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RIA. Revista de investigaciones agropecuarias

versión On-line ISSN 1669-2314

RIA. Rev. investig. agropecu. vol.44 no.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires abr. 2018

 

ARTÍCULOS

Actividad antifúngica de especies del género Senna (Caesalpinoideae, Leguminosae) del norte de Argentina frente a Fusarium verticillioides

 

Di Ciaccio, L.S.1; Fortunato, R.H.2,3; Salvat, A.E.4,5

1 Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVyA), Instituto de Patobiología. CONICET. Nicolas Repetto y de los Reseros s/n, Hurlingham (1686), prov. de Buenos Aires, Argentina.
2 Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Centro de Investigación de Recursos Naturales (CIRN), Instituto de Recursos Biológicos. CONICET. Nicolas Repetto y de los Reseros s/n, Hurlingham (1686), prov. de Buenos Aires, Argentina.
3 Facultad de Agronomía y Ciencias Agroalimentarias, Universidad de Moron, Morón, prov. de Buenos Aires, Argentina.
4 Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVyA), Instituto de Patobiología, Nicolas Repetto y de los Reseros s/n, Hurlingham (1686), prov. de Buenos Aires, Argentina.
Correo electrónico: salvat.adriana@inta.gob.ar

Recibido 13 de febrero de 2017
Aceptado 29 de diciembre de 2017
Publicado online 17 de abril de 2018


RESUMEN

El género Senna comprende alrededor de 360 especies presentándose el 80% en el continente americano. Varias son conocidas por las propiedades antimicrobianas y farmacológicas. Los antecedentes de actividad antifúngica en Argentina fueron reportados en un estudio de extractos metanólicos de hojas de S. spectabilis frente a Fusarium graminearum. El objetivo de este trabajo fue analizar la actividad antifúngica de 12 extractos metanólicos de distintos órganos de 10 especies del género Senna, recolectadas en el norte de Argentina frente a Fusarium verticillioides, responsable de la podredumbre de la espiga en maíz. Primeramente, todos los extractos fueron evaluados con un ensayo colorimétrico de susceptibilidad. Aquellos que mostraron actividad inhibitoria, luego fueron evaluados mediante bioautografía de contacto, tinción con azul de Evans y azul de anilina, test de crecimiento radial del micelio y por su capacidad para inhibir la producción de fumonisinas. El extracto de frutos de S. spectabilis mostró actividad antifúngica con una Concentración Mínima Inhibitoria de 99,9 μg ml-1. Asimismo, se observaron halos de inhibición significativos en la bioautografía de contacto, mientras que en la tinción con azul de Evans y azul de anilina se visualizaron algunas alteraciones en las hifas. En el test de crecimiento radial del micelio, se observó una reducción significativa, y en lo que respecta a la producción de fumonisinas, los extractos provenientes de frutos mostraron una inhibición en su producción de 48,3% mientras que los extractos de flores el porcentaje fue mayor (86,3%). Finalmente, se pudo determinar que S. spectabilis presenta actividad antifúngica frente F. verticillioides, confiriéndole un nuevo registro de bioactividad a esta especie vegetal.

Palabras clave: Plantas nativas; Antifúngicos; Extractos; Fumonisinas.

ABSTRACT

The genus Senna comprises about 360 species being 80% from the American continent. Several of them are known by their antimicrobial and pharmacological properties. In Argentina antecedents of antifungal activities were reported in studies of methanolic extracts from leaves of S. spectabilis against Fusarium graminearum. The aim of this work was to analyze the antifungal activity of 12 methanolic extracts of different organs of 10 1Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas (CICVyA), Instituto de Patobiología. CONICET. Nicolas Repetto y de los Reseros s/n, Hurlingham (1686), prov. de Buenos Aires, Argentina. species of the genus Senna collected from northern Argentina against Fusarium verticillioides, causal agent of maize ear rot. At first all the extracts were evaluated to know their antifungal capacity with a colorimetric test. Those which showed inhibitory activity were analyzed by contact bioautography, Evans blue and Aniline blue staining, mycelial radial growth test and also their ability to inhibit fumonisins production. Fruit extract of S. spectabilis showed antifungal activity at a Minimun Inhibitory Concentration of 99.9 μg ml-1. Likewise, in the contact bioautography an inhibition zone was evident, while in Evans blue and aniline blue staining, some alterations in the mycelial hyphae were visualized. In the mycelial radial growth test, a significant reduction was observed, and in the fumonisins production the extracts from fruits showed inhibition of 48.3% while in flowers the percentage was higher (86.3%). Finally, it was determined that S. spectabilis has antifungal activity against F. verticillioides, giving a new record of bioactivity to this plant species.

Keywords: Native plants; Antifungal activity; Extracts; Fumonisins.


 

INTRODUCCIÓN

En el continente americano se han reportado gran variedad de compuestos químicos con propiedades antibacterianas, antibióticas, antifúngicas y antioxidantes presentes en diferentes especies nativas (Mors et al., 2000; DeFilipps et al., 2004; Viegas Júnior et al., 2006; Lombardo et al., 2009; Lombardo et al., 2015). El género pantropical y subpantropical Senna Mill., conocido por sus diversas propiedades antimicrobianas y farmacológicas (Agarwal y Bajpai, 2010; Jothy et al., 2012; de Albuquerque Melo et al., 2014; Anthoney et al., 2014; Lombardo et al., 2015), comprende alrededor de 360 especies, de las cuales más del 80% están distribuidas en América (Irwin y Barneby, 1982; Randell y Barlow, 1998). Argentina, por la extensa superficie que ocupa, posee gran variedad de climas (Cabrera, 1994) que permite la presencia de numerosas especies vegetales con gran potencial de actividad biológica (Ramos et al., 1998; Barquero, 2007) reportándose importantes usos antimicrobianos (Cowan, 1999; Salvat et al., 2004; Serafin et al., 2007; Silva et al., 2007; Coutinho et al., 2008; Silva Júnior et al., 2010). En referencia a la actividad antifúngica del género Senna, en la Argentina solo existen registros sobre extractos metanólicos de hojas de S. spectabilis frente a una cepa de Fusarium graminearum productora de micotoxinas (Salvat, 2010).
En el territorio argentino, una extensa área es destinada al cultivo de maíz. En la campaña 2015/16 se implantaron 3,5 millones de hectáreas obteniendo una producción de 29 millones de toneladas (USDA, 2016). Algunas especies de hongos filamentosos del género Fusarium pueden infectar a los cultivos durante su desarrollo en el campo, así como a sus productos durante el almacenamiento. Las pérdidas sufridas en los cultivos asociados a hongos se deben no solo a la reducción del rendimiento y la alteración de la calidad comercial y nutricional, sino también a la producción de micotoxinas, que representan un riesgo para la salud humana y animal (USDA, 2006). Fusarium es el género que afecta con mayor frecuencia a los cultivos argentinos, las especies más importantes son: F. graminearum, y F. verticillioides. (Presello et al., 2008; Martinez et al., 2010; Garrido et al., 2012). Las fumonisinas son micotoxinas producidas por F. verticillioides, el cual sintetiza las fumonisinas FB1, FB2, FB3 (Marasas, 2001), que son responsables de provocar leucoencefalomalacia equina (ELEM) y edema pulmonar porcino (PPE). Además, producen efectos adversos en la función del sistema inmune en pollos, aumentando así la susceptibilidad a microorganismos oportunistas que causan infecciones graves (Voss et al., 2007).
El objetivo de este trabajo fue analizar la actividad antifúngica de 12 extractos metanólicos de distintos órganos de 10 especies del género Senna, recolectadas en el norte de Argentina frente a Fusarium verticillioides, responsable de la podredumbre de la espiga en maíz y producción de fumonisinas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal y preparación de los extractos
Los ejemplares de plantas utilizados fueron recolectados del norte de Argentina, identificados taxonómicamente (Fortunato). Ejemplares del material estudiado fueron depositados en el Herbario del Instituto de Recursos Biológicos del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) (Herbarium code: BAB en http://sciweb.nybg.org/Science2/IndexHerbariorum.asp). El nombre de las especies, colector, número de espécimen y lugar de recolección se indican en la tabla 1. El material vegetal fue obtenido dependiendo del estado fenológico de las plantas al momento de su recolección. Cada órgano (ramas, hojas, frutos y flores) fue secado a temperatura ambiente y luego molido finamente con un molino de martillos. Luego, el material vegetal fue extraído con metanol p.a. (MeOH, Merck) a temperatura ambiente, en total oscuridad, durante 48 horas. Los extractos fueron filtrados con filtro de papel y posteriormente se los llevó a sequedad en un evaporador rotatorio, a una temperatura de 40 °C. Posteriormente se pesó el residuo. El extracto crudo seco fue disuelto en MeOH a una concentración de 80 mg de materia seca por ml-1. Para su conservación, 1 ml de cada extracto fue diluido con 9 ml de dimetilsulfóxido (DMSO, Biopack) alcanzando una concentración final de 8000 μg de materia seca por ml-1. Esta solución fue esterilizada utilizando filtros estériles con membrana de acetato de celulosa de 0,45 μm (Minisart, Sartorius). Todos los extractos fueron mantenidos en crioviales a -35 °C.

Tabla 1. Especies de Senna recolectadas de las provincias del norte de Argentina.

Microorganismo
La cepa de F. verticillioides M7075, con reconocida capacidad productora de fumonisinas, fue cedida por la Universidad de Río Cuarto, Córdoba, Argentina. Esta fue cultivada en tubos de Synthetischer Nährstoffärmer Agar (SNA) a 28 °C por 7 días. Posteriormente se agregó a cada tubo 5 ml de agua peptonada + Tween 80. Mediante el uso de un vortex se agitó suavemente para facilitar el desprendimiento de los conidios. La suspensión de conidios fue filtrada a través de gasa estéril contenida en un frasco de vidrio. Se realizó el conteo de células mediante cámara de Neubauer y posteriormente se ajustó la suspensión a una concentración entre 1-3 x 104 y 1-3 x 105 unidades formadoras de colonias ml-1 (UFC ml-1), dependiendo del ensayo para realizar.

Medios de cultivo y agente antifúngico
Por una parte, se utilizó el medio sintético Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (Gibco by Life Technologies) 1x con L-glutamina sin rojo fenol. Además, el medio SNA compuesto por: fosfato monopotásico (KH2PO4) 1,0 g, nitrato de potasio (KNO3) 1,0 g, sulfato de magnesio heptahiradtado (MgSO4) 7H2O 0,5 g, cloruro de potasio (KCl) 0,5 g, glucosa 0,2 g, sacarosa 0,2 g, agar 20,0 g, agua destilada 1000 ml. Por otra parte, el medio PDA (Agar papa dextrosa) proveniente de Oxoid. Y, por último, el colorante Resazurina sódica (0,01% solución acuosa; Sigma- Aldrich EUA) esterilizada por filtración a través de filtros estériles con membrana de acetato de celulosa de 0,45 μm (Minisart, Sartorius) y conservada en crioviales a –35 °C. Como agente antifúngico se utilizó el Ketoconazole (Ke) a una concentración de 2 μg ml-1 para el ensayo colorimétrico de susceptibilidad, tinción con azul de Evans y azul de anilina y test de crecimiento radial del micelio; 50 μg ml-1 para bioautografía de contacto. Todas las soluciones fueron esterilizadas utilizando filtros estériles con membrana de acetato de celulosa de 0,45 μm (Minisart, Sartorius) y conservadas en crioviales a -35 °C.

Ensayo colorimétrico de susceptibilidad: microdilución en placa de 96 wells
El ensayo colorimétrico de susceptibilidad fue realizado de acuerdo a lo informado en el documento M38-A (NCCLS, 2002), con ciertas modificaciones para la actividad antifúngica (Salvat, 2010). Esta técnica se realizó en microplacas estériles de 96 pocillos (Biofil). Se añadieron 200 μl de las soluciones de MeOH: DMSO (1:9) de los extractos de plantas a cada uno de los pocillos de la fila A, los pocillos restantes de las filas B a la H recibieron 100 μl de RPMI 1640. Para la realización de las diluciones, se tomaron 100 μl de los pocillos de la fila A y se depositaron en los pocillos de la fila B y así sucesivamente hasta la fila H (en dirección vertical). El exceso de dilución (100 μl) de la fila H fue descartado. De esta manera, los pocillos de la fila A contenían la concentración más alta del extracto (4000 μg ml-1) y los pocillos de la fila H la más baja (31,2 μg ml-1). Luego se colocaron 100 μl del inóculo que contenía entre 1-3x104 CFU ml-1 en todos los pocillos, exceptuando al control del medio RPMI 1640. Por último, se depositaron 20 μl de Resazurina a todos los pocillos (Espinel-Ingroff et al., 1995). Se utilizaron algunas columnas en cada placa para los respectivos controles de esterilidad del medio de cultivo RPMI 1640 y estabilidad química del colorante Resazurina (sin el inóculo), de viabilidad del inóculo (sin extracto ni solvente añadido), del agente antifúngico (Ke) a la concentración indicada anteriormente y del efecto del solvente MeOH: DMSO (1:9). La concentración de UFC ml-1 se determinó contando las colonias desarrolladas 48 horas después de añadir una alícuota de 100 μl del inóculo utilizado en el ensayo, en placas de Petri que contenían PDA. Las microplacas fueron incubadas a 28 °C en oscuridad y examinadas a las 48 horas. El cambio de color de azul a rosa de la Resazurina indicaba crecimiento fúngico. La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) fue considerada como la mayor concentración (en μg de materia seca por ml de medio) en la cual no se detecta viraje de color del indicador Resazurina. Cada extracto fue considerado activo cuando su CMI < 500 μg ml-1 (Salvat et al., 2001). Este ensayo se realizó por triplicado. Posteriormente, en los extractos que mostraron actividad inhibitoria, se realizaron las siguientes técnicas:

Bioautografía de contacto
Para la separación de los extractos se llevó a cabo la técnica de cromatografía en capa delgada (TLC). Como fase estacionaria, se utilizaron placas de silica gel 60 F254 (9x5 cm) donde fueron depositados 20 μl en forma de banda para cada extracto (que corresponde a 400 mg ml-1) y 5 μl para el control positivo (Ke) y como fase móvil la mezcla de n-propanol:acetato de etilo:agua:ácido acético (Wagner y Bladt, 1996), con modificaciones (39:41:29:1). El medio PDA (40 ml) fue inoculado con 600 μl de entre 1-3x105 UFC ml-1 de F. verticillioides que luego fue vertido en placas de vidrio (150x25 mm). Los cromatogramas fueron colocados sobre el agar e incubados a 28 °C por 24 horas, luego fueron retirados y se continuó la incubación de las placas por 24 horas más a 28 °C. Finalmente, se visualizaron las bandas de inhibición y se calculó el frente de reacción (Rf): Rf = distancia recorrida por el compuesto/distancia recorrida por el solvente (Zacchino y Gupta, 2007). Esta técnica se realizó por triplicado.

Tinción con azul de Evans: visualización de alteración de las hifas
Esporas de F. verticillioides fueron incubadas en el medio líquido RPMI 1640 a 28 °C por 24 horas para la formación de las hifas. Transcurrido este período, se transfirió 1 ml del medio conteniendo las hifas a tubos Eppendorf de 1,5 ml. Luego, a cada tubo se le añadió el extracto activo a su respectiva CMI, se incluyeron también, un tubo como control positivo (Ke), y otro como control del inóculo. Posteriormente se incubaron todos a 28 ºC durante 24 horas. Luego, se procedió a centrifugar los tubos y a retirar el medio de cultivo para posteriormente colocar 2 gotas de la solución de azul de Evans (0,05%) por 5 minutos. Finalmente, se realizaron varios lavados con agua destilada estéril para remover el exceso de colorante. La diferencia en la tinción se observó bajo microscopio óptico a 400x y para su evaluación se siguió lo descripto por Semighini y Harris (2010); Savi et al. (2013).

Microscopia óptica
Esporas de F. verticillioides fueron colocadas en medio PDA el cual contenía diferentes concentraciones (CMI y 2xCMI) del extracto activo, también se incluyeron placas con el control positivo (Ke) y del micelio. Posteriormente, pequeños fragmentos del agar conteniendo micelio, se colocaron en un portaobjetos para luego ser teñidos con una solución acuosa al 1% de azul anilina (AOSA, 2008) por 5 minutos. Finalmente, la morfología de las hifas fue observada para su evaluación al microscopio óptico con aumento de 1000x.

Test de crecimiento radial del micelio
A partir de un cultivo en placa de 7 días de F. verticillioides en el medio PDA se tomaron discos de 5 mm de diámetro del cultivo y se colocaron en el centro de placas de Petri conteniendo 20 ml de medio de cultivo PDA con dos concentraciones de uno de los extractos activos (MIC y 2xMIC). Asimismo, se realizaron los respectivos controles correspondientes al inóculo sin tratamiento, el inóculo con el antifúngico (Ke), y el control del solvente en el cual está diluido el extracto (DMSO: MeOH – 9:1). Todas las placas fueron incubadas a 28 °C durante 7 días. Todos los días se midió el diámetro de las colonias (mm) y se evaluó la eficacia de cada tratamiento (Mier et al., 2002; Quiroga et al., 2009). Este ensayo se realizó por triplicado.

Efecto de los extractos activos sobre la producción total de fumonisinas
A fin de medir las diferencias en la producción de fumonisinas, una suspensión de conidios de F. verticillioides (entre 1-3x104 CFU ml-1) se sembró en placas de Petri con 20 ml de PDA conteniendo a los extractos activos, en sus CMIs correspondientes. El mismo procedimiento fue realizado para el control con Ke y control de inóculo. Las placas fueron incubadas a 28 °C durante 15 días. Finalmente, el contenido de fumonisinas presente en el agar se determinó mediante el test de ELISA (ELISA kit Ridascreen® Fast Fumonisin R-Biopharm – Alemania). El límite de detección fue de 0,222 mg kg-1.

Análisis estadístico
Los datos sobre el crecimiento radial del micelio se analizaron por análisis de varianza (ANOVA) seguido por el postest de Bonferroni. Se utilizó el programa InfoStat (Di Rienzo et al., 2015). El análisis se expresó como media ± desvío estándar y el valor de p˂ 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

RESULTADOS

En el estudio de bioactividad, realizado mediante el ensayo colorimétrico de susceptibilidad, fueron considerados activos aquellos extractos con una CMI < 500 μg ml-1. Solo la especie S. spectabilis fue activa contra F. verticillioides, con una CMI de 99,9 μg ml-1 en lo que respecta a los frutos, mientras que para las flores la CMI fue de 437,1 μg ml-1 (tabla 2). Este resultado en parte es coincidente con los hallazgos reportados por Salvat (2010), quien determinó actividad antifúngica en extractos de hojas de esta especie, pero frente a F. gramineraum, a una CMI de 125 μg ml-1.

Tabla 2. Actividad antifúngica (Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) en μg ml-1) de Senna ssp. y del Ke frente a F. verticillioides.

Los datos se muestran como valores medios de CMIs obtenidos por triplicado.

Para establecer la actividad antifúngica de los extractos metanólicos de frutos y flores de S. spectabilis, se utilizó la técnica de bioautografía de contacto. Con esta técnica, se pudo observar una banda amarilla cuyo Rf =1, coincidente con la banda de inhibición en el agar (figura 1). Por una parte, en relación con la tinción con el colorante azul de Evans (figura 2), las hifas expuestas a los dos extractos activos de S. spectabilis se encontraban teñidas de azul, lo cual indicaría que sufrieron algún tipo de daño en sus membranas plasmáticas debido a que no pudieron excluir al colorante. En cambio, las hifas control, cuyas membranas permanecieron intactas mantuvieron su coloración normal. Por otra parte, cuando las hifas del micelio desarrolladas en el medio PDA que contiene al extracto de frutos de S. spectabilis fueron teñidas con azul de anilina, se pudo observar una alteración en la integridad celular a nivel de citoplasma, sobre todo por la marcada presencia de vacuolas (figura 3). En el caso del extracto de frutos de S. spectabilis en el test de crecimiento radial del micelio, se evidenció la capacidad que tuvo para reducir el crecimiento de F. verticillioides cuando fue evaluado por un lapso de 7 días (figura 4). Respecto a la producción de fumonisinas (tabla 3), cuando F. verticillioides fue expuesto a extractos de frutos de S. spectabilis se produjo una inhibición del 48,3%, en cambio en los extractos de flores el porcentaje fue mayor (86,3%), mientras que con el antifúngico (que en este caso corresponde a Ke) esta inhibición solo fue de un 19%, respecto al control.


Figura 1.
Bioautografía de contacto: (A) TLC del extracto de frutos de S. spectabilis. (B) TLC del extracto de flores de S. spectabilis. (C) Bioautografía de contacto del extracto de frutos de S. spectabilis. (D) Bioautografía de contacto del extracto de flores de S. spectabilis.


Figura 2.
Coloración con azul de Evans: visualización de la alteración de las hifas: (A) Control (hifas vivas). (B) Ke. (C) Extracto de frutos de S. spectabilis. (D) Extracto de flores de S. spectabilis.


Figura 3.
Coloración con azul de anilina: (A) Control (hifas). (B) Extracto de frutos de S. spectabilis (99,9 μg ml-1). (C) Extracto de frutos de S. spectabilis (198,9 μg ml-1). (D) DMSO:MeOH. (E) Ke (2 μg ml-1).


Figura 4.
Actividad antifúngica del extracto de frutos de S. spectabilis frente a F. verticillioides (M7075) en PDA a diferentes concentraciones (los datos se muestran como valores promedio y desviación estándar del diámetro de colonia). Diferentes letras indican diferencias significativas (p<0,05) entre los diferentes tratamientos.

Tabla 3. Actividad antifumonisina de los frutos y flores de S. spectabilis frente a F. verticillioides.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Este trabajo es continuidad de estudios de bioprospección que se están realizando desde el año 2001. Sobre esta base, especies nativas del norte de Argentina fueron evaluados a fin de conocer su bioactividad ante F. verticillioides conocido por sus implicancias en la actividad productiva. Según los resultados de este trabajo, la actividad antifúngica frente a un mismo microorganismo no resultó ser igual en todas las especies estudiadas y además varió según el órgano del cual se obtuvo el extracto. Antecedentes de similar respuesta se han registrado en otros géneros, como Polygonum (Derita et al., 2009).
En cuanto al ensayo colorimétrico de susceptibilidad que nos permitió determinar la CMI de los extractos evaluados, consideramos que si bien el DMSO:MeOH que se utilizó para diluir los extractos posee una cierta inhibición por sí mismo, esta se encuentra contemplada dentro de los primeros cuatro pocillos, por lo que las siguientes diluciones solo corresponderían a la actividad inhibitoria del extracto vegetal, que en este caso solo correspondió a los frutos y las flores de S. spectabilis. Sobre esta base, si tenemos en cuenta que los compuestos o principios activos responsables de la actividad contenida en las plantas generalmente se encuentran en menor proporción, estos dos extractos muestran una fuerte acción aun estando a una baja dilución. Ante la susceptibilidad observada de este hongo frente a S. spectabilis, podría estar incluida dentro de la lista de otras especies evaluadas, que para este tipo de actividad mundialmente solo se encuentra en un pequeño porcentaje (Mccarthy et al., 2000; Newman y Cragg, 2007). Además, con el fin de iniciar una aproximación para la identificación de los posibles compuestos responsables de la actividad antifúngica, la bioautografía de contacto resultó ser una herramienta de utilidad ya que permitió la separación de los extractos metanólicos activos y la posterior observación de bandas, alguna de las cuales fueron coincidentes con los halos de inhibición del hongo. Esto podría relacionarse con lo establecido por Wagner y Bladt (1996) quienes determinaron en el género Senna la presencia del
compuesto antraquinona emodina coincidente con el frente de reacción (Rf) observado en este trabajo. Del mismo modo Guarize et al. (2012) y Andrade et al. (2015) estudiaron a este compuesto, el cual presentó actividad antibacteriana, efectos antiinflamatorios, laxantes y de motilidad intestinal. Asimismo, existen varios informes de poblaciones de S. spectabilis provenientes de Brasil cuyas flores y frutos tienen efectos farmacológicos asociados a la presencia de más de 20 alcaloides de piperidina y piperina con propiedades analgésicas y antiinflamatorias, entre otros (Viegas Júnior et al., 2006). Estos datos y los observados en este trabajo son un punto de partida importante para futuras investigaciones, a fin de permitir caracterizar fitoquímicamente el o los compuestos activos, responsables de la actividad antifúngica.
Otra evidencia de este tipo de actividad, por parte de los extractos de S. spectabilis, fue manifiesta al observar mediante la tinción con el colorante azul de Evans que la permeabilidad celular estaba afectada, mientras que la tinción con azul de anilina permitió observar además daños a nivel citoplasmático. Sobre estos resultados sería deseable profundizar en la observación de los daños que se producen en las hifas por la acción de estos extractos, mediante la incorporación de otras técnicas de microscopía que ofrezcan mayor definición y exactitud. A la hora de evaluar el efecto inhibitorio de la CMI y 2xCMI (99,9 μg ml-1 y 199,96 μg ml-1) de frutos de S. spectabilis, mediante el test de crecimiento radial del micelio, se pudo observar que a partir del segundo día de incubación se produjo una demora en el desarrollo del micelio en todos los tratamientos. En cambio, a partir del sexto día, las dos concentraciones del extracto provocaron un notorio retraso respecto al solvente (figura 4). Si bien este test no es concluyente para definir su comportamiento como fungicida o fungistático, se pudo observar que el extracto de frutos a estas concentraciones detuvo el desarrollo del micelio, indicando que su modo de acción es del tipo fungistático. Para complementar esta observación sería deseable realizar la técnica “time kill” (Palavecino Ruiz et al., 2016).
Asimismo, resultó interesante la inhibición en la producción de fumonisinas cuando se hizo crecer a F. verticilloides en medio conteniendo los extractos de frutos y flores de S. spectabilis y en el medio conteniendo Ke. La inhibición en la producción de la toxina por los extractos fue mayor a la producida por el fungicida. Como es sabido, la capacidad de Fusarium para producir fumonisinas no solo depende de la cepa, sino también de los genes presentes en el hongo, del medio de cultivo o sustrato (De la Torre- Hernández et al., 2014) o de factores ambientales entre otros (Martinez et al., 2010). En otros casos de especies nativas del norte argentino, se pudieron identificar algunos compuestos con una marcada actividad antifumonisina (Aristimuño Ficoseco et al., 2014). Sin embargo en nuestro caso aún no se pudo determinar el compuesto responsable de dicha actividad. Sobre esta base se señala que estos sucesos refuerzan el concepto que las plantas tiene un enorme valor y son fuente de nuevas moléculas que aún faltan descubrir. Para países productores de granos como Argentina, que en el año 2016 produjo más de 110 millones de toneladas entre cereales y oleaginosas (USDA, 2016), la presencia de especies como Fusarium en los cultivos y granos almacenados, representan una amenaza en varios sentidos. Contar con estudios que involucran a plantas nativas como alternativa de control de enfermedades fitopatogénicas podrían derivar en el futuro en opciones conducentes a aplicaciones de utilidad, contribuyendo de este modo con información sobre nuestra biodiversidad.
Finalmente, los resultados presentados en este estudio podrían ser tenidos en cuenta para futuras investigaciones que nos permitan la identificación de los compuestos activos de los frutos de S. spectabilis responsables de la actividad antifúngica frente a F. verticilioides, teniendo en cuenta que podría ser el resultado de la combinación de varios compuestos. Consideramos que serían necesarios estudios adicionales para poder caracterizar y purificar los extractos activos de esta especie.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos, a la Dra. Maria Laura Ramírez. Laboratorio de Micología, Dpto. de Microbiología e Inmunología, Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Río Cuarto (Córdoba, Argentina) por haber cedido la cepa F. verticillioides (M7075). Al Sr. Nicolás Di Ciaccio de la Universidad de Morón, Buenos Aires, Argentina, por los aportes en la configuración de imágenes. Asimismo el agradecimiento es extensivo a la Dra. Flavia Hasenauer y la Téc. Rosa Amalia Salvatierra (Instituto de Patobiología, CICVyA, INTA) por el aporte en las técnicas desarrolladas. Este trabajo contó con el apoyo y financiamiento del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) y de los Proyectos: INTA-Argentina/ Universidad de Arizona-EUA, (1998 - 2003), y PIP 4197/98 CONICET (1998-2001).

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