TRABAJOS DE INVESTIGACIÓN

Fisiología reproductiva del pez Betta splendens en condiciones de laboratorio, Piedemonte Andino Amazónico (Colombia)

Murcia-Ordoñez, B.; Chaves, L.C.; España, W.F.; Castañeda, D.; Andrade, J.

Grupo de Investigación en Biodiversidad y Desarrollo Amazónico (BYDA), Universidad de la Amazonia, Calle 17-Diagonal 17 con Carrera 3F, Barrio Porvenir, Florencia-Caquetá-Colombia.
E-mail: b.murcia@udla.edu.co

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Resumén

Murcia-Ordoñez, B.; Chaves, L.C.; España, W.F.; Castañeda, D.; Andrade, J.: Fisiología reproductiva del pez Betta splendens en condiciones de laboratorio, Piedemonte Andino Amazónico (Colombia). Rev. vet. 27: 2, 124-129, 2016. Las estrategias reproductivas (cortejo, fecundación, fertilización e incubación) del pez Betta splendens, así como su desarrollo embrionario (cigoto, mórula, blástula, gástrula, organogénesis y eclosión) fueron observados y registrados en 100 huevos previamente fecundados bajo condiciones de laboratorio (temperatura 27,8ºC, pH 6,8) en la Universidad de la Amazonia (Florencia, Caquetá, Colombia), con el fin de obtener información que genere ventajas para la producción y comercialización de esta especie. Se utilizó el programa Toup View versión 2.1 con el cual se midieron las estructuras morfológicas de 32 ovocitos cada 5 minutos hasta la organogénesis y después cada cuatro horas hasta la eclosión. Se obtuvo una tasa de fertilidad de los desoves de 83±2,0%. El tiempo transcurrido desde la fecundación hasta la eclosión fue de 36,13 h. El tamaño del disco germinal fue de 529,39 μm, el radio de 5,64 μm y el saco vitelino de 679,43μm. Después de la fecundación, el huevo sufrió una serie de cambios muy rápidos (±36 h) del desarrollo embrionario, incluyendo la segmentación (40 min), ciclaje (50 min), gastrulación (55 min), segmentación y organogénesis (16 min), morfogénesis (21 h), eclosión y estado larvario (13 h). Se concluye que el desarrollo embrionario de B. splendens es más corto (36.13 h) que el de otros peces teleósteos, dato que servirá como información base para estudios encauzados a la reproducción de esta especie con fines comerciales.

Palabras claves: pez Betta splendens, estrategias reproductivas, desarrollo embrionario.

Abstract

Murcia-Ordoñez, B.; Chaves, L.C.; España, W.F.; Castañeda, D.; Andrade, J.: Reproductive physiology Betta splendens fish in laboratory conditions, Piedemonte Andino Amazon (Colombia). Rev. vet. 27: 2, 124-129, 2016. It was observed and described the reproductive strategies (courtship process, fecundation, fertilization and incubation) and the embryo development (zygote, morula, blastula, gastrula, and organogenesis hatching) in 100 fertilized eggs of Betta splendens under laboratory conditions (temperature 27.8°C, pH 6.8) at Universidad de la Amazonia (Florencia, Caquetá, Colombia), in order to get information that generates advantages for the production and marketing of this species. Toup View program 2.1 version was used to measure the morphological structures of 32 oocytes every 5 minutes until organogenesis and then every four hours until hatching. It was obtained a percentage of fertility spawns of 83±2.0% and elapsed time (from fertilization to hatching) of 36.13 h for this species. Germinal disc size was 529.39 μm with a radius of 5.64 μm and a yolk sac 679,43μm. The egg undergoes a series of rapid changes (±36 h) after fertilization generating embryonic development: segmentation (40 min), cycling (50 min), gastrulation (55 minutes), segmentation and organogenesis (16 min), morphogenesis (21 hours), hatching and larval stage (13 hours). It is concluded that B. splendens is a fish with a type of embryonic development fairly short (36.13 h) compared to the period presented in other teleost fish, data that will be useful for further studies related to the reproduction of this species for commercial purposes.

Key words: fish Betta splendens, reproductive strategies, embryonic development.

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INTRODUCCIÓN

Uno de los aspectos fisiológicos en los animales es el control de la reproducción que en peces involucra un proceso multifactorial donde interaccionan agentes ambientales (fotoperíodo, temperatura, oxígeno disuelto, salinidad, entre otros), sociales (comportamiento, preferencias reproductivas, presencia de otros individuos, densidad de población, proporción de sexos), neurales (sistemas sensoriales y receptores específicos), endocrinos (melatonina) ⁸ y nutricionales (preferencias tróficas) ²¹ que no solo permiten generar estrategias reproductivas (colas amplias, policromía, rituales de cortejo, cantidad de huevos en postura, cuidado parental) ²⁴ sino su desarrollo embrionario (estadios embrionarios, larvarios y tiempos de ocurrencia) ⁵ . A pesar de que los cambios ambientales afectan profundamente la función reproductiva en los peces teleósteos y que este hecho ocurre por alteraciones en el eje cerebro-hipófisis-gónadas, encargado de que la reproducción tenga lugar en el momento más favorable para la supervivencia de la progenie ⁸ , el vínculo entre el medio ambiente y la cascada neuroendocrina queda por aclarar ^{2, 15, 18, 29}.

Los estudios sobre reproducción de peces con fines comerciales se incrementan cada día más, principalmente los relacionados a los primeros estadios vitales (huevos, larvas y etapas tempranas de juveniles) ya que son críticos para las fluctuaciones en la abundancia de las poblaciones de peces explotadas ³³ , como en el caso de Betta splendens, apetecido comercialmente ²⁶ por su estructura faríngea (laberinto) que le permite tomar oxígeno atmosférico cada 3 minutos aproximadamente ³, dimorfismo sexual, (policromía) y el cuidado parental del macho en las primeras fases de desarrollo (fertilización a eclosión) ¹² . Según algunos estudios, este pez genera -mediante la fertilización- una nube de semen o espuma que contiene componentes bactericidas y sustancias que modifican favorablemente la composición química del agua en derredor a los huevos, permitiendo así el desarrollo favorable del embrión y su eclosión ^{3, 17}.

A pesar de ello, el tiempo de desarrollo así como las características embrionarias de B. splendens son poco conocidas, por lo cual resulta necesario profundizar conocimientos acerca de sus estrategias reproductivas (proceso de cortejo, fecundación, fertilización e incubación), así como conocer su desarrollo embrionario, datos que aportarían ventajas para su producción y comercialización.

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se llevó a cabo en los laboratorios de investigación en fisiología animal e ictiología de la Universidad de la Amazonia (Florencia, Caquetá, Colombia), localizados a 1°36´25.95 N y 75°36´27.12 W, con una altitud de 350 msnm., temperatura promedio de 25°C y humedad relativa del 80%.

Se tomaron 100 huevos previamente fecundados de cuatro parejas de B. splendens sexualmente maduras, que fueron mantenidos en acuarios acorde a procedimientos habituales para esta especie ^{3, 14, 22, 30}, incluyendo la observación y descripción de su estrategia reproductiva (procesos de cortejo, fecundación, fertilización e incubación). Para la descripción de los cambios morfométricos y embriológicos se extrajo una muestra equivalente al 33% de ovocitos fecundados ³¹ , los cuales fueron clarificados (solución transparentadora YBAG/85) y fijados (1000 ml H2O + 6,5 g NaCl + 10 ml de formol 40%) ¹⁰ para su observación. Las muestras fueron colectadas cada 5 min hasta la evidencia de la organogénesis; después se colectaron cada 4 h hasta su eclosión, además se tomaron cuatro larvas para determinar aspectos morfométricos ³² . Se realizó la clasificación y descripción de los diferentes estadios ²⁵ , así como la morfometría y merística de los huevos y larvas ³⁵ ; se separaron los estadios en pre-larvas, larvas y post-larvas ^{20, 25}.

Las abreviaturas empleadas en este manuscrito son: minutos post-fecundación (MPF), diámetro del huevo (DH, medido a través de la distancia de la línea media horizontal del huevo, se nombra así cuando no hay diferencia entre la longitud y ancho del huevo); diámetro del saco vitelino (DSV= distancia de la línea media horizontal del vitelo), espacio perivitelino (EPV= diferencia entre DH y DSV), longitud del vitelo (LV= distancia entre márgenes anterior y posterior del saco vitelino), ancho del vitelo (AV= distancia entre márgenes dorsal y ventral del saco vitelino), distancia postorbital (DPO= distancia entre el borde del hocico y el margen anterior de las expansiones alares), eje del embrión (EE= longitud desde la cabeza hasta su polo opuesto); longitud notocordal (LN= distancia entre el extremo anterior de la cabeza hasta el final de la notocorda), ancho de notocordio (AN), largo de la cola (LC), ancho de vesículaóptica (AVO), largo vesícula óptica (LVO), plano de división (PD), blastómeros (B), polo animal (PA), polo vegetal (PV), discoblástula (DB), borde periblasto (BP), parte anterior (A), parte caudal (PC), vesícula de Kupffer (K), saco vitelino (SV), vitelo (V), vesícula óptica (VO), vesícula ótica (VOT), notocordia (N), somitas (SM), cristalino (C), ubicación del corazón (CZ). Todas las medidas fueron registradas con una cámara de video profesional USB (1280 x 1024X) dispuesta en un estereomicroscopio (Zeiss Stemi 2000C) y analizadas con un programa computacional analizador de imágenes (Toup View versión 2.1 vimicro USB 2.0 UVC).

RESULTADOS

Proceso de cortejo y fertilización. Se inició con la formación del nido por parte del macho (Figura 1a), el cual segregó una sustancia blanca en forma de espuma que se mantuvo sólida y consistente en la superficie del acuario. Seguidamente, se colocó la hembra apta para la reproducción (abdomen abultado) junto al macho

para que éste inicie la danza de cortejo, la cual consistió en mover y ampliar sus ornamentos sexuales (los opérculos y la extensión de su aleta anal) alrededor de ella. Tras una persecución no exenta de golpes y mordeduras, la hembra lo aceptó. Esto sucedió cerca del nido de burbujas, donde el macho abrazó a la hembra y ejerció presión sobre su vientre haciendo que desove (extrucción). Acto seguido él liberó el semen fertilizando los huevos (Figura 1b).

Fecundación y cuidado parental. Esta fase comenzó inmediatamente después de la fertilización. La hembra fue retirada y el macho inició su cuidado parental subiendo los huevos uno por uno y pegándolos al nido. Los huevos caídos al fondo fueron recogidos y ubicados nuevamente en el nido (Figura 1b). Las hembras desovaron entre 60 y 85 huevos aproximadamente, estos eran de color blanco y no flotaban.

Incubación y eclosión. En este estadio los oocitos fertilizados se transformaron en embriones, anexados a la membrana coriónica y al disco germinal. Este último registró un tamaño de 529,39 μm. El saco vitelino midió 679,43 μm (Figura 2). La temperatura del agua de incubación fue de 27,8±1,5ºC y un pH de 6,8±0,2. La tasa de fecundación de los desoves realizados fue de 83±2,0%. El tiempo transcurrido desde la fecundación hasta la eclosión fue de 36:13 h; durante este tiempo el embrión atravesó por los siguientes períodos: cigoto, clivaje (blástula), gástrula, segmentación y organogénesis, eclosión y estado larval.

Período de cigoto. Luego de la fecundación e hidratación, el cigoto (Figura 2a) presentó un espacio perivitelino (Figura 2b) que duplicó en diámetro al embrión en desarrollo: Figura 2b (EPV=77μm), Figura 2c (EPV=106μm) y Figura 2d (EPV=149μm); este estadio se observó aproximadamente entre los 10 y 12 MPF, en ese período de tiempo se produjo la segregación del blastodisco diferenciando un polo animal y uno vegetal (Figura 2b).

Período de clivaje (blástula). El clivaje se realizó después de la fecundación, aproximadamente a los 50 MPF, donde el huevo sufrió divisiones en el citoplasma (Figura 3). Se presentó un desarrollo de blástula temprana donde el blastodisco adoptó una forma ovalada diferenciando dos polos, por lo cual se reconoció que los huevos eran del tipo telolecítico, ya que acumulan vitelo en el polo vegetal de los mismos y presentan una división parcial o meroblástica durante los primeros estadios del desarrollo, con un EPV=93 μm; ab=512 μm, AV=592 μm y LV=490 μm (Figuras 3 y 4).

Período de gástrula. En el periodo de gastrulación (Figura 5), continuó el movimiento de epibolia, al que se sumaron los movimientos morfogenéticos de involución, convergencia y extensión, que llevaron finalmente a la generación de las diferentes capas germinales y ejes embrionarios, observándose que el cigoto presentaba una forma ovoide donde claramente se reconocía el anillo embrionario, el eje dorsoventral del embrión y la zona de evacuación, lo cual indicó la formación del eje anteroposterior del embrión. Todo este proceso abarcó un tiempo de 55 minutos, con un diámetro de vitelo de 530 μm, ancho de 612 μm y largo de 646μm. Por su parte, la cabeza registró 216 μm de ancho y 351,20 μm de largo.

Período de segmentación y organogénesis. El estadio de segmentación (Figura 5c y 5d) y organogénesis (Figura 6a y 6b) tardó aproximadamente 16 min seguido de la morfogénesis, la cual registró una duración de alrededor de 21 h. Se encontró un Lvo=89μm y Avo=50 μm (Figura 5b); asímismo LV=81,2 mm, AV=80 mm; DPO=76,3 mm; EE=528 μm; LN=490 μm; AN=41 mm; LC=318,5 μm, Lvo= 53,4 μm y Avo=48,8μm (Figura 5d). Se observó la formación del tubo neural, se inició la somitogénesis y se produjeron las primeras diferenciaciones morfofisiológicas (aparición de los esbozos de los órganos primarios, aumento del tamaño del primordio de la cola, elongación del embrión y aparición de la vesícula óptica, observándose los primeros movimientos corporales (como latidos del corazón) y surgimiento de la vesícula de Kuppfer.

Período de eclosión y estado larvario. En la última etapa, que tardó unas 13 h, se observó la eclosión y el estado larvario de B. splendens. En esta última fase se detectaron los inicios de la aleta caudal, tanto en la parte anterior como posterior, un vitelo de longitud más pronunciada, de 702 μm y de grosor de menor tamaño. La cola registró una flexibilidad apropiada para su inicio (Figura 6c y 6d).

DISCUSIÓN

La descripción de las estrategias reproductivas utilizadas por B. splendens se basaron principalmente en características: morfológicas (policromía) ²⁴ , ecológicas (coexistencia con otras especies, sobrevivencia con micrófitas y en superficies quietas, sin aireación, tolerancia de temperaturas entre 26 y 30ºC y pH entre 7.0 y 7.5), y etológicas (cortejo, fertilización, fecundación y cuidado parental, incubación y eclosión) ¹² , cualidades que permite su fácil reproducción y desarrollo en cautiverio. El desarrollo de B. splendens desde la fecundación hasta la eclosión ¹ , pasando por diversas etapas (cigoto, clivaje o blastulación, gástrula, segmentación y organogénesis, eclosión y estado larval), en esta investigación insumió una duración de 36,13 h. Otros autores reportaron lapsos similares, con una diferencia de 1,13 horas ⁴ , posiblemente debido a la temperatura utilizada. Asimismo, el lapso aquí obtenido fue menor que el reportado para el pez cebra (Danio rerio) ¹⁶ (48 h), pero mayor que el registrado en el hibrido de Piaractus brachypomus y Colossoma macropomum, que fue de 12 h ⁶ . En el pez ángel (Pterophyllum scalare), la eclosión ocurrió 42,5 h post-fecundación, cuando la incubación se hizo a 28°C ³¹ . El período de clivaje abarca las primeras seis divisiones incluyendo la blastulación, donde el blastodisco -inicialmente deforme- inicia su organización y la evolución de sus bordes sobre la vesícula vitelina ³¹ , donde se diferencian dos polos, por lo que se reconoce que los huevos son del tipo telolecítico, similares a los reportados para Pseudoplatystoma fasciatum ²⁷ , Danio rerio y Fundulus heteroclitus entre otros, ya que acumulan vitelo en el polo vegetal y presentan una división parcial o meroblástica durante los primeros estadios del desarrollo ²⁸ . Para este periodo algunos autores reportan tiempos entre 40 min y 1,33 h ^{17, 17, 23, 27}. El lapso obtenido en el presente estudio (50 MPF), es bastante corto en comparación con el periodo reportado en otros peces como Brycon siebenthalae ¹¹ , Danio rerio ¹⁶ y Prochilodus lineatus ⁷.

El período de gastrulación resultó similar al reportado para Prochilodus lineatus ⁷ , Danio rerio, Oryzias latipes, Fundulus heteroclitus, Barbus conchonius y salmónidos ²⁸ , donde el elemento común entre estas especies y el B. splendens es que la gastrulación es un fenómeno concomitante a la epibolia que acontece a partir de un grupo de células localizadas en el polo animal del huevo telolecito (blástula) y durante la gastrulación, las células de la blástula experimentan una redistribución dramática para originar un embrión multilaminar con rudimentos de cabeza, tronco y cola ³⁴ , generado a través de movimientos celulares altamente coordinados mediante los cuales, grupos definidos de células se internalizan desde la superficie formando un blastoporo y dando origen al endomesodermo ²⁸ . Los estadios de segmentación y organogénesis fueron similares al desarrollo embrionario descripto para Pseudoplatystoma fasciatum ²⁷ y Danio rerio ¹⁹ . Asimismo, aparece en B. splendens la vesícula de Kuppfer, una estructura transitoria que se presenta en el desarrollo de los teleósteos durante el período de segmentación ⁷ . La última etapa (eclosión y estado larvario) fue similar a la reportada para Brycon siebenthalae donde se observan los primordios de la aleta caudal, vitelo más pronunciado y cola más flexible ¹¹ . Los oocitos de peces de agua dulce contienen en su mayoría gran cantidad de vitelo (telolecito, al igual que en otros teleósteos) ^{7, 28} , lo que conlleva la formación de embriones y larvas pequeñas. Este acontecimiento facilita la difusión de oxigeno por todo el cuerpo, cuando la presión molecular O2 dentro del embrión o de la larva, es mejor que fuera de sí mismos, haciendo que los gases (oxigeno, dióxido de carbono y amoníaco) se difundan a través de diversas membranas biológicas, incluyendo el corion ¹¹. Embriones y larvas pelágicas usualmente no desarrollan órganos respiratorios especializados y generalmente es tardía la aparición de eritrocitos en plasma sanguíneo. Sin embargo, los peces laberinto pertenecientes a la familia Anabantidae (subfamilia Ctenopinae, genero Betta), presentan un órgano respiratorio adicional situado en las agallas, compuesto por numerosas láminas que permiten respirar aire fuera de la superficie del agua ⁹ . Esta característica fisiológica posibilita la respiración en aguas con temperaturas muy elevadas y poco oxígeno ¹³ . En conclusión, se aportan datos que profundizan el conocimiento de las estrategias reproductivas y el desarrollo embrionario de B. splendens, que en condiciones de laboratorio insumen un lapso relativamente corto en comparación con otras especies, hallazgos que pueden contribuir a mejorar la reproducción de este pez con fines comerciales. Agradecimientos. A la Universidad de la Amazonia por brindar la infraestructura necesaria para la investigación. Al estudiante del programa de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Sergio Luis Oliveros, por su colaboración en las tareas realizadas.

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