ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Relación músculo-hueso en ratones de una población segregante discriminados por sus patrones de crecimiento en peso corporal y longitud caudal

Pippa, C¹.; Di Masso, R.J.²

¹Instituto de Genética Experimental. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Rosario.
²Cátedra de Genética. Facultad de Ciencias Veterinarias-UNR. Ov. Lagos y Ruta 33. Casilda (2170).

Correspondencia e-mail: Ricardo José Di Masso rjdimasso@gmail.com

Recibido: 10/04/2013
Aceptado: 09/05/2014

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Resumen

La hipótesis de Hooper plantea que la placa epifisaria de los huesos largos actúa como un marcapasos estableciendo el ritmo del crecimiento muscular-esquelético y afectando en forma secuencial el crecimiento longitudinal del hueso, la masa de los músculos que en él se insertan y el peso del hueso. La adecuación de la misma a la caracterización de la relación músculo-hueso en el ratón se estudió en machos (n=326) y hembras (n=332) de una población segregante (F2) derivada del cruzamiento entre dos líneas seleccionadas por conformación corporal con diferencias significativas en la biomasa total sustentada pero no en la longitud de sus fémures. Los animales se discriminaron por los patrones dinámicos de crecimiento en peso corporal y longitud caudal caracterizados por los valores de los estimadores de tamaño asintótico y tasa de maduración derivados de la función de Gompertz. La variable relación músculo-hueso se evaluó a partir del comportamiento de cinco indicadores: peso del fémur, peso de la tibia, longitud del fémur, longitud de la tibia y peso del músculo tríceps sural. Tomando en consideración ambos patrones dinámicos de crecimiento los resultados corroboran la función de marcapaso de la placa epifisaria para el crecimiento muscular-esquelético postulada por Hooper.

Palabras clave: Peso corporal; Longitud caudal; Fémur; Tríceps sural.

Muscle-bone relationship in mice from a segregating population discriminated by their body weight and tail length growth patterns

Summary

According to Hooper's hypothesis the growth plate acts as a pacemaker to set the pace of skeletal and muscle growth in a sequence that affects the longitudinal growth of bone, muscle mass and the weight of the bone. Its adequacy for characterizing the muscle-bone relationship in the mouse was studied in male (n=326) and female (n=332) mice belonging to a segregating population derived from a cross between two lines selected for body conformation with significant differences in total biomass supported but not in the length of their femurs. Mice were discriminated by their dynamic patterns of skeletal (tail length) growth and biomass (body weight) deposition characterized by the asymptotic size and maturation rate values estimated by the Gompertz function. The behavior of five indicators of muscle-bone relationship: femur and tibia weight, femur and tibia length and triceps surae muscle weight was studied. Regarding both, body weight and skeletal length growth patterns, the results corroborate the role of pacemaker on muscle and skeletal growth proposed for the epiphyseal plate by Hooper's hypothesis.

Key words: Body weight; Tail length; Femur; Triceps surae.

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Introducción

La relación músculo-hueso en el ratón puede ser considerada como un fenotipo complejo en tanto supone la modificación simultánea de la longitud del hueso, el peso del músculo que en él se inserta y el peso del hueso⁷. La proporcionalidad observada en el crecimiento de músculos y huesos ha sido atribuida al nexo biomecánico que liga a ambos componentes corporales y a la adaptación que sufren los huesos a las fuerzas musculares durante el desarrollo²³. Hooper^18,19 propuso la hipótesis que la placa epifisaria ubicada entre la epífisis y la diáfisis de los huesos largos actuaría como un marcapasos imprimiendo el ritmo del crecimiento óseo-muscular. De acuerdo con esta hipótesis el aumento de la tensión generada como consecuencia del crecimiento longitudinal del hueso produce un aumento concomitante en la masa de los músculos que en él se insertan. Esa mayor masa muscular se refleja posteriormente en un mayor peso del hueso. El estudio de las relaciones músculo-hueso en cuatro líneas de ratones (CBi-, CBi+, CBi/L y CBi/C) seleccionadas por conformación corporal y en la línea CBi, testigo sin selección⁹, mostró que las líneas CBi- (bajo peso y esqueleto corto) y CBi+ (alto peso y esqueleto largo), seleccionadas a favor de la correlación genética positiva entre peso corporal y longitud caudal, diferían en la longitud de sus huesos y en el peso del músculo asociado tal como era de esperar como consecuencia de la modificación alométrica de su conformación corporal y de la relación propuesta entre el crecimiento longitudinal del hueso y el peso del músculo. Por el contrario, las líneas CBi/L (bajo peso y esqueleto largo) y CBi/C (alto peso y esqueleto corto), seleccionadas en contra del signo de la correlación mencionada y con una modificación no armónica de su conformación corporal, no difirieron en la longitud de sus huesos pero sí en el peso del músculo. Este resultado puso de manifiesto la posibilidad de modificar la relación músculohueso postulada por Hooper, permitiendo alargar el hueso mediante presión de selección positiva aplicada sobre la longitud del esqueleto y evitar la respuesta esperada sobre la masa muscular seleccionando simultáneamente por bajo peso corporal. El objetivo de este trabajo fue estudiar la relación músculo-hueso, desde la perspectiva planteada por la hipótesis de Hooper, en ratones machos y hembras pertenecientes a una población segregante (generación F2) discriminados por los patrones dinámicos de crecimiento del esqueleto y de deposición de biomasa. En el contexto de este trabajo la relación músculo-hueso se consideró una variable compleja y se la caracterizó a partir de los valores de cinco indicadores: la longitud del fémur, la longitud de la tibia, el peso del fémur, el peso de la tibia y el peso del músculo tríceps sural. Los patrones de crecimiento se estimaron a partir de los ajustes de los datos longitudinales longitud caudal vs. edad cronológica y peso corporal vs edad cronológica respectivamente teniendo en cuenta que la longitud caudal ha sido propuesta y utilizada como un indicador de la longitud del esqueleto^2,5,10,15,22 y que el peso corporal es la variable más ampliamente utilizada como indicador de la biomasa total en estudios dimensionales del crecimiento. La población estudiada deriva del cruzamiento entre dos de las líneas seleccionadas por conformación corporal (CBi/C y CBi/L), con diferencias significativas en la biomasa total sustentada pero no en la longitud de sus fémures^8,11.

Materiales y métodos

Se utilizaron ratones pertenecientes a una población segregante (F2) generada, en el marco de un proyecto de identificación de QTL (quantitative traits loci) relacionados con el crecimiento dimensional, a partir de los cruzamientos recíprocos entre dos líneas seleccionadas por conformación corporal⁴. Las líneas parentales (CBi/L: baja biomasa-esqueleto largo y CBi/C: alta biomasa-esqueleto corto) difieren en peso corporal adulto (media ± error estándar - CBi/L Machos: 32,0 g ± 0,39, CBi/L Hembras: 25,6 g ± 0,21; CBi/C Machos: 51,7 g ± 0,82, CBi/C Hembras: 47,6 g ± 0,98) pero no muestran diferencias en la longitud de sus fémures (media ± error estándar - CBi/L Machos: 16,8 mm ± 0,08, CBi/L Hembras: 17,0 mm ± 0,07; CBi/C Machos: 16,7 mm ± 0,06, CBi/C Hembras: 17,2 mm ± 0,06).
Todos los animales utilizados (326 machos y 332 hembras) provenían de camadas estandarizadas a ocho crías al nacimiento y se criaron a partir del destete en grupos de seis individuos del mismo sexo, en cajas de polipropileno (32x24x10 cm) provistas con viruta de madera. Durante todo el experimento recibieron agua y alimento balanceado (Cargill Rata-Ratón) ad libitum y se mantuvieron en un ambiente controlado con una temperatura de 23 ± 1 ºC y un fotoperíodo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Los animales se manejaron de acuerdo con las indicaciones del Institute for Laboratory Animal Resources¹⁴. Los ratones se sacrificaron a los 150 días de edad por exposición al CO₂. Inmediatamente después del sacrificio se les extrajeron los músculos tríceps sural (sóleo y gemelos) derecho e izquierdo y se registró su peso en balanza de precisión con aproximación a la décima de miligramo. Posteriormente se extrajeron los fémures y las tibias de ambos miembros, se los limpió a mano para despojarlos de todos los restos de tejidos blandos, se los pesó en balanza de precisión con aproximación a la décima de miligramo y se midió su longitud con un calibre con aproximación al mm⁴.
A los efectos del análisis se trabajó con los valores promedio de cada uno de los cinco indicadores registrados en cada individuo (peso promedio de ambos fémures, peso promedio de ambas tibias, longitud promedio de ambos fémures, longitud promedio de ambas tibias y peso promedio de ambos músculos).
A intervalos regulares cada tres días, entre el nacimiento y la edad de sacrificio, se registró, en todos los animales y en forma individual, el peso corporal, como estimador de la biomasa total, y la longitud caudal, como estimador de la longitud del esqueleto ^2,5,10,15,22.
Los datos longitudinales peso corporal - edad cronológica y longitud caudal - edad cronológica se ajustaron con la función sigmoidea de Gompertz¹³:
Yt = A exp (- b exp (-kt))
donde:
Yt = peso corporal (g) o longitud caudal (cm) en el tiempo t
A = valor de Yt cuando t → ∞ (peso corporal asintótico o longitud caudal asintótica)
b = parámetro de posición, constante de integración sin significado biológico
k = tasa de maduración para el carácter (peso corporal o longitud caudal) = velocidad de aproximación al valor asintótico.
t = edad cronológica en semanas

Los animales, machos y hembras por separado, se discriminaron en función de los valores de los estimadores de los parámetros A y k correspondientes a cada uno de los ajustes mencionados. En ambos casos se definieron cuatro grupos (Grupo I: altos valores de A y k; Grupo II: bajos valores de A y k; Grupo III: altos valores de A y bajos de k, y Grupo IV: bajos valores A y altos de k) caracterizando como bajos aquellos valores menores al promedio de la variable considerada en el conjunto de individuos del mismo sexo y como altos aquellos que superaban dicho promedio.
El efecto del grupo de pertenencia sobre los cinco indicadores de la relación músculo-hueso (peso del fémur, peso de la tibia, longitud del fémur, longitud de la tibia y peso del músculo tríceps sural) se evaluó, en cada sexo por separado, con un análisis de la variancia a un criterio de clasificación seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni²⁴.

Resultados

Las Tablas 1 y 2 muestran los valores de los cinco indicadores de la relación músculo hueso en los cuatro grupos resultantes de discriminar respectivamente a machos y hembras por el patrón dinámico de modificación de la biomasa sustentada. Los animales con alto peso corporal asintótico (Grupos 1 y 3) difieren en el peso de los dos huesos considerados, en función de la tasa de maduración para peso corporal (velocidad para alcanzar dicha asíntota). El Grupo 1, de mayor tasa de maduración, presentó huesos más pesados. No se observó ningún efecto de la divergencia en la tasa de maduración sobre la longitud de los huesos como así tampoco en el peso del músculo. Con baja biomasa (Grupos 2 y 4) se observa el mismo comportamiento con un efecto de la tasa de maduración para peso corporal sobre el peso de los huesos pero no sobre su longitud y por ende tampoco sobre el peso del músculo. Esta respuesta fue común a machos y a hembras si bien el efecto sobre el peso del hueso alcanzó significado estadístico sólo en las segundas. Con respecto al patrón dinámico de crecimiento del esqueleto evaluado a partir de la modificación de la longitud caudal (Tablas 3 y 4) se observa que con altos valores de longitud caudal asintótica (Grupos 1 y 3), la tasa de maduración para el carácter no afectó ni la longitud ni el peso de los huesos como así tampoco el peso de los músculos. Sólo se observó un efecto significativo sobre el peso del fémur en los machos correspondiendo huesos más pesados, en promedio, a los animales de mayor tasa de maduración para crecimiento del esqueleto (Grupo 1). En las hembras no se observaron diferencias significativas en ninguno de los cinco indicadores, si bien las tendencias observadas fueron, en general, coincidentes con lo descrito en machos. Con baja longitud caudal asintótica (Grupos 2 y 4) se observa un efecto significativo de la tasa de maduración sobre la longitud del hueso correspondiendo mayor longitud a los animales con mayor tasa de maduración diferencia que alcanzó el significado estadístico en el caso de la tibia. Los animales con mayor tasa de maduración presentaron también músculos más pesados y tendieron a presentar huesos más pesados sin alcanzar la diferencia entre grupos significado estadístico en este carácter. Este comportamiento fue común a machos y hembras.

Tabla 1. Relación músculo hueso en machos de una población segregante de ratones discriminados por su patrón de crecimiento en biomasa

Tabla 2. Relación músculo hueso en hembras de una población segregante de ratones discriminadas por su patrón de crecimiento en biomasa.

Tabla 3. Relación músculo hueso en machos de una población segregante de ratones discriminados por el patrón de crecimiento de su esqueleto

Tabla 4. Relación músculo hueso en hembras de una población segregante de ratones discriminadas por el patrón de crecimiento de su esqueleto

Discusión y conclusiones

Los organismos modelo, desde las bacterias a Drosophila sp., desde Saccharomyces sp. al pez cebra y desde Caenorhabditis sp. al ratón, por citar sólo a algunos de ellos, han jugado un papel de innegable trascendencia en la historia de los estudios biológicos, tanto en la identificación de genes relacionados con estados patológicos como en la caracterización de las funciones normales. Su importancia, lejos de diluirse ante los avances tecnológicos, se reafirma día a día¹. El ratón de laboratorio es una especie ampliamente utilizada en este sentido, de gran utilidad en la caracterización de la arquitectura genética de fenotipos complejos. El gran número de líneas disponibles no sólo ha posibilitado el contraste empírico de numerosos postulados teóricos sino que mantienen su utilidad como material para estudios biológicos de muy diferente índole¹⁶. La utilización de una población segregante numerosa de ratones permitió identificar individuos con diferentes combinaciones de los estimadores de los parámetros que definen la curva de crecimiento en peso corporal y en longitud caudal y relacionar dicha particularidad con cinco indicadores de la relación músculohueso considerada en sí misma como un fenotipo complejo⁷. La presencia de efectos heteróticos sobredominantes observada en los individuos F1 derivados de los cruzamientos recíprocos entre las dos líneas utilizadas en este trabajo¹¹ permitió postular la existencia de dos fuentes de variancia genética para longitud del fémur. De acuerdo con esta propuesta los genes involucrados en la modificación de dicha variable serían diferentes según la compatibilidad (CBi/L: baja biomasa en un esqueleto largo) o incompatibilidad (CBi/C: alta biomasa en un esqueleto corto) del criterio selectivo con la función del esqueleto de sostén de los tejidos blandos. La segregación esperada en la población F2, de acuerdo con los postulados de la genética mendeliana clásica, ofrece la posibilidad de contar con múltiples combinaciones de dichos genes y, por ende, con diferentes genotipos asociados con la longitud del fémur. El análisis se llevó a cabo desde el marco teórico propuesto por Hooper^18,19 en su hipótesis según la cual la placa epifisiaria de los huesos largos actuaría como un marcapasos para el crecimiento muscular-esquelético. Cuando se toma como referencia el patrón de aumento de peso corporal, en aquellos individuos que sustentan mayor biomasa -valores asintóticos mayores al promedio del grupo-, la diferente tasa de maduración se refleja en el peso de los huesos correspondiendo mayor peso de los mismos a los animales de mayor madurez, es decir, aquellos que están más cerca del peso asintótico, pero no en la longitud de los huesos que fue la misma, independientemente de las diferencias significativas en las tasas de maduración. El peso del músculo, en coincidencia con la respuesta observada en la longitud del hueso, tampoco difirió entre animales con alta y baja tasa de maduración para peso corporal corroborando la función de marcapasos de la placa epifisiaria postulada por Hooper. El mayor peso observado en los huesos no puede atribuirse, por lo tanto, a diferencias en el peso del músculo que sustentan sino que refleja el diferente recorrido efectuado por los animales de uno y otro grupo -diferente tasa de maduración- hacia el mismo peso maduro. Los individuos más maduros tienen huesos más pesados. A igual asíntota, los animales con alto valor de k presentaron fémures y tibias más pesados. Cuando estas relaciones se estudian en el marco de la discriminación de los animales por el patrón dinámico de crecimiento de sus esqueletos, los resultados indican que a mayor longitud asintótica del esqueleto corresponde mayor longitud del hueso y mayor peso del músculo. Esta relación es más significativa en los animales con baja longitud asintótica del esqueleto y en los machos -sexo con mayor ímpetu de crecimiento y mayor desarrollo muscular- que en las hembras. A igual asíntota, el mayor peso muscular de los animales con mayor tasa de maduración atribuible a la mayor longitud del hueso se traduce en un mayor peso de éste, corroborando nuevamente las predicciones derivables de las hipótesis de Hooper y sumando evidencia empírica a la derivada de la discriminación de los mismos animales por su conformación corporal evaluada en tres edades²¹. De acuerdo con la hipótesis de Hooper^18,19 puesta en discusión en este trabajo, la modificación en el peso de los huesos largos resulta de modificaciones en el peso de los músculos que en ellos se insertan las que a su vez resultan de modificaciones en la longitud del hueso. Ello no excluye la participación de otros factores capaces de modificar el peso de los huesos aún en ausencia de modificaciones en la longitud de los mismos tal como se mencionó previamente al discutir el efecto de la tasa de maduración para peso corporal en los animales que sustentan alta biomasa. A este respecto se cuenta con una extensa bibliografía^6,12,20 referida a la acción de procesos que sin modificar significativamente el largo del hueso pueden afectar el ancho, el espesor y la distribución del material óseo modificando, consecuentemente, el peso de los mismos. Balling³ ha puntualizado que uno de los mayores desafíos de la biología actual es simular, y eventualmente predecir, el comportamiento de los sistemas biológicos complejos. Si bien las herramientas derivadas del paradigma molecular vigente y las múltiples disciplinas "ómicas" -genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica- que lo conforman son trascendentes al momento de identificar los componentes individuales de dichos sistemas, también resultan insuficientes. El logro del objetivo central mencionado requiere contar con información detallada acerca de la red arquitectónica que caracteriza estructuralmente al sistema así como también de su dinámica. Los modelos animales generados por procesos selectivos a largo plazo como el utilizado en este trabajo representan, en tal sentido, herramientas útiles para avanzar en la caracterización de los fenotipos complejos¹⁷.

Agradecimientos: Los autores agradecen la participación de dos evaluadores anónimos que con sus comentarios contribuyeron a mejorar la versión original del manuscrito.

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