ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Susceptibilidad antibiótica de estafilococos aislados de muestras de leche provenientes de mastitis bovina

Srednik, M.E.¹; Abate, S.² y Gentilini, E.R.¹

¹Cátedra de Microbiología. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad de Buenos Aires. Chorroarín 280 (C1427CWO) Buenos Aires, Argentina.
²Actividad privada.

Correspondencia e-mail: Élida Gentilini egenti@fvet.uba.ar

Recibido: 07/09/2015
Aceptado: 19/05/2016

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Resumen

La mastitis es una enfermedad que afecta la salud de los bovinos y produce grandes pérdidas económicas. Los microorganismos de mayor prevalencia en la Argentina pertenecen al género Staphylococcus, siendo el patógeno principal S. aureus, aunque los estafilococos coagulasa negativos (ECN) han adquirido importancia por la capacidad de expresar factores de virulencia y resistencia a antimicrobianos. El objetivo de este estudio fue determinar in vitro la concentración inhibitoria mínima (CIM) de betalactámicos y macrólidos-lincosamidas frente a estafilococos aislados de leche de vacas con mastitis. Se estudiaron (n=162) aislamientos, (n=65) S. aureus y (n=97) ECN. El 33,8% (22/65) de S. aureus presentó resistencia a penicilina, siendo la CIM₉₀: 0,5 μg/ml, el 7,7% (5/65) a eritromicina con una CIM₉₀: 1 μg/ml y el 6,1% (4/65) a clindamicina con una CIM₉₀: 0,1 μg/ml. El 30,9% (30/97) de los ECN fueron resistentes a penicilina siendo la CIM₉₀: 0,25 μg/ml, el 7,2% (7/97) a eritromicina con una CIM₉₀: 0,5 μg/ ml, el 4,1% (4/97) a clindamicina con una CIM₉₀: 0,12 μg/ml y el 3,1% (3/97) a oxacilina siendo la CIM₉₀: 0,38 μg/ml. No se observó meticilino resistencia en S. aureus. El diagnóstico bacteriológico y la determinación de susceptibilidad junto con el manejo adecuado del rodeo lechero, son fundamentales para el control de la enfermedad.

Palabras clave: Concentración inhibitoria mínima; Mastitis bovina; Resistencia; Staphylococcus spp.

Antibiotic susceptibility of staphylococci isolated from bovine mastitis milk samples

Summary

Mastitis is a disease that affects the health of cattle and causes great economic losses. The most prevalent microorganisms in Argentina belong to the genus Staphylococcus, being the main pathogen S. aureus, though coagulase-negative Staphylococci (CNS) have gained importance for the ability to express virulence factors and antimicrobial resistance. The aim of this study was to determine phenotypically in vitro minimum inhibitory concentrations of betalactams and macrolide-lincosamide against staphylococci isolated from mastitic milk. We studied (n=162) isolates, (n=65) S. aureus and (n=97) CNS. The 33,8% (22/65) of S. aureus presented resistance to penicillin, being the MIC⁹⁰: 0,5 μg/ml, the 7,7% (5/65) to erythromycin with a MIC₉₀: 1 μg/ml and 6,1% (4/65) to clindamycin with a MIC₉₀: 0,1 μg/ml. The 30,9% (30/97) of CNS were resistant to penicillin being the MIC₉₀: 0,25 μg/ml, the 7,2% (7/97) to erythromycin with a MIC₉₀: 0,5 μg/ml, the 4,2% (4/97) to clindamycin with a MIC₉₀: 0,12 μg/ml and 3,1% (3/97) to oxacillin being the MIC₉₀: 0,38 μg/ml. Methicillin-resistance was not observed in S. aureus. Bacteriological diagnosis and susceptibility determination with proper management of dairy herd are essential for disease control.

Key words: Bovine mastitis; Minimum inhibitory concentration; Resistance; Staphylococcus spp.

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Introducción

La mastitis afecta la salud de los animales con disminución de la producción, calidad de leche y de los subproductos, con consecuencias económicas negativas.
Entre las bacterias que aparecen como potenciales patógenos, los estafilococos, estreptococos y bacilos gran negativos son los microorganismos mas frecuentemente involucrados como agentes etiológicos de esta enfermedad. Dentro del Género Staphylococcus, Staphylococcus aureus es considerado el patógeno mayor de la glándula mamaria. Los ECN constituyen un grupo bacteriano con alta frecuencia de aislamientos y tradicionalmente fueron considerados patógenos menores comparándolos con S. aureus. Su participación en las mastitis era debatida, actualmente se sabe que son capaces de persistir en la glándula mamaria y causar un moderado incremento en el recuento de células somáticas en leche. Responden mejor al tratamiento antibiótico que S. aureus, aunque la resistencia (R) en los ECN es más común que en S. aureus^17,13.
La identificación bacteriana y la determinación de la susceptibilidad a los antibióticos (ATB), nos permite inferir sobre la virulencia del aislamiento y la elección de la antibióticoterapia adecuada.
Es sabido que los ECN son reservorios de genes de resistencia a antimicrobianos (ATM)^2,7,16, por lo que el monitoreo continuo de la resistencia de estos microorganismos frente a los antibióticos permitirán el manejo más racional de los mismos con el consiguiente beneficio para el animal, el productor y la salud pública. Recientes estudios han demostrado que humanos y ganado bovino comparten S. epidermidis, aunque es difícil demostrar la dirección de la transmisión interespecie, pero se sugiere que sería desde el humano al ganado¹⁶.
El objetivo de este estudio fue determinar in vitro, la susceptibilidad de estafilococos aislados de leche de bovinos con mastitis, frente a penicilina, oxacilina/cefoxitina, macrolidoslincosamida, ATB de uso convencional en la práctica clínica para el control de la enfermedad. .

Materiales y Métodos

Aislamientos: (n=162) obtenidos a partir de muestras de leche de vacas y vaquillonas con mastitis provenientes de diferentes establecimientos de la Provincia de Bs. As., Córdoba, Entre Ríos y Santa Fe. Todos los estafilococos fueron aislados en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Veterinaria de la UBA, entre los años 2007 y 2010. El aislamiento e identificación bacteriana se realizaron según los procedimientos estándares descriptos en el National Mastitis Council¹⁰ y fueron mantenidos a -20°C en caldo tripteína soja (Britania S.A.) con glicerol al 10%. Se estudiaron (n=97) ECN y (n=65) Staphylococcus aureus.
Metodología: Las soluciones madres de cada ATB: penicilina (PEN), eritromicina (ERI), clindamicina (CLI) y oxacilina (OXA), de droga pura y potencia conocida donados por el ANMAT, se prepararon según el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)³ y se conservaron a –20 ºC hasta el momento de ser utilizadas. Cada ATB se incorporó en agar Mueller Hinton, realizando diluciones seriadas en base 2 (1, 2, 4, 8, 16 μg/ml, etc.). La densidad del inóculo correspondió a una turbidez equivalente al patrón 0,5 del nefelómetro de Mc Farland. Los ensayos se realizaron utilizando el multi-inoculador de Steers. La suspensión bacteriana para la siembra se diluyó 1/10 en caldo estéril o solución fisiológica para lograr una concentración de 107 UFC/ml en cada pocillo de la placa de teflón. El inóculo final sobre el agar fue de 10⁴ UFC (2μl). Se inoculó una placa control de agar sin ATB (control de viabilidad) y luego se inocularon las que contienen las distintas concentraciones del ATB comenzando por la de menor concentración. Se utilizó como cepa control S. aureus ATCC 29213. Las lecturas se realizaron después de incubar toda una noche a 35 +/- 2 ºC. Los puntos de corte para determinar la resistencia fueron: para PEN (≥0,25 μg/ml), OXA (≥4 μg/ml, en S. aureus y ≥0,5 μg/ml en ECN), para ERI (≥8 μg/ml), según las recomendaciones del CLSI3. El punto de corte de CLI (≥4 μg/ml), se utilizó para detectar R a lincomicina. La CIM se registró como el valor de la menor dilución que inhibió completamente el desarrollo bacteriano. No se consideró el desarrollo de una simple colonia o la presencia de una tenue película causada por el depósito del inóculo. En los ECN que resultaron con CIMs de OXA ≥0,5 μg/ml, se evaluó la resistencia a la meticilina, con antibiograma por difusión con discos (BBL^®) de cefoxitina de 30 μg (FOX). Los aislamientos resistentes a FOX (24 mm, CIM no definida) indica la presencia del gen mecA y en consecuencia la resistencia a todos los betalactámicos (CLSI) ³. .

Resultados

Del total de los estafilococos estudiados, el 35,2 % (n=57) mostró R a los ATB probados, correspondiendo a S. aureus el 15,43% (n=25) y a los ECN el 19,75% (n=32). De los 65 S. aureus, 25 (38,5%) fueron R, 20 de estos aislamientos (30,77%) presentaron R a un ATB y 5 aislamientos (7,69%) a 2 o más ATB.
La actividad in vitro de cada uno de los agentes antimicrobianos ensayados para S. aureus están presentados en la Tabla 1.

Tabla 1. Valores medios de ganancia diaria de peso (GDP) y proporción (%) de animales con tos en los muestreos de las 6 (recría) y 12 (desarrollo) semanas de edad en cada una de las granjas.

*CIM: Concentración inhibitoria mínima
** R: resistencia

De los 97 ECN, 32 (31,04 %) fueron R a uno o más ATB. La resistencia a un ATB se halló en 26 estafilococos (26,80%). La resistencia a 2 o más ATB se halló en 6 estafilococos (6,32%).
La actividad in vitro de cada uno de los agentes antimicrobianos ensayados para ECN están presentados en la Tabla 2.

Tabla 2. Susceptibilidad in vitro de (n=97) ECN frente a 4 antimicrobianos

*CIM: Concentración inhibitoria mínima
** R: resistencia

Discusión

Los valores de R de ECN frente a PEN, en nuestro país, son similares a los obtenidos en Netherlands¹⁶, quienes informaron un 25,88%, pero un valor de R a OXA más elevado (21,76%), la R a un ATB fue de 30% coincidiendo con nuestros resultados, y la R a uno o más ATB fue de 21%, un poco más elevado que nuestros resultados. Los valores de R de ECN frente a PEN son menores que los informados en Finlandia (32%)¹¹, en Dinamarca (36,1%)¹, y en Estados Unidos (42,7%)¹². Los resultados obtenidos para los ECN frente a ERI y CLI coinciden con lo informado por Lüthje y Schwartz⁹. La R frente a ERI es un poco mayor que la informada por Sampimon (1,76%)¹⁶
Los valores de R de S. aureus frente a PEN son menores que los obtenidos en Finlandia (52%)¹¹, y mucho más bajos en comparación a los reportados en Brasil (75%)⁴.
Ningún aislamiento de S. aureus presentó resistencia frente a OXA, esto coincide con estudios realizados en nuestro país^7,15.
Todos los estafilococos resistentes a ERI fueron resistentes a clindamicina. Los macrólidos-lincosamidas (ML) inhiben la síntesis proteica al unirse al sitio ribosómico 50S. En general existe resistencia cruzada completa entre lincomicina y clindamicina y también con los macrólidos y grupo B de las estreptograminas (fenotipo de resistencia MLS). Clindamicina es más activa que lincomicina frente a S. aureus y ECN^6,7.
Los valores de R de S. aureus frente a ERI y CLI son mucho menores que las obtenidas en China (93, 1% y 36,1% respectivamente)¹⁸. Muchas veces la R a ML no puede detectarse en los test iniciales de susceptibilidad y por lo tanto debe ser inducida. En Reino Unido, Rich y col.¹⁴ informaron un fenotipo de resistencia inducible (iML) del 71, 8% en cepas de S. aureus aisladas de animales, mientras que en China, Wang y col. informaron un 52,8% de S. aureus iML aislados de mastitis bovina¹⁸. Esto demuestra un riesgo potencial de falla en la terapéutica para el tratamiento de mastitis clínicas en bovinos infectados con estas cepas con R inducible. Por ello es necesario un monitoreo de rutina de R inducible para S. aureus aislados de leches de vacas con mastitis.
El tipo de resistencia MLS en ECN aislados de bovinos no es un problema terapeutico⁹. Sin embargo, debido al potencial de diseminación de resistencia a través de patógenos y diferentes especies hospedadoras, el monitoreo de resistencia ML entre ECN aislados de bovinos es importante¹⁶. Nuestro grupo de trabajo⁵ viene realizando un monitoreo constante de la R en cocos gran positivos, y ha observado variaciones dependientes de multiples factores de acuerdo a distintas situaciones (económicosocial del país, climáticas, entre otras). Con respecto a informes previos durante la última década⁵, nuestros resultados muestran un incremento de R para PEN, pero la R para ERI y CLI se mantiene en valores bajos.
Del estudio de susceptibilidad de los estafilococos frente a los ATM, resulta que el porcentaje de resistencia es bajo y coincide con lo informado por otros autores^7,15,16.
El conocimiento del perfil de susceptibilidad de los estafilococos permitiría un manejo efectivo de los ATM para controlar las infecciones de la glándula mamaria.
Con el uso racional y selectivo de los ATM, el control de las mastitis producidas por los estafilococos responderá a las mejores prácticas de manejo en la rutina de ordeñe.
La mastitis es la enfermedad más costosa de la producción lechera, debido al refugo de animales de buena genética y en edad de alta producción, y el dinero gastado en medicamento y servicio veterinario, además de sus implicancias en la salud pública por el riesgo de la presencia en leche y subproductos lácteos de residuos de antimicrobianos así como bacterias que podrían poseer genes de virulencia y resistencia a ATM.

Agradecimientos: Este trabajo se realizó gracias al financiamiento otorgado por UBACyT W766. Mastitis Bovina: Atributos de Patogenicidad.

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