ARTÍCULOS

Estructura genética de poblaciones de Phytophthora capsici en el noreste de la provincia de Buenos Aires, Argentina

 

Iribarren, M.J.^1*; Borassi, C.¹; Ferri, A.²; González, B¹; Steciow, M.³; Guillín, E.²

¹Universidad Nacional de Luján (UNLu). Luján (6700). Bs. As., Argentina.
²Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Hurlingham (1686). Bs. As., Argentina.
³Universidad Nacional de La Plata. La Plata (1900). Bs. As. Argentina.
*Correo electrónico: maria.josefina.iribarren@gmail.com

Recibido 03 de junio de 2014
Aceptado 02 de noviembre de 2015
Publicado online 11 de mayo de 2016

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RESUMEN

Phytophthora capsici causa enfermedades destructivas en todo el mundo. El patógeno es heterotálico y los dos tipos de apareamiento (TAs) son requeridos para la reproducción sexual. La razón de TAs varía entre regiones geográficas y por lo tanto también la chance para reproducirse sexualmente. Si se toma en cuenta que la durabilidad de las medidas de control depende de la variación genética, es aconsejable considerar la cantidad y la distribución de variación genética dentro y entre poblaciones de especies, es decir, la estructura genética. Esta está determinada por factores que influencian la evolución poblacional como la mutación, la deriva genética, el flujo genético, el sistema de reproducción y de selección. En este sentido, poco se conoce sobre las poblaciones de P. capsici en Argentina. El objetivo fue evaluar la variabilidad genética de aislamientos de P. capsici de tres sitios de producción hortícola del NE de Buenos Aires. Sesenta y un aislamientos de P. capsici colectados de cultivos de Capsicum annuum, Solanum melongena, Solanum lycopersicum y Cucurbita spp. fueron identificados morfológicamente y analizados por tipo de reproducción. Los aislamientos fueron identificados por técnicas moleculares basadas en las secuencias de las regiones ITS1-5.8S e ITS2 del ADNr. Se definieron los haplotipos para cada aislamiento y los parámetros poblacionales fueron estimados por zona geográfica y por especie hospedante junto con el número mínimo de eventos de recombinación. Las desviaciones de la coalescencia básica fueron estimadas a través de Tajima´s D.; la estructura genética fue evaluada subsecuentemente a través de pruebas de AMOVA y de estimadores de Fst. La reconstrucción de redes filogenéticas fue analizada con la intención de evaluar las relaciones genealógicas entre haplotipos. Todos los aislamientos mostraron características morfológicas y genéticas típicas de P. capsici y pertenecieron al TA A1. No se evidenció una estructura genética cuando fueron incluidas como criterio de partición las especies hospedantes. Sin embargo, la partición geográfica permitió evidenciar alguna estructuración entre poblaciones, con la excepción de Exaltación de La Cruz que resultó el sitio más contrastante con respecto a ambos estimadores de índices de fijación. Al mismo tiempo, esta ubicación redituó los estimadores más bajos de diversidad, lo que probablemente refleja su origen reciente como zona hortícola. Dos a tres eventos de recombinación fueron detectados, lo que sugiere que la reproducción sexual podría haber influido sobre el proceso de diversificación en esta área. La estructura genética y los niveles de variación en esta región son opuestos a los resultados obtenidos por otros investigadores en la región centro oeste de Argentina y podría significar una amenaza para esta área de cultivo, al presente.

Palabras clave: P. capsici; Cucurbita spp.; Tipo de apareamiento; Haplotipo.

ABSTRACT

Phytophthora capsici causes destructive diseases worldwide. The pathogen is heterothallic and the two mating types (MTs) are required for sexual reproduction. MTs rates vary amongst geographical regions and so does the chance for sexual reproduction. Taking into account that the durability of control measures depends upon genetic variation, it is advisable to consider its structure within and between populations. The objective of the present paper was to evaluate the genetic variability of P. capsici isolates from three horticultural production areas of the Northeast of Buenos Aires. Sixty one isolates of P. capsici collected from Capsicum annuum, Solanum melongena, Solanum lycopersicum and Cucurbita spp. crops were morphologically identified and analyzed for MTs. The isolates were further identified via molecular techniques based on the sequences of the ITS1 - 5.8S - ITS2 region of the ADNr. Haplotypes were defined for every isolate, and population parameterts were estimated both for geographic and hostspecies partitions, along with the minimum number of recombination events. Departures from the basic coalescent were estimated through Tajima´s D; the genetic structure was subsequently evaluated through AMOVA tests and Fst estimations. Phylogenetic network reconstruction was analysed in an attempt to assess genealogical relationships amongst haplotypes. All isolates showed morphological and genetic characteristics of P. capsici and belonged to the A1 MT. No genetic structure was detected when host-species was taken as a criterion for partition; on the other hand, geographic partition detected some structure among populations, with Exaltación de La Cruz resulting in the most contrasting site with regards to both fixation index estimates. At the same time, this location yielded the lowest estimates of diversity, probably reflecting its recent horticultural origin. Two to three recombination events were detected, suggesting that sexual reproduction could have been part of the diversification process in this area. The genetic structure and levels of variation in the region is opposite to what other researchers have found in Northwestern Argentina and could mean a threat to that breeding area now.

Keywords: P. capsici; Cucurbita spp.; Mating type; Haplotype.

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INTRODUCCIÓN

Phytophthora capsici Leonian fue descrita por primera vez como patógeno del pimiento en Nuevo México (Leonian, 1922), y pronto se reportó su presencia en muchas otras especies de cultivos hortícolas, en Solanaceae, Cucurbitaceae y Fabaceae (Kreutzer, 1937; Kreutzer et al., 1940; Kreutzer y Bryant, 1946; Davidson et al., 2002; Gevens y Hausbeck, 2004; Gevens et al., 2008). El patógeno puede infectar todas las partes de la planta hospedadora (Gevens et al., 2007) y se ha informado su presencia en diferentes lugares del mundo, incluyendo América del Norte y del Sur, Asia, África y Europa (Hwang y Kim, 1995; Erwin y Ribeiro, 1996; Sun et al., 2008). Es una especie heterotálica y sus aislamientos tienen uno de los dos tipos de apareamiento (TAs), denominados A1 y A2, que producen oosporas en estrecha proximidad (Lamour y Hausbeck, 2001). Su historia de vida implica habitualmente tanto la fecundación sexual como la reproducción asexual, que ocurre de forma rápida para su propagación y supervivencia (Lamour y Kamoun, 2009). Las oosporas presentes en el suelo y en los restos de plantas se consideran la principal fuente de inóculo (Hausbeck y Lamour, 2004) y pueden sobrevivir durante varios años en condiciones de campo (Erwin y Ribeiro, 1996; French-Monar et al., 2007). La mayoría de las estrategias de control se focalizan en la reducción de las pérdidas mediante el la minimización del agua libre, pero una vez que P. capsici se ha establecido en un lugar (en condiciones de ambiente húmedo y cálido) no existe una estrategia de manejo disponible para limitar la enfermedad (Lamour et al., 2012).
El desarrollo de cultivares resistentes para los hospedantes de importancia económica ha sido difícil debido a la diversidad global de las poblaciones del patógeno y a la existencia de cepas fisiológicas dentro de P. capsici (Walker y Bosland, 1999; Oelke y Bosland, 2003). Los mejoradores que trabajan en zonas con menor diversidad genética del patógeno pueden tener una mayor probabilidad de identificar cultivares resistentes a escala local (Hurtado-González et al., 2008). Las poblaciones de P. capsici con menor nivel de variación genética son susceptibles a adaptarse menos rápido a los hospedantes resistentes que las poblaciones con alta variabilidad genética (Lamour, 2009), con la condición de que se eviten posibles vías de diseminación desde otras áreas. Si tenemos en cuenta la ausencia de cultivares resistentes para todos los sistemas de cultivos afectados, el alto nivel de diversidad genotípica y la recombinación sexual en muchas situaciones de campo, P. capsici presenta el peor escenario, dentro de los oomycetes, para la producción agrícola (Lamour et al., 2012).
Por lo tanto se necesita tener un conocimiento detallado de la estructura poblacional de P. capsici para entender la composición genética de los aislamientos que se desarrollan en hospedantes y regiones en particular. Esto ayudará a optimizar el desarrollo y el despliegue de nuevos cultivares resistentes. Se estudiaron previamente poblaciones de P. capsici en países en los que este patógeno provoca pérdidas significativas (Lamour y Hausbeck, 2001; Luz et al., 2003; Tian y Babadoost, 2003; French- Monar et al., 2006; Silvar et al., 2006 y Wang. et al., 2009). Los estudios que incluyeron muestras de todo el mundo (Quesada-Ocampo et al., 2011) han demostrado que este patógeno presenta una estructura de población moderada, pero significativa sobre el hospedador, el origen geográfico y la sensibilidad al mefenoxam. Los datos de estudios anteriores apoyan la hipótesis de que la reproducción clonal domina en las poblaciones de P. capsici que fueron obtenidos a partir de cultivares de pimiento (Capsicum annuum L.) de Perú y de las regiones noroeste y oeste de la Argentina (provincias de Tucumán, San Juan y Mendoza) y que la recombinación sexual juega un rol limitado (o ninguno) en la aparición de nuevos genotipos en esas áreas (Hurtado-Gonzáles et al., 2008, Gobena et al., 2012).
Estos resultados contrastan con las observaciones llevadas a cabo en otras zonas de producción hortícola, donde ambos tipos de apareamiento están presentes y las poblaciones tienen un alto nivel de diversidad genotípica y génica, probablemente como resultado de la reproducción sexual (Meitz et al., 2010, Lamour et al., 2012). Nuestro objetivo en el presente estudio es caracterizar la estructura genética de las poblaciones de P. capsici en el cinturón verde de Buenos Aires para evaluar el potencial evolutivo de este patógeno en diferentes especies de cultivo y obtener así una determinación del riesgo que supone para la producción de hortalizas en la región.

Figura 1. Mapa de la región noreste de la provincia de Buenos Aires donde se colectaron las muestras.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo
Los aislamientos fueron sistemáticamente colectados de 17 campos de producción comercial de vegetales del noreste (NE) de la provincia de Buenos Aires durante 2011 y 2012. Los lugares de muestreo se encuentran en las ciudades de Luján (N= 7), Rodríguez (N= 34) y Exaltación de la Cruz (N= 20) (entre las coordenadas: 34° 19 ‘14.05” S; 59° 11’ 58.87” O y 34° 41’ 33.75” S; 58° 54’ 4.25” O). Los aislamientos fueron recuperados de las siguientes especies: zapallito, N=37 (Cucurbita maxima Duchesne ssp. Maxima var Zapallitina Grebensc; forma adulta de la calabaza de verano, popular en Argentina); zucchini, N=3 (Cucurbita pepo); berenjena, N=13 (Solanum melongena), tomate, N=6 (Solanum lycopersicum) y pimiento o morrón, N=2 (Capsicum annuum). Las muestras fueron tomadas ya sea de los tallos, frutos o brotes. Se descartaron otras especies de Phytophthora recuperadas de las plantas muestreadas y fueron mantenidas en agua destilada estéril por largos períodos de tiempo.

Aislamiento del patógeno
Las plantas infectadas se lavaron con agua corriente y con agua destilada estéril. Se tomaron pequeñas secciones de tejido del borde de la lesión en expansión en todos los órganos y se transfirieron a placas agar y jugo V8 (AV8). Las placas fueron incubadas 2 días a 24 °C. Las puntas de las hifas se subcultivaron a partir del micelio en expansión activa y transferidas a V8A. Para el almacenamiento a largo plazo, se guardaron porciones de agar con crecimiento de micelio en tubos Eppendorf de 2 ml con 1 ml de agua destilada estéril y tres semillas estériles pregerminadas de alpiste. Todos los aislamientos de P. capsici se identificaron morfológicamente de acuerdo con las características de sus zoosporangios y oogonios y al crecimiento a temperaturas específicas (Erwin y Ribeiro, 1996). Los esporangios usados para identificación fueron producidos a partir de cultivos en V8A a 24 °C bajo condiciones de luz natural durante 2 días.

Análisis del tipo de apareamiento
El tipo de reproducción se determinó mediante el apareamiento de forma simultánea de cada aislamiento con dos aislamientos testigo: A1 (CBS 11.334) y A2 (CBS 370.72), proporcionados por el Fungal Biodiversity Centre, Países Bajos, en placas por separado. Los aislamientos se colocaron a 2 cm de distancia en una placa de Petri con V8A fresco. Un aislamiento de prueba no apareada se utilizó como control negativo. Se usó como control positivo el apareamiento entre los tipos de reproducción opuestos de los aislamientos testigo. Las placas se envolvieron con Parafilm y se incubaron en la oscuridad a 21 °C durante al menos 1 semana. Se examinó al microscopio la formación de oosporas en la interface. Se registraron los aislamientos que produjeron oosporas con el tipo de apareamiento conocido.

Sensibilidad a fungicidas
Se testeó la sensibilidad al metalaxil en placas V8A modificadas con 100 ppm del fungicida. Se colocó una porción de micelio en activo crecimiento en el centro de la placa y se incubó en la oscuridad a 21 ºC durante 7 días. Los aislamientos sensibles, intermedios y resistentes se definieron según el porcentaje de crecimiento (<10%, 10-60% y>60%; Sensible: S; Tolerante: T y Resistente: R, respectivamente). Los controles para cada aislamiento consistieron solo en placas V8A cultivadas en las condiciones mencionadas anteriormente.

Extracción de ADN
Los cultivos almacenados fueron transferidos a placas con AV8 fresco y se cultivaron en oscuridad a 24 oC durante 7 días. Se recogió el micelio de cada aislamiento y se congeló a seco. Se extrajo ADN de alto peso molecular con el protocolo de Ristaino et al. (1998), basado en el método CTAB. El ADN se solubilizó en 25 μL de TE y fue almacenado a -20 °C para su uso posterior.

Amplificación por PCR y edición de la secuencia
La amplificación de la región del gen blanco se realizó en un Eppendorf Master syclerep gradient S. Universal primers ITS4 y se usó ITS5 de White et al. (1990). Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1% para verificar la amplificación de un solo fragmento del tamaño adecuado. Los amplificados se purificaron usando un kit comercial (Wizard SV Clean-Up System Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR purificados se resuspendieron en 10 μL de agua y se secuenciaron bidireccionalmente usando primers ITS4 y ITS5 en la Unidad de Genómica del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Buenos Aires, Argentina. Las secuencias obtenidas se compararon con la secuencia de datos disponibles públicamente en el Genebank usando BLAST-n (Altschul et al., 1990) para determinar si correspondían al locus ITS de P. capsici y para comparar los haplotipos ITS locales y extranjeros. Se realizó una alineación de secuencias múltiples con ClustalW (parámetros por defecto) como se implementó en Mega 5.0 (Tamura et al., 2011). Se requirieron solo ligeras correcciones manuales y ajustes debidos a la presencia ocasional de inserciones/deleciones (indeles).

Variabilidad de la secuencia de ADN, parámetros de poblacionales y análisis de recombinación
La asignación de haplotipos se realizó mediante el programa DnaSP v5.10.01 (Rozas y Librado, 2009). Se consideraron los indels en este análisis para dar cuenta de cada tipo de variación de una manera visual. Los indeles no se tuvieron en cuenta para el análisis posterior ya que algunas brechas o lagunas en la alineación se debían a variaciones de una base en poli-A o repeticiones poli-T. Esto podría conducir a una variación de la homoplasia y por lo tanto a sesgos en las estimaciones de parámetros de población. Los estimados de diversidad de secuencias, el número mínimo de recombinación y la D de Tajima (Tajima, 1989) fueron estimados usando DnaSP para tres particiones: el conjunto de datos globales, la localidad y la especie del hospedador. Los estimados de diversidad de secuencias incluyen el número de sitios de segregación (s) número de haplotipos (h), la diversidad de haplotipos (Hd) (Nei, 1978), Tajima (π) (Tajima, 1983), la theta de Watterson (θw) (Watterson, 1975) y el número promedio de diferencias de nucleótidos por pares (k) (Tajima, 1983). Se calcularon intervalos de confianza de 95% para cada estadística a través de simulaciones de coalescencia usando DnaSPv5.

Análisis de redes y de estructura de población
La distribución de haplotipos y sus frecuencias se muestran en función del hospedante y la localidad con el algoritmo de Median-joining network (MJ) utilizando la versión 4.6.1.0 del programa Network (Bandelt et al., 1999) con los parámetros por defecto. Las pruebas de estructura genética según la localidad y las especies de hospedantes (AMOVA e índices de Fst) se llevaron a cabo con Arlequin 3.5 (Excoffier y Lischer, 2010). La significancia se determinó usando 1.000 permutaciones.

RESULTADOS

Recolección e identificación morfológica de los aislamientos de Phytophthora
Las muestras recogidas produjeron 102 aislamientos de Phytophthora de los cuales, después de los análisis morfológicos, 61 fueron claramente identificados como P. capsici y el resto, como otras especies. Entre los aislamientos identificados, las características típicas mostraron algún grado de variación, especialmente en la relación ancho/largo de los esporangios. Todos los aislamientos de P. capsici pertenecieron al tipo de apareamiento A1. Las oosporas se produjeron solo cuando las placas de cada aislamiento incluyeron el aislamiento de referencia del TA A2 (CBS 370.72). El apareamiento entre los tipos de apareamiento opuestos de referencia produjo oosporas viables, tal como se esperaba. Cuando se agregó metalaxil al medio, el crecimiento se redujo significativamente (>90%) y los aislamientos fueron clasificados como sensibles.

Análisis de las poblaciones
En todos los casos, las simulaciones coalescentes incluyeron la estimación observada dentro del intervalo de confianza del 95% (tabla 1). El número total de sitios de segregación detectados para el locus ITS fue de 13 de 581 pb analizadas (conjunto global de datos), sin desviaciones detectadas del modelo de sitios infinitos de evolución de nucleótidos. Los polimorfismos se encontraron tanto en los locus ITS1 como ITS2. El locus 5.8S resultó monomórfico. Según las estimaciones de diversidad, los aislamientos obtenidos de Rodríguez y Luján resultaron considerablemente más variables que aquellos de Exaltación de la Cruz, incluso a pesar de que el tamaño de la muestra de Luján fue considerablemente menor.

Tabla 1. Promedio de las estimaciones de diversidad del locus ITS para P. capsici con aislados agrupados en categorías predefinidas de hospedador. s= número sitios de segregación, h= haplotipos, Hd= diversidad de haplotipos, π = π de Tajima, θw = Theta de Watterson por secuencia y k= el número promedio de diferencias de pares de nucleótidos.

Cuando se tomaron en cuenta las especies hospedantes, los aislamientos de P. capsici obtenidos de la berenjena mostraron los valores más grandes en la mayoría de las estimaciones, incluso con un tamaño de muestra más pequeño que el del zapallito. La D de Tajima no difirió significativamente de cero en ningún caso, lo cual sugiere que no hay una desviación significativa del modelo básico en las particiones consideradas. El análisis de los datos para el número mínimo de eventos de recombinación (RM) detectó al menos dos eventos restringidos a Rodríguez cuando el conjunto de datos fue particionado geográficamente. Sin embargo, cuando el conjunto de datos se dividió por especies hospedadoras el análisis Rm produjo tres eventos, dos detectados para zapallito y una para berenjena. Se definieron veinte haplotipos a partir de los 61 aislamientos de este estudio, incluyendo sitios con gaps o brechas (tabla 2) y 16 cuando fueron excluidos (tabla 1). El análisis de redes mostró que los tres haplotipos más frecuentes, 13, 14 y 16 (fig. 2) también fueron centrales en la red. Cuando se compara con las secuencias ITS de P. capsici que están disponibles al público en Genebank es posible notar que los haplotipos ancestrales (13, 14 y 16) resultaron idénticos a otros aislamientos obtenidos a partir de un número de especies de cultivo distribuidas en todo el mundo (tabla 2).

Tabla 2. Distribución de haplotipos por país, sitio de muestreo (en Argentina) y especie hospedadora.

Figura 2. Red filogenética con la serie de aislamientos de P. capsici procedentes de los cultivos de interés: zapallito, berenjena, tomate y pimiento, y de zucchini. En el listado se indica el origen de los aislamientos (por hospedante y por localidad), en el mismo orden en que aparecen en la figura.

El haplotipo 15, también central para la red y con frecuencia representado, fue sin embargo exclusivo para Argentina, y fue aislado del zapallito y de la berenjena en los tres sitios: Rodríguez, Luján y Exaltación de la Cruz. Los haplotipos 1, 2, 3, 4 y 10 solo fueron aislados a partir de berenjena en Rodríguez. Los haplotipos 5, 6, 8, 9, 11 y 12 resultaron únicos para especies de cucurbitáceas en Rodríguez. El haplotipo 7 fue compartido por el tomate y el zapallito en ese sitio, mientras que los haplotipos 19 y 20 se encontraron exclusivamente en los zapallitos de Luján. El haplotipo 18 se encontró solo en los zapallitos de Exaltación de la Cruz; el haplotipo 16 fue compartido por el zapallito y zucchini en Exaltación y Rodríguez. El haplotipo 17 fue compartido entre el pimiento y el zapallito, también en Exaltación y Rodríguez (tabla 2 y fig. 2). Por una parte, los estudios AMOVA mostraron una variación de 4,02% entre los grupos cuando Rodríguez y Luján (localidades cercanas entre ellas) fueron agrupadas y comparadas con Exaltación de la Cruz, a 45 kilómetros de esos lugares. La variación entre las poblaciones dentro de los grupos alcanzó el 11,07%. Estos niveles de variación fueron, sin embargo, no significativos al nivel de 0,05 (tabla 3a). La mayor cantidad de variación se encontró dentro de las poblaciones (84,91), la cual resultó significativa (p<0,02). Por otra parte, los índices de fijación por parejas mostraron niveles marginalmente significativos de estructura genética cuando se compararon Rodríguez y Luján. Los índices de fijación de Exaltación de la Cruz resultados significativos en el nivel 0,05 cuando se comparó con Luján y Rodríguez (tabla 3b). Cuando se agruparon de acuerdo con la especie hospedante y las familias (tabla 4) no se observó ninguna estructuración entre los grupos o poblaciones. De acuerdo con esto, cada índice de fijación por pareja entre especies hospedantes fue no significativo al nivel de 0,05, en todos los casos (tabla 4).

Tabla 3a. Índices de fijación (FST) del locus ITS de P. capsici con aislamientos particionados geográficamente.

Tabla 3b. Índices de fijación (FST) del locus ITS de P. capsici con aislamientos particionados por hospedante.

Tabla 4. Prueba de AMOVA entre los hospedantes muestreados con presencia de P. capsici en el NE de la provincia de Buenos Aires, Argentina.

DISCUSIÓN

Las secuencias ITS de P. capsici mostraron un patrón reticular de haplotipos centrales frecuentes en la red, con haplotipos más recientes y menos frecuentes en las puntas de la red. Una posición central, junto con una mayor frecuencia, es considerada una característica de haplotipos ancestrales. Este patrón sugiere que ocurrió un proceso de diversificación en la región bajo estudio (Templeton, 1998). La aparición de los haplotipos más frecuentes y centrales (posiblemente ancestrales) en una serie de países y especies de cultivo (tabla 2) también apoya esta hipótesis. Se detectaron de dos a tres eventos de recombinación en este estudio, en función de si se consideran las particiones geográficas o por hospedante. Estos resultados sugieren que la reproducción sexual podría haber sido parte del proceso de diversificación antes mencionado y, en consonancia, es intrigante la ausencia del TA A2 en toda Argentina (Gobena et al., 2012 y estudio actual). Por una parte, nuestro estudio no permite determinar si la recombinación y la reproducción sexual solo ocurrieron en el pasado o si todavía están presentes en la dinámica actual de la región. Se ha sugerido que la ausencia de ambos tipos de reproducción en las poblaciones de P. capsici son el resultado de un sistema de producción de cultivos durante todo el año, que eliminó la necesidad de la reproducción sexual y la consiguiente formación de oosporas normalmente necesarias para la supervivencia de temporada a temporada (Lamour et al., 2012). Alternativamente, podría plantearse la hipótesis de que un evento único fundacional introdujo los haplotipos antiguos en Argentina con una representación desigual de los TA A1 y A2. Posteriormente, la deriva genética podría haber dado lugar a la pérdida de los genotipos A2, originalmente menos frecuentes, en ausencia de una presión selectiva que favoreciera la aparición de ambos TAs.
Por otra parte, los genotipos A2 podrían aun estar presentes en bajas frecuencias, impulsando la reproducción sexual. Los eventos de recombinación en ausencia del TA A2 también podrían ser el resultado de la ocurrencia del tipo de apareamiento opuesto en especies alternativas; esto podría inducir la etapa sexual en P. capsici. Donahoo et al. (2008) mostraron que P. capsici y P. tropicalis forman híbridos sexuales interespecíficos en el laboratorio. Se encontró al descendiente híbrido de P. nicotianae y P. cactorum en árboles de níspero en Perú y Taiwán (Hurtado- Gonzales et al., 2008) y en hidroponía en los Países Bajos (Man in’t Veld et al., 1998). Notablemente, el TA A2 fue encontrado en aislamientos de P.nicotianae y P. cactorum en el noreste de Buenos Aires, aunque aún no se ha registrado evidencia de hibridación cruzada (Iribarren, datos no publicados). La estructura genética y la variación entre y dentro de los puntos de muestreo en el cinturón verde del NE de Buenos Aires se podría explicar por la actividad antrópica, ya que P. capsici puede ser introducido en nuevos campos a través de material infectado de plantas, suelo, herramientas o agua de riego (Hausbeck y Lamour, 2004; Gevens et al., 2007) Por un lado, el análisis de partición geográfica reveló que la diversidad de haplotipos es particularmente alta en las localidades de Luján y Rodríguez en comparación con Exaltación de la Cruz. En esa ciudad la producción hortícola se introdujo más tarde y eso podría explicar la diferencia encontrada en esas áreas. Por otro lado, el riego por goteo y la rotación de cultivos probablemente facilitaron el cambio de hospedador de P. capsici, como se evidencia por la falta general de la estructura genética detectada mediante el análisis de AMOVA y los índices de FST, junto con el modelo de distribución de haplotipos observado en la red. A pesar de estos resultados, es interesante observar los niveles relativamente altos de variación que fueron encontrados en los aislamientos de berenjenas; hasta la fecha no hemos sido capaces de rastrear ninguna razón histórica o biológica que explique este hallazgo.
En cualquier caso, la estructura genética de las poblaciones de P. capsici en el cinturón verde de Buenos Aires contrasta notablemente con los resultados observados en Perú por Hurtado-González et al. (2008) y en el noroeste (NO) de Argentina por Gobena et al. (2012). Estas diferencias son consistentes con un patrón epidemiológico donde el viento no es un mecanismo importante y dispersión a larga distancia es poco frecuente (Granke et al., 2009). De acuerdo con el modelo de riesgo presentado por McDonald y Linde (2002), en el NO de Argentina P. capsici debe ser considerado como un patógeno de bajo riesgo. Por el contrario, las poblaciones de estas especies que se encuentran en el cinturón verde de Buenos Aires implicarían un riesgo de moderado a alto para la práctica hortícola; tal riesgo depende de la presencia del patógeno en el momento de la reproducción sexual. Gobena et al. (2012) señalaron que la estructura clonal en poblaciones del NO de Argentina han permitido la aparición de variedades de pimientos resistentes a partir del uso de aislamientos locales para limitar la infección por P. capsici por períodos prolongados de tiempo. Además, la ausencia de oosporas sexuales de paredes gruesas, que pueden sobrevivir por muchos años, es un activo para el manejo de enfermedades de P. capsici a partir del uso de estrategias de rotación de cultivos con especies resistentes o inmunes. Esta situación, sin embargo, podría ser lábil en el caso que los aislamientos de Buenos Aires lleguen, de alguna manera, a la región NO del país. En caso de que los resultados aquí mostrados sean confirmados con análisis complementarios que actualmente están en desarrollo, deberían considerarse medidas sanitarias para prevenir posibles vías de diseminación, que podrían llevar a la ruptura de la resistencia en las regiones donde P. capsici se controló hasta ahora con éxito.

AGRADECIMIENTOS

Los autores quieren agradecer a la Universidad Nacional de Luján (UNLu) y al Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) por aportar los fondos para este proyecto. Quieren agradecer también al programa Cambio Rural por su colaboración en la identificación de los productores hortícolas locales para obtener las muestras vegetales. Un enorme reconocimiento también para Claudia Ojeda (Laboratorio Central, UNLu) por su importante contribución en el procesado de aislamientos y su conservación a largo plazo.

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