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InVet

versión On-line ISSN 1668-3498

InVet vol.13 no.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires ene./jun. 2011

 

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Diversidad genética de Mycoplasma hyopneumoniae en granjas porcinas de Argentina

 

Tamiozzo, P.J.1,2; Lucchesi, P.M.A.2,3; Ambrogi A.1

1Departamento Patología Animal. Facultad de Agronomía y Veterinaria. UNRC. Ruta 36 Km 601. Río Cuarto. Prov. de Córdoba. República Argentina.
2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). República Argentina.
3Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología-Facultad de Ciencias Veterinarias. UNCPBA. Paraje Arroyo Seco s/n, Tandil, Prov. de Buenos Aires. República Argentina.

Correspondencia e-mail: Pablo Tamiozzo ptamiozzo@ayv.unrc.edu.ar

Recibido: 06/06/11
Aceptado: 25/08/11

 


Resumen

El Mycoplasma hyopneumoniae es el agente causal de la neumonía enzoótica porcina (NEP), una de las enfermedades respiratorias de mayor impacto en la industria porcina. Conocer su diversidad genética permite el desarrollo de estudios epidemiológicos y de patogénesis para desarrollar estrategias de control más efectivas. En este trabajo se analizaron 39 muestras de ADN de hisopado nasal y lavado bronquial de cerdos de distintas edades, provenientes de siete orígenes diferentes, que habían sido positivas a la detección de M. hyopneumoniae por nPCR. Para tipificar este patógeno en las muestras provenientes de hisopados nasales, se diseñó una nPCR que amplifica en el gen p146 una región que codifica serinas repetidas en tándem. Para las muestras de lavados bronquiales, se amplificó esa región mediante PCR, así como también otros VNTRs (variable number tandem repeats), localizados en otros genes. Las metodologías empleadas, que permiten el análisis a partir de muestras clínicas sin el aislamiento previo del patógeno, determinaron que existe diversidad genética entre las cepas de M. hyopneumoniae que se encuentran en nuestro país. Se detectaron diferentes genotipos de este patógeno tanto entre granjas como entre animales de un mismo establecimiento, así como genotipos compartidos entre diferentes granjas o animales.

Palabras clave: Mycoplasma hyopneumoniae; VNTR; Gen p146; Tipificación.

Genetic diversity of Mycoplasma hyopneumoniae in pig farms from Argentina

Summary

Mycoplasma hyopneumoniae is the etiological agent of porcine enzootic pneumonia (EP), one of the respiratory diseases with higher impact on the swine industry. Knowledge of M. hyopneumoniae genetic diversity is useful for epidemiological and pathogenesis studies to develop effective control strategies. In this work, 39 DNA samples from nasal swabs and bronchial lavages, that previously rendered positive for this pathogen by nPCR, were analyzed. They corresponded to pigs of different ages, belonging to seven farms. For M. hyopneumoniae typing using DNA from nasal swabs, a nPCR assay was developed to amplify the region coding for the serine tandem repeat domain of p146 gene. For samples from bronchial lavages, the same region was amplified by PCR, along with other VNTRs (variable number tandem repeats) from other loci. With this approach, that proved to be useful for the direct analysis of clinical samples without prior isolation of the pathogen, the genetic diversity of M. hyopneumoniae strains circulating in our country could be evidenced. Different genotypes were found among farms and also among animals from a same farm, but there were also animals (from a different or a same farm) that harbored a same M. hyopneumoniae genotype.

Key words: Mycoplasma hyopneumoniae; VNTR; P146gene; Typing.


 

Introducción

El Mycoplasma hyopneumoniae es el agente causal de la neumonía enzoótica porcina (NEP), una de las enfermedades respiratorias de mayor impacto en la industria porcina20. El conocimiento de la diversidad genética de M. hyopneumoniae, así como el de otras bacterias, es importante para estudiar su transmisión, establecer asociaciones con la patogenicidad de diferentes cepas, desarrollar vacunas y otras estrategias para el control de la enfermedad. Varios estudios han demostrado su diversidad genética utilizando distintas técnicas15, 16 y han podido reconocerse cepas de M. hyopneumoniae de alta y baja virulencia22.
Básicamente, las técnicas de diferenciación genotípicas pueden dividirse en aquellas no especie-específicas que necesitan el aislamiento del microorganismo, y aquellas especieespecíficas para las cuales el aislamiento no es indispensable. Dada la dificultad en el cultivo y aislamiento de M. hyopneumoniae debido a sus exigencias nutricionales y lento crecimiento, estas últimas resultan de mucha utilidad.
Utilizando una de estas metodologías, el análisis de regiones repetidas en tándem (VNTRs, variable number tandem repeats), de Castro et al. 20065 estudiaron 22 regiones del genoma en 5 cepas de M. hyopneumoniae. A partir de ese análisis, estos autores señalan las regiones más polimórficas para el desarrollo de ensayos de tipificación, para los cuales proponen la amplificación de regiones del gen codificante de la adhesina P146 (regiones repetitivas: R1 y R3) y de dos genes de proteínas hipotéticas (H4 y H5). Dado que los VNTRs estudiados por estos autores están localizados dentro de secuencias codificantes y en fase con el marco de lectura, codifican para un número variable de repeticiones de aminoácidos5. Por otro lado, Mayor et al. 200711 propusieron otra metodología de tipificación de este patógeno, basada en la determinación del número de serinas repetidas codificadas en la región R3 del gen p146 y en el análisis de la secuencia flanqueante. En base a este método, y analizando directamente muestras clínicas, se ha demostrado una gran variabilidad entre cepas de M. hyopneumoniae de diferentes países europeos11, 14 y de Estados Unidos de América (EUA)12 en donde también se la ha empleado para estudios de brote21 y del transporte aéreo de una cepa de M. hyopneumoniae a largas distancias6.
Debido a la importancia de conocer las diferencias genéticas entre cepas de M. hyopneumoniae circulantes en nuestro país, para la mejor comprensión de su epidemiología y el desarrollo de estrategias de control más eficientes, el objetivo del presente trabajo fue investigar la variabilidad de algunas regiones VNTR de M. hyopneumoniae directamente a partir de muestras clínicas provenientes de distintos establecimientos de nuestro país.

Materiales y métodos

Se trabajó con ADN de muestras clínicas (hisopados nasales y lavados bronquiales) de cerdos de diferentes establecimientos de distintas provincias de Argentina y de animales provenientes del extranjero, que fueron parte de estudios previos realizados por el Grupo de Salud Porcina (Depto. de Patología Animal-Fac. Agronomía y Veterinaria-Universidad Nacional de Río Cuarto)17, 18. El ADN había sido extraído utilizando el kit DNAzol (InvitrogenTM, CA, EUA) y estaba conservado a -20ºC. Para este estudio se seleccionaron todas las muestras que habían sido positivas a una PCR anidada que detecta M. hyopneumoniae, descripta por Calsamiglia et al. 19993. Debido a la limitada cantidad de material genético de algunas muestras, en varios casos no fue posible analizar todos los loci. En la Tabla 1 se detallan las distintas muestras analizadas, agrupadas por establecimiento de origen.

Tabla 1. Datos correspondientes a las muestras analizadas.

Procesamiento de las muestras: Dado que, por pruebas realizadas anteriormente en nuestro laboratorio, el material genético obtenido a partir de muestras de hisopado nasal no pudo amplificarse mediante PCRs estándar previamente descriptas5, 11, a diferencia del material de lavado bronquial (probablemente debido a la sensibilidad de las reacciones), el procesamiento de los dos tipos de muestra fue distinto.
Hisopados nasales: Para aumentar la sensibilidad de la PCR desarrollada por Mayor et al. 200711 que amplifica, dentro del gen p146, la región codificante de serinas repetidas en tándem (p146R3), las muestras de ADN provenientes de hisopados nasales fueron amplificadas por una PCR anidada para la cual se diseñaron los cebadores externos: MhT146F (5`-GCTGGGATAAGCGATACCAA-3`) yMhT146R(5`-GCTTTCCATGTTTGGCATTT -3`)18. La primera ronda de amplificación se realizó en 30 µL de volumen final, con 5 µL de ADN templado, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador, 3mM de MgCl2, buffer de PCR 1X (20 mM Tris HCl (pH 8,4), 50 mM KCl) y 2,5 U Taq polimerasa (InvitrogenTM, Brasil), bajo las siguientes condiciones de ciclado: desnaturalización inicial de 94°C por 5 min seguida por 35 ciclos de 94°C por 2 min (desnaturalización), 56°C por 2 min (annealing) y 72°C por 2 min (extensión), con una extensión final de 72°C por 10 min. La segunda reacción fue realizada tomando 2 µL del producto de la primera reacción, siguiendo posteriormente las mismas condiciones y cebadores descriptos por Mayor et al. 200711. Los amplicones obtenidos, previa visualización en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, fueron purificados (QIAquick PCR purification kit, QIAgen, Duesseldorf, Alemania), cuantificados y posteriormente secuenciados (ABI 3130xl, Applied Biosystems; INTA Castelar). El número de serinas repetidas en tándem se determinó visualizando las secuencias con el software Chromas 2.32 software (Technelysium Pty Ltd.). Las secuencias de nucleótidos fueron alineadas empleando ClustalW10.
Lavados bronquiales: Se seleccionaron los loci p146R1, p146R3, p216R1/R2 y H4 para amplificar por PCR estándar, teniendo en cuenta los resultados obtenidos por de Castro et al.5 a partir del análisis de 5 cepas de M. hyopneumoniae . Los amplicones fueron corridos en gel de agarosa al 1,2% a 150 V por 5 horas, teñidos con SYBR Green I y visualizados en un transiluminador de luz UV. Para el estudio del número de serinas repetidas en tándem codificadas en la región R3 del gen p146, las muestras de ADN fueron amplificadas con los cebadores y las condiciones descriptas por Mayor et al.11. Estos amplicones fueron purificados, secuenciados y analizados como se describió para los obtenidos a partir de hisopados nasales.

Resultados

El análisis de VNTRs empleando muestras correspondientes a hisopados nasales y lavados bronquiales mostró la circulación de diferentes genotipos de M. hyopneumoniae en la población de cerdos de Argentina. Se encontraron diferencias entre establecimientos y en algunos casos también dentro de establecimientos (Tablas 2 y 3). No se encontró asociación entre categoría de animal y genotipo del patógeno, ya que en una misma categoría se encontraron diferentes genotipos y hubo genotipos compartidos entre distintas categorías.

Tabla 2. Número de serinas repetidas en tándem en muestras de hisopados nasales y lavados bronquiales, determinado a partir de la secuenciación del VNTR p146R3.

* Hisopado nasal

Tabla 3. Alelos determinados por electroforesis de los amplicones correspondientes a los VNTRs estudiados en muestras de lavado bronquial.

(-): Negativas (No se obtuvieron amplicones). Diferentes letras indican distintos alelos con los siguientes tamaños aproximados: a) 400 pb; b) 370 pb; c) 500 pb; d) 490 pb; e) 690 pb; f ) 800; g) 750; h)700 pb e i) 890 pb.

La secuenciación de la región p146R3 amplificada de 39 muestras (hisopados nasales y lavados bronquiales), permitió detectar la presencia de 6 alelos, codificantes de repeticiones de 13, 14, 16, 17, 19 y 21 serinas. En 13 muestras de lavado bronquial este locus no mostró polimorfismo cuando se analizaron por electroforesis los amplicones obtenidos con los cebadores descriptos por de Castro et al. 20065 (Tabla 3). Sin embargo, cuando se determinó por secuenciación la cantidad de serinas repetidas en tándem en esa región, se detectó la presencia de 3 alelos -codificando repeticiones de 13, 14 y 17 serinas- (Tabla 2). El locus p146R1 mostró dos alelos al igual que el locus p216R1/ R2, mientras que el H4 fue el más polimórfico, mostrando cuatro posibles alelos, observándose 2 amplicones en una de las muestras (Figura 1 y Tabla 3).


Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR correspondientes a los VNTRs p146R1 (A), p216R1/ R2 (B) y H4 (C). Letras diferentes indican diferentes alelos. A la derecha se observa el marcador de peso molecular (100 pb DNA Ladder, InvitrogenTM) y se indica el tamaño de algunas de sus bandas. La flecha indica 2 amplicones en la misma muestra.

Los animales de reposición provenientes del exterior presentaron un único genotipo de M. hyopneumoniae (con 14 serinas repetidas en la región R3 de p146 y alelos a/e/i en los VNTRs p146R1, p216R1/R2 y H4, respectivamente), el cual no se diferenció de uno de los genotipos presentes en nuestro país.

Discusión

Las metodologías empleadas para el análisis de VNTRs de M. hyopneumoniae en muestras clínicas de porcinos (hisopados nasales y lavados bronquiales) permitieron determinar que existe diversidad genética entre las cepas que se encuentran en nuestro país. Se detectaron diferentes genotipos de este patógeno tanto entre granjas como entre animales de un mismo establecimiento, así como genotipos compartidos entre diferentes granjas o animales.
Considerando las diferencias de tamaño aproximado entre los alelos correspondientes a los loci H4, p216R1/R2 y p146, y teniendo en cuenta la cantidad de nucleótidos involucrados en las regiones repetidas en tándem descriptas por de Castro et al. 20065, se puede determinar que los alelos difieren en un mínimo de 2 unidades de repetición.

Se observó también, que una muestra presentó dos posibles alelos del VNTR H4, lo cual podría deberse a reacciones inespecíficas de los cebadores o a la presencia de diferentes genotipos de M. hyopneumoniae en la misma muestra. En el caso de M. conjunctivae, Belloy et al. 20032 demostraron una infección simultánea con 2 cepas en algunos ovinos, que detectaron al estudiar la región variable del gen lppS (homólogo el gen p146 de M. hyopneumoniae).
En cuanto al gen p146, mediante la comparación por electroforesis en gel de agarosa de los amplicones obtenidos con los cebadores descriptos por de Castro et al. 20065 no se observó polimorfismo en la región R3 en el presente trabajo, que en cambio pudo ser detectado mediante secuenciación. Esto puede explicarse por la menor capacidad de discernir en un gel de agarosa diferencias de un bajo número de unidades de repetición, y en este caso sólo 3 bases componen la unidad de repetición. La mayoría de las muestras (19/39 - 48,7%-) presentaron 14 serinas repetidas en esta región, y correspondieron a 4 de los establecimientos estudiados (uno de ellos con animales muestreados a su ingreso desde el exterior de nuestro país). El 30,8% (12/39) de las muestras presentaron 21 regiones de serinas repetidas, pero se limitan sólo a los establecimientos A y B, las cuales son granjas cercanas. Debido a la proximidad operacional de las granjas, la transmisión por fómites9 o por el personal1 puede haber jugado un papel más importante que la transmisión aérea de las cepas ya que la misma ha sido demostrada hasta 4,7 km por Dee et al. 20096 y las granjas se encontraban a 7,6 kilómetros de distancia. Además, en la granja B hubo también muestras con 14 y 16 serinas repetidas lo que sugiere la circulación de al menos tres genotipos de M. hyopneumoniae dentro de la misma. En las granjas C y E en donde las diferencias entre muestras fueron debidas a una unidad de repetición (16 vs. 17 y 13 vs. 14 serinas, respectivamente) la situación es diferente ya que ha sido sugerido que entre muestras de una misma granja, una diferencia de 3 pb indica que las cepas podrían ser similares, casi idénticas11.
Mediante la secuenciación de esta región del mismo gen, Oliveira et al. 200812 y Savic et al. 201014 estudiaron el polimorfismo genético de cepas de distintas granjas de diferentes estados de EUA y Serbia, respectivamente, y Torremorel et al. 200821 aplicaron esta técnica para el estudio de un brote. Otro estudio16, en el que amplificaron por PCR este mismo gen y analizaron luego los polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP), demostró una gran diversidad de M. hyopneumoniae , pero señala como principal desventaja para estudios epidemiológicos, que el análisis está limitado a un solo gen y dado que la tasa de mutaciones es desconocida, puede que existan regiones muy variables y otras más estables, a pesar de que todos los Mycoplasmas presentes en las muestras estarían bajo la misma presión de selección, por lo que el estudio de numerosas partes del genoma aportaría mayor información.
Un estudio anterior realizado en Europa11 analiza la diversidad de M. hyopneumoniae, utilizando además de la secuenciación del gen p146, la detección por PCR de los genes codificantes de un elemento repetitivo (REP) y un transportador ABC putativo8. Sin embargo, concluyen que la inclusión de estos 2 genes en el estudio no aumentó significativamente el poder de discriminación, que ya de por sí era alto. Los autores pudieron identificar cepas específicas de un mismo establecimiento y demostrar que existe una gran variabilidad entre aislamientos de diferentes granjas y localización geográfica, así como también señalaron que el número de repeticiones y la secuencia de la región flanqueante se mantienen en una cepa luego de numerosos repiques.
El presente estudio genera antecedentes en el país y en la región acerca de la diversidad genética de M. hyopneumoniae, un importante patógeno con alta prevalencia en Argentina7 y en el mundo. El conocimiento de la circulación de diferentes cepas resulta muy útil para estudios epidemiológicos, de patogénesis y de evaluación de estrategias de control. Además, serían útiles estudios para la caracterización molecular y comparación de las cepas circulantes con las vacunales utilizadas actualmente en nuestro país, ya que las mismas constituyen una de las herramientas de control más importantes de la NEP y ha sido demostrado que ni la infección previa, ni la vacunación con cepas de M. hyopneumoniae de baja virulencia protegen de la infección con cepas de alta virulencia23, 24. Las cepas vacunales usadas en nuestro país son las mismas que las utilizadas en otras partes del mundo y si bien existen antecedentes en la caracterización genómica5, incluso proteómica4, 13 de algunas de estas cepas, no existen trabajos que las comparen entre sí, ni con las cepas circulantes. Estos estudios contribuirían a conocer el rol que juega la variabilidad genética respecto a la presentación clínica e inmunidad contra la enfermedad. Dado que los VNTRs estudiados ocurren dentro de secuencias codificantes, los cambios en el número de repeticiones pueden generar variantes de las proteínas que podrían tener impacto sobre la virulencia o inmunogenicidad. Según el conocimiento de los autores, es la primera vez que se informan diferencias entre cepas de M. hyopneumoniae en Argentina aplicando esta metodología de tipificación genética.

Conclusiones

Mediante la metodología de tipificación empleada en este trabajo se evidenció la presencia en nuestro país de distintas cepas de M. hyopneumoniae , pudiendo presentarse varias en una misma granja. El método posee la ventaja de permitir caracterizar al microorganismo sin la necesidad de obtener un cultivo puro, lo cual, en el caso de este patógeno, es muy difícil. El desarrollo de la nPCR para lograr la amplificación y posterior secuenciación de la región R3 del gen p146 fue de utilidad para el análisis de las muestras correspondientes a hisopados nasales, las cuales no habían podido ser amplificadas en ensayos de PCR convencionales.

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