6% had strong affinities to use lignin as a preferable substrate.

Keywords: Saprophytic actinomycetes; Enzymatic activity; Rhizosphere; Rhizoplane.

INTRODUCCIÓN

Los actinomycetes se encuentran frecuentemente en el suelo y constituyen un componente sustancial de la microbiota, registrándose hasta más de un millón (10⁴-10⁸) de "unidades formadoras de colonias" en un gramo de tierra fértil (McCarthy & Williams 1992; Khan et al. 2000). Como muchos otros organismos del suelo, son aeróbicos, heterótrofos y saprófitos; la mayoría tiene un máximo crecimiento entre 25-30 ºC, aunque también se encuentran representantes termotolerantes y termofílicos. En general, se desarrollan a un pH de 5-9, con un óptimo cerca del neutro. Los actinomycetes saprófitos producen diversos tipos de enzimas extracelulares que degradan macromoléculas complejas (McCarthy 1989). Tanto los representantes mesofílicos como los termofílicos y termotolerantes son abundantes en residuos vegetales donde cumplen un papel importante en la descomposición de biopolímeros y recalcitrantes (Lechevalier 1981; McCarthy & Williams 1992). Entre los biopolímeros que degradan se encuentran el almidón, la celulosa, la hemicelulosa (celulosanas), la lignina, la lignocelulosa, la pectina, la queratina, el humus y la quitina. Al final del proceso de degradación de estos compuestos, los productos se encuentran nuevamente disponibles en el suelo (Vobis & Chaia 1998).

Discaria trinervis (Hook et Arn.) Reiche es una planta leñosa que pertenece a la familia Rhamnaceae. Esta especie arbustiva es nativa del centro de Chile y del norte de la región andinopatagónica en Argentina, y se encuentra frecuentemente en sitios pobres como costas pedregosas e inundadas y áreas perturbadas, pudiendo actuar como pionera en ecosistemas degradados (Tortosa 1983, 1989). Discaria trinervis forma nódulos radicales en simbiosis con el actinomycete endófito del género Frankia, constituyendo la simbiosis actinorrícica caracterizada por la fijación del nitrógeno del aire. Otras interacciones entre los vegetales y los microorganismos existen en el suelo en contacto con las raíces (rizósfera y rizoplano); allí la microflora se encuentra bajo la influencia de los exudados radicales orgánicos y de restos de tejidos que favorecen su crecimiento (Frioni 1990, 1999). Los microorganismos de la rizósfera, incluyendo el rizoplano, difieren en composición y cantidad respecto a los del suelo libre de raíces (Marschner 1994). A su vez, los organismos estimulados actúan sobre la planta, poniendo a su disposición moléculas orgánicas que son absorbidas por las raíces, tales como aminoácidos, vitaminas, antibióticos y fitohormonas, contribuyendo a la nutrición mineral de las mismas por los procesos de mineralización y solubilización de ciertos elementos (Thuar et al. 1999).

Hasta ahora se desconocen cualitativamente los actinomycetes saprófitos que viven muy cerca de la zona de influencia del sistema radical de plantas actinorrícicas, aunque se han estudiado los actinomycetes de la rizósfera de plantas comercialmente útiles (Khan et al. 2000). Por este motivo, el objetivo de este trabajo es aislar e identificar las cepas que se encuentran en la rizósfera y rizoplano de Discaria trinervis, caracterizando las mismas por su capacidad fisiológica para degradar material biológico, en especial de origen vegetal, buscando una posible relación entre los tejidos radicales y la microbiota actinomicética asociada.

MÉTODOS

Se trabajó con la raíz principal, las raíces laterales y con el suelo circundante de una planta de Discaria trinervis de San Carlos de Bariloche, provincia de Río Negro, Argentina. Las muestras se secaron a 36 °C en estufa para su conservación y posterior procesamiento. Se utilizó el rizoplano de raíces y el suelo de la rizósfera en diversas técnicas de aislamiento, realizándose un ensayo por cada técnica empleada.

Para aislar las cepas de actinomycetes se aplicaron cinco técnicas diferentes: (1) "diluciones sucesivas", utilizando 0.01 g de suelo rizosférico (Vobis 1992); (2) "distribución de partículas", usando 0.5 g de trozos de raíces y 0.5 g de suelo (Nonomura 1989); (3) "estampado", con 1 g de raíces y nódulos enteros (Hunter et al. 1984); (4) "cebos naturales", utilizando 0.1 g de suelo (Schäfer 1973); y (5) el método de "quimiotaxis", usando 2 g de suelo (Palleroni 1980). Las últimas dos técnicas de aislamiento se usaron en casos de organismos que poseen esporas con movimiento activo.

Se utilizaron cajas de Petri de 5 y 10 cm de diámetro conteniendo distintos medios de cultivos agarizados: medio artificial del suelo (KEHE) (Henssen & Schäfer 1971), agar con extracto de levadura y almidón (YpSs) (Emerson 1958), agar de almidón-caseína y sulfato (SCa) (Palleroni 1980) y agar de solución mineral con leche diluida y harina de cuerno (Ca/20HoSl) (Vobis 1992). El período de incubación fue de 3-4 semanas a 28-30 ºC. Las cepas fueron conservadas en tubos de cultivo y depositadas en el herbario del Centro Regional Universitario Bariloche (BCRU).

Para la determinación taxonómica de las cepas al nivel de género, se usaron criterios morfológicos, en especial la formación y tipo de esporas, además de características culturales de las colonias tales como consistencia, tamaño, pigmentación y presencia o ausencia de micelio aéreo (Shirling & Gottlieb 1966; Cross 1989; Lechevalier 1989a; Vobis 1997). Las cepas fueron caracterizadas e identificadas según Shirling & Gottlieb (1966), Williams et al. (1989) y Miyadoh et al. (1997, 2001).

Para estudiar la degradación de diferentes sustratos, cada cepa fue incubada durante 5-6 semanas a 28 ºC en cajas de Petri con el medio KEHE en contacto con los distintos sustratos a probar. Se registró el crecimiento del micelio y se probó la resistencia mecánica del sustrato a la presión con una aguja fina. Finalmente, se realizó un control microscópico. En el caso de la celulosa, se colocó papel de filtro con un orificio central y se inoculó en el centro del mismo. La reacción azul-violeta con ClZnI indica la presencia de celulosa (D'Ambrogio de Argüeso 1986). Para la hemicelulosa (celulosanas) se usaron cortes transversales de 30 µm de espesor de semillas de Phoenix dactylifera, ya que las células del endosperma de este tipo de semilla poseen paredes celulares constituidas principalmente por celulosanas (Nultsch 1995). En el caso de la lignina, se utilizaron cortes de 60 µm de espesor de madera de acarreo flotante de Nothofagus sp. La reacción roja-violeta con floroglucina/HCl indica la presencia de lignina (Nultsch 1995). Para la pectina se usaron trozos (1 x 2 cm) de hojas secas de Trisetum sp. Se determinó la variación de la resistencia. Se utilizó la modificación de la estructura de pelos de ratones blancos como indicadores de actividad enzimática sobre la queratina (Vobis 1992). Para detectar la degradación del almidón se utilizó el medio YpSs, inoculando en el centro. La reacción violeta con solución de lugol indica la presencia de almidón y un halo transparente indica su ausencia (Weber et al. 1998).

Las observaciones se realizaron con un microscopio estereoscópico Olympus SZH con equipo de transiluminación y un microscopio óptico Olympus BH2 con una cámara fotográfica reflex Olympus OM 10. Las colonias se investigaron con la técnica de microscopía directa (Cross 1989) o coloreando las hifas y esporas con fucsina ácida (D'Ambrogio de Argüeso 1986) o con azul de algodón (Gams et al. 1980).

RESULTADOS

Cepas aisladas

Mediante la aplicación de las diferentes técnicas de aislamiento, se obtuvo un total de 122 cepas. Las mismas fueron agrupadas en seis géneros: Actinomadura (7 cepas), Actinoplanes (27), Micromonospora (20), Pilimelia (4), Streptomyces (54) y Streptosporangium (1), mientras que las 9 cepas restantes, con caracteres semejantes a los del género Nocardia, fueron agrupadas bajo la denominación Nocardioformas (Tabla 1). El método de aislamiento más exitoso numéricamente fue el de diluciones sucesivas, con un total de 37 cepas: Streptomyces (31), Nocardioformas (4) y Micromonospora (2). Con la técnica de estampado se obtuvieron 35 cepas con Streptomyces (21) y Micromonospora (14). Con el método de quimiotaxis se obtuvo un total de 27 cepas: Actinoplanes (26) y Micromonospora (1), mientras que con la técnica de distribución de partículas se obtuvo un total de 15 cepas: Actinomadura (7), Nocardioformas (4), Micromonospora (3) y Streptosporangium (1). Por el método de cebos naturales se pudo aislar un total de 8 cepas: Pilimelia (4), Streptomyces (2), Actinoplanes (1) y Nocardioformas (1).

Tabla 1. Ubicación taxonómica, método de aislamiento, origen y capacidad de degradación de diferentes sustratos, de cepas de actinomycetes aislados de la rizósfera y rizoplano de Discaria trinervis. Stm: Streptomyces; Min: Micromonospora; Nof: Nocardioformas; Adm: Actinomadura; Sts: Streptosporangium; Acp: Actinoplanes; Pil: Pilimelia; A: almidón; C: celulosa; H: hemicelulosa; P: pectina; L: lignina; Q: queratina; +: degradación positiva; -: degradación negativa; s/d: sin datos confiables.
Table 1. Taxonomic affiliation, isolation method, source, and capacity of degradation of various substrates, for actinomycetes strains isolated from rhizosphere and rhizoplane of Discaria trinervis. See taxa codes in the legend above. A: starch; C: cellulose; H: hemicellulose; P: pectin; L: lignin; Q: keratin; +: positive degradation; -: negative degradation; s/d: no reliable data.

Se aislaron 76 cepas de la rizósfera y 46 del rizoplano (Tabla 1). El género Streptomyces presentó el mayor porcentaje en ambas zonas, con 43.4% y 45.6%, respectivamente. Las cepas de Actinoplanes, Pilimelia, Micromonospora y Nocardioformas se encontraron principalmente en la rizósfera. En el rizoplano se hallaron las cepas de los géneros Actinomadura, Micromonospora y Streptosporangium. Fue notable el elevado porcentaje de cepas del género Actinoplanes en la rizósfera (35.5%) y de Micromonospora en el rizoplano (36.9%) (Figura 1).

Figura 1. Distribución de frecuencias de los géneros de actinomycetes presentes en rizoplano (arriba) y rizósfera (abajo) de Discaria trinervis. Los códigos de los taxa son los mismos que en la Tabla 1.
Figure 1. Frequency distribution of actinomycetes genera present in rhizoplane (above) and rhizosphere (below) of Discaria trinervis. Taxa codes are the same as in Table 1.

Degradación del material biológico

La mayoría de las cepas (108) presentó capacidad para atacar diferentes sustratos de origen vegetal: almidón (como sustancia principal de reserva), y celulosa, hemicelulosa, pectina y lignina (como distintos componentes de las paredes celulares). Cada cepa presentó diferentes actividades enzimáticas (Tabla 1). La queratina, como material biológico de origen animal, fue degradada solo por las cuatro cepas del género Pilimelia, produciendo la destrucción de la estructura del pelo (Figura 2b); estas cepas no atacaron biopolímeros vegetales.

Figura 2. Efectos de la degradación de diferentes sustratos y estructuras biológicas por actinomycetes aislados de la rizósfera y rizoplano de Discaria trinervis. (a) Halo claro alrededor de la colonia de Streptomyces MM8 indicando lisis del almidón. (b) Pelo colonizado por Pilimelia MK1; la parte derecha está destruida, con formación de esporangios (flechas) (360x). (c) Fibras de celulosa intactas (120x). (d) Fibras degradadas por Streptomyces MM27 (120x). (e) Paredes de células de endosperma compuestas por hemicelulosa (240x). (f) Paredes descompuestas por Streptomyces MM41 (240x). (g) Tejidos intactos de hoja herbácea (60x). (h) Laminillas pectinosas desintegradas por Streptomyces MM4 (60x). (i) Tejido leñoso en sección radial (120x). (j) Tejido leñoso densamente colonizado por Actinoplanes ME23 (120x).
Figure 2. Effects of degradation on various biological substrates and structures by actinomycetes strains isolated from rhizosphere and rhizoplane of Discaria trinervis. (a) Clear halo around the colony of Streptomyces MM8, indicating lysis of starch. (b) Hair colonized by Pilimelia MK1; the right part is destroyed and sporangia are developed (arrows) (360x). (c) Intact cellulose fibres (120x). (d) Fibres degraded by Streptomyces MM27 (120x). (e) Walls of endosperm cells composed by hemicellulose (240x). (f) Walls decomposed by Streptomyces MM41 (240x). (g) Intact tissues of grass leaf (60x). (h) Pectinous middle lamella disintegrated by Streptomyces MM4 (60x). (i) Wooden tissue in radial section (120x). (j) Wooden tissue densely colonized by Actinoplanes ME23 (120x).

En el caso de la degradación del almidón, se pudo observar la presencia de halos transparentes de disitintos tamaños alrededor de las colonias (Figura 2a). La mayoría de las cepas capaces de degradar dicho sustrato correspondió al género Streptomyces (con el 48.2%), seguido por las de los géneros Actinoplanes (32.5%), Micromonospora (13.3%), Nocardioformas (3.6%) y, por último, las cepas de los géneros Actinomadura y Streptosporangium (1.2%). Streptomyces es el único género en el que 11 cepas produjeron una hidrólisis completa de almidón en la caja de Petri. El resto de los organismos mostró una degradación parcial (Figura 2a), débil o nula de dicho sustrato (Tabla 1).

La actividad enzimática sobre la celulosa se observó macroscópicamente por cambios en la consistencia de las fibras de la celulosa del papel de filtro, y microscópicamente por la destrucción de fibras, inducida a través de fisuras transversales (Figura 2c y 2d). El 37.5% de las cepas del género Actinoplanes presentaron actividad, así como el 33.3% de las cepas del género Streptomyces, el 12.5% de las del género Micromonospora, el 8.3% de las de Actinomadura y el 1.4% de las de Streptosporangium y Nocardioformas.

La degradación de la hemicelulosa se observó al nivel macroscópico a través del cambio en la consistencia (de dura a blanda) en cortes transversales de la semilla de Phoenix dactylifera. Microscópicamente, se pudo detectar la destrucción de las estructuras de las paredes celulares del endosperma (Figura 2e y 2f). Se encontró que el 42.9% de las cepas del género Streptomyces presentó actividad sobre la degradación de celulosanas, así como el 25.7% de las cepas de Actinoplanes, el 17.2% de las de Micromonospora, el 5.7% de las de Actinomadura y organismos nocardioformas y el 2.8% de las del género Streptosporangium.

La degradación de la pectina se detectó mediante cambios macroscópicos en la consistencia de los tejidos de las hojas de la gramínea Trisetum sp., los cuales pudieron ser separados fácilmente con una aguja quirúrgica. El control microscópico demostró la pérdida del cemento intercelular, que es el elemento principal de la laminilla entre las paredes de las células vegetales (Figura 2g y 2h). Esta maceración, provocada por la actividad enzimática, se encontró en el 38.8% de las cepas del género Streptomyces, el 32.5% de las cepas de Actinoplanes, el 16.25% de las de Micromonospora, el 7.5% de las del género Actinomadura, el 3.8% de las cepas de organismos nocardioformas y el 1.2% de las de Streptosporangium.

En el caso de la lignina, las cepas se consideraron activamente positivas cuando, al pasar una aguja sobre el corte de xilema de Nothofagus sp., se producía la pérdida de su integridad, disgregándose en astillas. Microscópicamente, se detectó la colonización de masas de hifas y/o esporangios en el xilema con presencia de fisuras longitudinales en los vasos, fibras y radios del leño (Figura 2i y 2j). El 68.4% de las cepas del género Actinoplanes presentaron actividad, así como el 15.8% de las cepas de Actinomadura, el 10.5% de las del género Streptomyces y el 5.3% de las de Nocardioformas.

DISCUSIÓN

Mediante la utilización de los cinco métodos de aislamiento, fue posible obtener una gran diversidad taxonómica y fisiológica de los representantes de actinomycetes provenientes de la rizósfera y el rizoplano. Si bien estos métodos son selectivos, en conjunto se complementan, permitiendo aumentar el espectro de microorganismos aislados. El actinomycete Frankia, que hipotéticamente se encuentra en el suelo, no pudo ser aislado por las técnicas mencionadas, ya que se necesita de métodos específicos para su obtención (Chaia 1997). Los cultivos se mantuvieron a temperatura ambiente, pH neutro, condiciones aeróbicas y medios complejos. Estas condiciones corresponden, en general, a las exigencias fisiológicas de las bacterias y actinomycetes del suelo (Goodfellow et al. 1984). Las 122 cepas aisladas fueron identificadas hasta género, con excepción de las Nocardioformas, que representan un grupo de organismos morfológicamente parecidos pero muy diversos en su filogenia (Lechevalier 1989b).

Las cepas del género Streptomyces se encontraron en un alto porcentaje en ambas zonas y esto se relaciona con que este género es ubicuo, posee un crecimiento rápido y representa a los actinomycetes más importantes y dominantes del suelo (Williams et al. 1984), especialmente presentes en la rizósfera de plantas cultivadas (Korn-Wendisch & Kutzner 1992; Khan et al. 2000). El género Micromonospora presentó un alto porcentaje de cepas en el rizoplano, lo cual está relacionado con la producción de esporas con superficie hidrofílica (Goodfellow & Williams 1983) que son más fáciles de dispersar por la abundante humedad producida por la liberación de exudados radicales. En la rizósfera, además de Streptomyces, se encontró el género Actinoplanes en gran cantidad, debido a que poseen un ciclo de vida aéreo-acuático y esporangios con una envoltura muy resistente para garantizar una enorme distribución en todos los tipos de suelos (Vobis 1987).

Con respecto a la actividad enzimática sobre los diferentes sustratos naturales, los resultados obtenidos demuestran que los actinomycetes tienen un papel importante en el reciclaje del material orgánico del suelo al segregar distintos tipos de exoenzimas. Se podrían esperar también posibles estrategias de preparación de los tejidos radicales para la nodulación mediante la producción de diversas enzimas extracelulares u otros metabolitos bioactivos secundarios y hormonas (Goodfellow et al. 1984;Strzelczyk & Pokojska-Burdziej 1984). De esta manera, actuarían como rizobacterias del tipo "helpers" al estimular el desarrollo de los microorganismos simbióticos y el de las plantas huéspedes. Es conocido el caso de las cepas de actinomycetes del género Streptomyces y Nocardia que favorecen el desarrollo de micorrizas arbusculares (Secilia & Bagyaraj 1987).

Entre los sustratos de origen vegetal, el almidón fue degradado por el 68% de las cepas, el 65.6% de las cepas degradaron la pectina, el 59% degradaron la celulosa, el 28.7% la hemicelulosa y el 15.6% la lignina. El género Streptomyces presentó el mayor número de cepas con actividad amilolítica. En el caso de la degradación de celulosa, las cepas del género Actinoplanes fueron las que presentaron el mayor número de cepas capaces de degradar dicho sustrato a temperatura ambiente; esto concuerda con el hecho que diversas especies de este género pueden utilizar como sustrato celulosa, aunque a mayor temperatura (Coughlan & Meyer 1992). El mayor número de cepas con actividad enzimática sobre la hemicelulosa se presentó en los géneros Streptomyces y Actinoplanes. Con respecto a la pectina, y a pesar de que se conocen pocos streptomycetes pectinolíticos (Korn-Wendisch & Kutzner 1992), cepas de Streptomyces, Actinoplanes y Micromonospora fueron capaces de producir degradación, observándose la destrucción de la laminilla media entre las paredes celulares en Trisetum sp. En cuanto a la lignina, pocas cepas presentaron capacidad para colonizar y atacar el tejido leñoso, a pesar de que diversas especies de Actinomadura, Pseudonocardia, Streptomyces y Thermomonospora degradan este sustrato en numerosos fragmentos de lignina polifenólica y polimérica (Crawford et al. 1983; Lengeler et al. 1999). Es interesante mencionar el gran número de cepas de Actinoplanes (13) que mostraron capacidad para usar este último sustrato para su crecimiento, mientras que las cepas del género Micromonospora, a pesar de tener la capacidad de atacar los complejos de lignina (McCarthy & Broda 1984), no mostraron actividad en este caso.

En total, 10 cepas no presentaron actividad sobre los sustratos biológicos probados. Las cepas del género Pilimelia mostraron actividad enzimática exclusivamente sobre la queratina, sustrato de origen animal. Por el contrario, la cepa MM40 del género Streptomyces y 7 cepas de Actinoplanes (ME2, ME3, ME9, ME10, ME12, ME17, ME27) presentaron un alto potencial de actividad enzimática sobre todos los sustratos vegetales estudiados.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por el Proyecto de Investigación 04/B098 de la Secretaría de Investigación de la Universidad Nacional del Comahue. Agradecemos a la Dra. MI Messuti por valiosos comentarios sobre el manuscrito.

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