TRABAJOS DE INVESTIGACIÓN

Valoración de características nucleares en muestras citológicas de tumores mamarios caninos

Benítez, J.S.; Insfrán, R.M.; Merlo, W.A.; Brunel, R.A.; Rosciani, A.S.

Servicio de Diagnóstico Histopatológico y Citológico, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Nordeste (UNNE), Cabral 2139, Corrientes (Argentina). E-mail: asrosciani@gmail.com

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Resumen

El presente trabajo tuvo como objetivo comprobar la utilidad y el valor predictivo de la determinación de características morfológicas nucleares subjetivas y objetivas, en muestras citológicas de tumores mamarios caninos. Se estudiaron muestras de 34 pacientes, las cuales fueron controladas hasta 18 meses post cirugía, lo que permitió la confección de curvas de supervivencia. Se realizó la estadificación clínica al momento de la consulta, el citodiagnóstico y la determinación del grado nuclear de las muestras obtenidas por punción y coloreadas con hematoxilina y eosina. Para las mediciones se utilizó el programa Leica Application Suite 3.4.1., calculándose el diámetro nuclear promedio, área nuclear promedio, perímetro nuclear promedio e índice de redondez, todos ellos parámetros cariométricos de valor pronóstico en medicina humana. Los resultados señalaron un aumento gradual de los valores morfométricos de cada parámetro, coincidentes con el aumento de la graduación nuclear, del estadio clínico, así como de los tipos histopatológicos considerados de peor pronóstico. Las curvas de supervivencia mostraron diferencias significativas al comparar los grados nucleares. Los hallazgos efectuados respaldan la cualidad predictiva de estas herramientas diagnósticas.

Palabras clave: perra, neoplasias mamarias, citodiagnóstico, graduación nuclear, parámetros cariométricos, valor pronóstico.

Abstract

This work aimed to validate the usefulness of subjective and objective determination of nuclear morphological characteristics in cytological samples of canine mammary tumors and check their predictive utility. Samples of 34 patients who were followed up for 18 months post surgery, were studied, situation that allowed survival curves confection.Clinical staging at diagnosis was made. The samples were obtained by fine needle punction, colored with hematoxylin and eosin and cytologic diagnosis and nuclear graduation were performed. The Leica Application Suite 3.4.1 Program was used for measurements, calculating the average nuclear diameter, the average nuclear area, the average nuclear perimeter and roundness index. All of these nuclear morphometric parameters are considered of prognostic value in human medicine. In this analysis, a gradual increase in morphometric values of each
parameter was observed. In accordance with higher nuclear graduation and clinical stages and also, in histological types considered of worse prognosis. Survival curves showed statistical differences when comparing nuclear degrees. The findings obtained here, support the predictive quality of determination of nuclear grade and its morphometric parameters.

Key words: bitch, mammary neoplasias, cytologic diagnosis, nuclear graduation, cariometric parameters, prognosis value.

Recibido: 7 de abril 2016

Aceptado: 22 de junio 2016

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INTRODUCCIÓN

Las neoplasias mamarias constituyen los tumores más frecuentes de las hembras caninas y son llamativas por su gran diversidad histomorfológica y su comportamiento biológico variable, difícil de predecir. Especialistas en el tema afirman que el reconocimiento de neoplasias verdaderamente malignas es problemático y que se tiende a sobrediagnosticar estas lesiones. Por ello recomiendan que al evaluar cortes histopatológicos con hematoxilina y eosina, se tenga en cuenta el tipo histológico, el grado de pleomorfismo celular y nuclear, el índice mitótico, las áreas de necrosis dentro del tumor, la invasión vásculo-linfática intra y peritumoral y la presencia de metástasis ganglionar ⁸.

Basándose en una clasificación que reveló idoneidad en pacientes humanos ⁷, se han propuesto varios sistemas de graduación de malignidad para estas neoplasias ^4,8,15. La disparidad de criterios existentes en los sistemas de graduación morfológica del cáncer mamario en caninos, genera una amplia variedad de conceptos y metodologías al momento de elaborar el diagnóstico y el pronóstio de vida para las pacientes. Ello demuestra la necesidad de investigar nuevos métodos objetivos confiables y reproducibles.

El estudio citológico constituye una herramienta eficaz en la aproximación diagnóstica de numerosos tipos de lesiones, facilitando la apreciación de las características nucleares. El grado de diferenciación nuclear de las células neoplásicas (grado nuclear), se viene utilizando desde hace mucho tiempo para diferenciar entre lesiones benignas y malignas, así como para determinar el riesgo de progresión de la enfermedad ¹⁶. Sin embargo, en general, carece de objetividad y de reproducibilidad debido a las variaciones propias de cada observador ^9,14.

Para compensar estas falencias se ha propuesto la aplicación de métodos morfométricos que exigen estandarización de los procedimientos de obtención y preparación de las muestras a valorar, del manejo de muestras representativas de una determinada lesión o tipo celular y de la selección del área del espécimen a medir ¹⁸.

Entre los numerosos parámetros estudiados, el más común es el área nuclear, determinada por el contorno nuclear a partir del cual pueden calcularse otros parámetros morfométricos como el diámetro, el perímetro y el índice de redondez nuclear ¹. Este último refleja la forma del núcleo celular, consignándose el valor de uno (1), cuando la misma se corresponde con un círculo perfecto ¹⁹.

En medicina veterinaria diversos estudios en diferentes tipos de neoplasias han recurrido al análisis de la morfometría nuclear como predictor ^5,9. Se ha propuesto la utilidad diagnóstica y predictiva que provee la cuantificación de estas características en las células de neoplasias mamarias de la mujer, lo cual podría ayudar a discriminar diferentes tipos de lesiones, evaluar el curso de la enfermedad, la supervivencia, el riesgo de metástasis e incluso discriminar la posibilidad de respuesta al tratamiento quimioterápico ¹.

Aunque el examen histopatológico continúa siendo el método más confiable para el diagnóstico ¹², el potencial, la eficacia y la practicidad clínica que representa la aplicación del citodiagnóstico, han sido comprobados hace tiempo en medicinas humana y veterinaria ¹¹. En la evaluación del carcinoma mamario de la mujer, la valoración morfométrica de diferentes parámetros nucleares aporta una valiosa información pronóstica adicional ¹⁸.

El presente trabajo tuvo como objetivo comprobar la utilidad predictiva de la determinación de las características morfológicas nucleares medibles en muestras citológicas de tumores mamarios caninos.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se trabajó con 34 pacientes caninas con neoplasias mamarias, cuya evolución pudo controlarse hasta los 18 meses. En el caso de aquéllas que presentaron múltiples tumoraciones, se estudió la progresión del tumor de mayor dimensión.

Se tomaron muestras citológicas de los tumores mamarios por el método de "punción con aguja fina", variante de la "punción-aspiración con aguja fina" ^2,3. Se utilizaron agujas descartables 40 x 8 y jeringas de 10 ml, para expeler el material sobre portaobjetos limpios y desengrasados. Los preparados fueron fijados en alcohol de 96º durante 5 minutos y coloreados con hematoxilina y eosina.

El diagnóstico citológico se realizó en base a una clasificación y graduación histológica de tumores mamarios del perro ⁸. Se procedió a la determinación de la graduación nuclear (GN), de acuerdo al ítem correspondiente a "pleomorfismo nuclear" del "sistema de graduación histológica de los carcinomas mamarios caninos y felinos" ¹³. En base al mismo, las pacientes fueron agrupadas en tres categorías (GN I, II y III), teniendo en cuenta el pleomorfismo, la condensación de la cromatina y la presencia y tamaño del nucleolo.

Se obtuvieron fotografías digitales utilizando un microscopio Leica DM500 con cámara digital Leica ICC50 acoplada. Sobre las imágenes se determinaron los valores de área nuclear promedio, perímetro nuclear promedio, diámetro nuclear promedio e índice de redondez (perímetro nuclear 2/4 π . área nuclear). Se registraron los valores de los recuentos realizados en 50 células de cada caso, utilizando el Leica Application Suite 3.4.1. Todas las mediciones se hicieron bajo un aumento de 400X y se expresaron en micrómetros.

Se procedió a la determinación del estadio clínico de las pacientes (Owen, 1980) considerando la clasificación "TNM" de la OMS, la cual contempla cinco categorías, de menor a mayor gravedad: I, II, III, IV y V. Los controles post-tratamiento fueron realizados hasta el año y medio, luego del tratamiento quirúrgico.

En base a las mencionadas determinaciones se confeccionaron "curvas de sobrevida de Kaplan-Meier". Estas curvas muestran en la ordenada, la probabilidad (que decrece desde 1) que tienen las pacientes con neoplasias mamarias de sobrevivir determinada cantidad de tiempo, representada en meses en la abscisa. Se buscaron diferencias entre los grupos considerados para cada uno de los parámetros estudiados, por medio de pruebas de χ² y análisis de la variancia. Las diferentes variables fueron analizadas mediante el programa InfoStat Profesional, versión 10 (FCA, Universidad Nacional de Córdoba) ⁶.

RESULTADOS

Las neoplasias estudiadas fueron diagnosticadas como diferentes variedades malignas de carcinomas (simples: 10 casos; complejos: 13 casos; mixtos: 8 casos) y sarcomas en 3 ocasiones.

La distribución de las neoplasias en las distintas categorías contempladas en la graduación nuclear, se observa en la Tabla 1.

Los valores promedio obtenidos para los distintos parámetros cariométricos, teniendo en cuenta la estadificación clínica, el diagnóstico del tipo histológico y la graduación nuclear, se detallan en la Tabla 2. La comparación de dichos parámetros entre las categorías de la estadificación clínica y del tipo histológico, no arrojó diferencias significativas, aunque sí las hubo (p: 0,0001) al comparar las tres categorías de la graduación nuclear.

Las "curvas de sobrevida" revelaron una disminución significativa (p: 0,002) del tiempo de supervivencia en las categorías de mayor graduación nuclear, tal como puede apreciarse en la Figura 1. No se obtuvieron diferencias significativas al analizar la supervivencia de las pacientes considerando la estadificación clínica o el tipo histológico.

DISCUSIÓN

Todas las muestras analizadas fueron diagnosticadas como variedades malignas de neoplasias mamarias. La citología demostró el potencial atribuido en medicina humana como técnica diagnóstica complementaria ¹¹, siendo aplicable en muestras citológicas de tumores mamarios caninos, acorde a lo demostrado por otros autores ⁵.

Los valores morfométricos nucleares de todos los parámetros considerados, mostraron un incremento progresivo en relación directa al aumento de la graduación nuclear y de la estadificación clínica considerada. Aunque no se encontraron diferencias significativas entre los distintos tipos histológicos, los valores más elevados se observaron en el grupo de los sarcomas, considerados por la bibliografía clásica como los de peor pronóstico. Estos resultados son coincidentes con los hallazgos efectuados en carcinomas mamarios de la mujer ¹⁷, que indican en forma cuantitativa los cambios de forma y de tamaño que sufre el núcleo celular durante el proceso de malignización.

Si bien el índice de redondez mostró pequeñas fluctuaciones, en ningún caso alcanzó el valor de 1, lo que indicaría que el núcleo de las células tumorales del canino conserva una forma ovoide, tal como sucede en el carcinoma mamario de la mujer ¹⁰. La menor supervivencia de las pacientes con índices próximos a dicho valor coincide con la premisa de que la aproximación a la esfericidad conlleva un mal pronóstico ¹⁹.

Los resultados de la valoración de las características morfológicas y morfométricas nucleares en muestras citológicas y su correlación con la sobrevida de las pacientes afectadas por neoplasias mamarias, coinciden con la idea expresada por investigadores que consideran a estas determinaciones como instrumentos complementarios eficaces para predecir la evolución de las pacientes ¹. El uso de programas informáticos analizadores de imágenes constituye una herramienta eficaz en el área, ya que facilita la apreciación y medición de ciertas características citológicas, permitiendo obtener resultados cuantificables y reproducibles que podrían resultar de utilidad para definir parámetros estandarizados, aún inexistentes en medicina veterinaria. El citodiagnóstico de neoplasias mamarias caninas, teniendo en cuenta la graduación nuclear subjetiva y la determinación de parámetros morfométricos nucleares objetivos, se muestran en estos resultados como herramientas diagnósticas con valor pronóstico acerca de la sobrevida de las pacientes.

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