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Revista veterinaria

versión On-line ISSN 1669-6840

Rev. vet. vol.28 no.2 Corrientes jun. 2017

 

TRABAJOS DE INVESTIGACIÓN

Lactococosis en Pseudoplatystoma reticulatum

 

F. Quintana, C.I.; Guidoli, M.G.; Domitrovic, H.A.; Blanco, T.K.

Instituto de Ictiología del Nordeste, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Nordeste (UNNE), Cabral 2139, Corrientes (3400), Argentina. Tel 0379-4425753 interno 152. E-mail: carolina@vet.unne.edu.ar

 


Resumen

La lactococosis fue reportada a nivel mundial en numerosas especies de peces, ocasionando elevadas pérdidas económicas. Pseudoplatystoma reticulatum es una especie autóctona del río Paraná muy apreciada para el consumo, por lo cual la evaluación de las patologías en los cultivos intensivos es importante. Las muestras obtenidas en este trabajo corresponden a ejemplares juveniles provenientes de una piscicultura de la región nordeste argentina donde se registró una mortandad aguda. Los ejemplares afectados fueron anestesiados y sacrificados. Se realizó la ablación del hígado y secciones del órgano fueron empleadas para improntas. Pequeños trozos se colocaron en medio de cultivo Reinforced Clostridial Medium (Difco) y fueron incubados. El medio de cultivo crecido se sembró por estriado en placas conteniendo medio de Man Rogosa y Sharpe agar (MRS Merck), cultivándose durante 24 a 48 h. Los microorganismos obtenidos se sometieron a pruebas bioquímicas para determinar su ubicación taxonómica. Fragmentos de branquias, hígado, bazo, tubo digestivo y riñón fueron fijados en solución de Bouin, posteriormente fueron deshidratadas e incluidas en parafina. Los cortes histológicos se colorearon con Hematoxilina-Eosina, PAS y Giemsa. Se encontraron lesiones hemorrágicas en distintos puntos del tegumento, presencia de líquido ascítico y numerosas lesiones puntiformes en hígado. En las improntas y pruebas bioquímicas se detectaron cocos Gram positivos aislados, en diplos o en cadenas cortas, catalasas negativas e incapaces de reducir nitratos y sintetizar triptófano a partir de indol. En el hígado se observó predominio de alteraciones vasculares, fundamentalmente hemorrágicas de marcada intensidad. En el bazo se observaron intensas alteraciones vasculares, con predominio congestivo y hemorrágico. Las características clínicas de las lesiones, las pruebas bioquímicas y el diagnóstico histopatológico permiten atribuir la mortandad a Lactococcus garvieae.

Palabras clave: pez, bacteria, septicemia hemorrágica.

 

Abstract

Lactococcosis is reported worldwide in numerous fish species causing heavy financial losses. Pseudoplatystoma reticulatum is a native species of Paraná River, edible and highly appreciated in the region, so the consideration of diseases in intensive crops is important. In this work we present a high mortality case of P. reticulatum juveniles from a farm located in Northeastern Argentina. For this purpose, animals with symptoms were euthanized and the head was removed. Liver was collected and sections of the organ were used for histopathology. Small pieces were placed in tubes containing Reinforced Clostridial Medium (Difco) and then incubated. Cultures with microorganisms were incubated on plates containing Man Rogosa and Sharpe agar (MRS Merck) during 24 to 28 h. The colonies obtained were restrocked and kept refrigerated at -20°C in media containing glycerol at 20%. Cultured microorganisms were submitted to various biochemical tests to determine their taxonomy. Samples of gills, liver, spleen, gastrointestinal tract and kidney were fixed in Bouin's solution and then dehydrated and embedded in paraffin. Histological sections were stained with Hematoxylin-Eosin, PAS and Giemsa. Hemorrhagic lesions were found in different parts of the tegument, and presence of ascites and numerous punctuate lesions in the liver were observed. In the imprints and biochemical tests of isolates Gram positive cocci were isolated, in diplos or short chains, that were negative catalase test and unable to reduce nitrate and synthesize tryptophan from indol. In the liver it was observed predominance of vascular alterations, mainly hemorrhagic of high intensity. Bacterial invasion stood out with predominantly peripheral location. In the spleen intense vascular alterations were observed with congestive and hemorrhagic dominance. It can be concluded according to the clinical characteristics of lesions, biochemical tests and histopathological diagnosis that mortality of fishes was due to Lactococcus garvieae.

Key words: fish, bacteria, septicaemic infection.

 

Recibido: 22 abril 2016

Aceptado: 7 diciembre 2016


 

INTRODUCCIÓN

Lactococcus garvieae es una especie bacteriana de importancia clínica tanto en seres humanos como animales 14, siendo uno de los agentes causales de mastitis en bovinos y búfalos 7, 30. Fue aislado a partir de muestras clínicas de sangre, orina y piel de pacientes humanos 15. Tiene amplia distribución en alimentos lácteos y cárneos, por lo cual se lo incluye como un potencial agente zoonótico, existiendo estudios epidemiológicos que evalúan la virulencia de sus diferentes cepas 13, 16, 23 ,25.

Entre Lactococcus y Enterococcus existen semejanzas fenotípicas que dificultan su diagnóstico microbiológico. La indisponibilidad de exámenes precisos en la mayoría de los centros médicos del mundo probablemente genere un subdiagnóstico de Lactococcus garvieae el cual podría implicar una significación clínica mucho mayor de la que le es atribuida 8, 19.

En peces, la enfermedad ocasionada por este microorganismo se definió como lactococosis, a fin de diferenciarla de aquellas cuyos agentes etiológicos son otros géneros de cocos Gram positivos y catalasa negativos, como Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis o Vagococcus salmoniarum, que se conocen con el término genérico de estreptococosis 3, 9, 10, 12, 22.

Las infecciones por L. garvieae se diagnosticaron en diferentes países 11, 12, 20, 21 con mayor impacto económico en la industria de la trucha, anguila (Anguilla anguilla), cola amarilla (Chrysiptera parasema) y camarón (Penaeus vannamei) 6, 10, 21. Los peces afectados presentan anorexia, melanosis, letargia, pérdida de orientación y natación errática. Los signos externos típicos son exoftalmia, hemorragias en las zonas periorbital e intraocular, base de las aletas y regiones perianal, opercular y bucal.

A pesar del incremento en la significación clínica de L. garvieae, los estudios para su caracterización y relación epidemiológica entre los diferentes aislamientos, sigue siendo muy limitada 12, 30, debiendo aplicarse técnicas bioquímicas rutinarias y/o tests reactivos para poder diferenciar esta patología de otras relacionadas y llegar así a un tratamiento adecuado 31.

Pseudoplatystoma reticulatum ("surubí atigrado") es un pez autóctono del río Paraná, de interés comercial y deportivo, resultando importante la evaluación de las patologías capaces de afectarlo. En este trabajo se analizan las características clínicas, histopatológicas y microbiológicas que se presentaron en una mortandad aguda registrada en una piscicultura de Pseudoplatystoma reticulatum en la región nordeste argentina.

 

MATERIAL Y MÉTODOS

Las muestras obtenidas correspondieron a ejemplares juveniles de Pseudoplatystoma reticulatum de 5 meses de edad, provenientes de un establecimiento comercial ubicado en el nordeste argentino, donde se registró una mortandad aguda. Los ejemplares afectados fueron anestesiados con agua helada y sacrificados por desmedulación. En dos ejemplares se realizó la ablación del hígado en condiciones de esterilidad. Secciones del órgano obtenidas asépticamente se usaron para realizar improntas en portaobjetos limpios y desengrasados.

Los preparados se dejaron secar, se fijaron por acción del calor y se tiñeron mediante coloración de Gram usando el kit de coloración Gram de Britania (código B1446082), aplicando la técnica descripta en el instructivo correspondiente. Una vez secos, los preparados se observaron con objetivo de 100x en un microscopio Olimpus BX41, adaptado a una cámara digital C7070.

Pequeños trozos de los hígados así obtenidos fueron colocados en tubos conteniendo 10 ml de Reinforced Clostridial Medium (Difco) e incubados durante 48 h a 37°C. El medio de cultivo crecido se sembró por estriado en placas conteniendo agar de Man Rogosa y Sharpe (MRS-Merck) y se cultivó durante 24 a 48 horas a 37°C. Las colonias obtenidas se repicaron hasta asegurar su pureza y se conservaron refrigeradas a -20°C en medios conteniendo glicerol al 20% hasta su posterior utilización. Los microorganismos así obtenidos fueron sometidos a diferentes pruebas bioquímicas para determinar su ubicación taxonómica:

Coloración de Gram-Nicolle: se realizó usando el kit de coloración Gram de Britania ya descripto, aplicándose la técnica detallada en el instructivo correspondiente.

Actividad catalasa: en un portaobjetos se mezclaron 20 µl de cultivo activo con 20 µl de peróxido de hidrógeno 30 volúmenes 18.

Reducción de KNO3: las suspensiones de microorganismos se inocularon en el medio específico (peptona de carne 0,86%, NaCl 0,64%, KNO3 0,15%, pH 7,2.) y se incubaron durante 24 a 48 h a 37°C. La producción de nitritos se evidenció por la aparición de color naranja luego de la adición de gotas de solución de α-naftol (1 g de α-naftol en 100 ml de etanol absoluto) y ácido sulfanílico (1 g de ácido sulfanílico en 100 ml de ácido acético 5 N). El nitrato residual se detectó mediante el agregado de polvo de Zn y la presencia de amonio se evidenció utilizando el reactivo de Nessler (7 g de KI, 10 g de HgI2, y 10 g de KOH en 100 ml de agua destilada).

Producción de indol a partir de triptófano: las suspensiones de microorganismos se inocularon en el medio adecuado (peptona de carne 1%, D,L-triptófano 0,1%, NaCl 0,5%, pH 7,2) y se incubaron por 24 a 48 h a 37°C. La producción de indol se reveló con el agregado de los reactivos Gracian I (formol y H2 SO4 concentrado en proporción 2:1) y Gracian II (K2 Cr2O3 al 0,5 %). La aparición de un anillo rojo en la superficie indicó reacción positiva.

Identificación fenotípica con kits comerciales: la identificación fenotípica se llevó a cabo mediante el uso del sistema API 20 Strep (Biomerieux).

Otras determinaciones: se obtuvieron muestras de sangre con las que se realizaron extendidos, así como fragmentos de branquias, hígado, bazo, tubo digestivo y riñón. Pequeñas porciones de cada uno de estos órganos fueron fijadas en solución de Bouin y posteriormente deshidratadas e incluidas en parafina. Los cortes histológicos fueron coloreados con Hematoxilina-Eosina, PAS y Giemsa, para su análisis.

 

RESULTADOS

En el examen macroscópico se encontraron lesiones hemorrágicas en tegumento a nivel de cabeza, aletas y ojos, como también manchas puntiformes en superficie ventral, próximas al opérculo y almohadilla dentaria. Las lesiones internas observadas consistieron en la presencia de líquido ascítico y numerosas lesiones puntiformes en el hígado, el cual presentó disminución de su consistencia.

El análisis microscópico de las improntas del hígado determinó la presencia de cocos Gram positivos aislados, en diplos, cadenas cortas y grandes agrupaciones. Se observó el desarrollo de los microorganismos en el medio enriquecido a través del incremento en la turbidez respecto del medio sin inocular. La siembra por estría en placas conteniendo MRS agar permitió el desarrollo de colonias puntiformes y transparentes.

Las pruebas bioquímicas de los aislamientos obtenidos indicaron la presencia de bacterias esféricas Gram positivas aisladas, en diplos o pequeñas cadenas, catalasas negativas e incapaces de reducir nitratos y sintetizar triptófano a partir de indol, características propias de las bacterias ácido lácticas. Los resultados obtenidos con el sistema API 20 Strep se detallan en Tabla 1.

 

Tabla 1. Perfil del API 20 Strep para la cepa identificada como L. garvieae.

Descripción: Descripción: G:\RI UNNE\Revistas\Revista veterinaria\rev_vetv28n2\img\a08tab1.jpg

 

En el examen microscópico se observaron las branquias con arquitectura conservada y estructura laminar ordenada, detectándose congestión moderada. En el hígado la estructura estaba parcialmente conservada con predominio de alteraciones vasculares, fundamentalmente hemorrágicas de marcada intensidad y lesiones celulares intensas del parénquima. Se detectaron procesos degenerativos en diferentes etapas evolutivas, presencia de extensas áreas de necrosis, caracterizadas por pérdida de detalles celulares y núcleos picnóticos. Se registraron áreas de reacción tisular caracterizadas por fenómenos regenerativos. En el hígado se destacó invasión bacteriana con predominio de ubicación periférica. La reacción inflamatoria fue escasa, más evidente en la periferia del órgano y alrededor de vasos sanguíneos (Figura 1).

 

Figura 1. Hígado de P. reticulatum. Arquitectura parcialmente conservada, predominio de alteraciones vasculares, hemorragias, procesos degenerativos, áreas de necrosis y fenómenos regenerativos. Arriba: 40x, HyEGiemsa, Abajo izquierda: 40x, HyE, Abajo derecha: 20x, HyE.

Descripción: Descripción: G:\RI UNNE\Revistas\Revista veterinaria\rev_vetv28n2\img\a08fig1.jpg

 

En el riñón la arquitectura se presentó conservada y se evidenciaron fenómenos congestivos y hemorrágicos leves, con invasión bacteriana y reacción inflamatoria escasa (Figura 2).

 

Figura 2. Riñón de P. reticulatum. Arquitectura conservada, fenómenos congestivos y hemorrágicos leves con invasión bacteriana y reacción inflamatoria escasa. Izquierda: 20x, derecha: 40x, HyE.

Descripción: Descripción: G:\RI UNNE\Revistas\Revista veterinaria\rev_vetv28n2\img\a08fig2.jpg

A nivel del tubo digestivo la arquitectura estuvo conservada. Tanto el epitelio como las estructuras glandulares se encontraron normales. En el bazo se observaron intensas alteraciones vasculares, predominio congestivo y hemorrágico (Figura 3). Los extendidos de sangre revelaron numerosos elementos figurados de la serie blanca con predominio linfocítico y plaquetario.

 

Figura 3. R. Bazo de P. reticulatum. Alteraciones vasculares, predominio congestivo y hemorrágico. Izquierda: 40x. Derecha: 100x. HyE-Giemsa.

Descripción: Descripción: G:\RI UNNE\Revistas\Revista veterinaria\rev_vetv28n2\img\a08fig3.jpg

 

DISCUSIÓN

El notable desarrollo de la producción intensiva de peces produjo paralelamente un incremento progresivo en la incidencia y gravedad de las enfermedades infecciosas, especialmente las de etiología bacteriana 32. A excepción de Renibacterium salmoninarum, las enfermedades producidas por bacterias Gram positivas recibieron siempre un menor grado de atención, por considerarse que el impacto productivo era poco relevante. Sin embargo, las enfermedades ocasionados por cocos y cocobacilos Gram positivos y catalasa negativos, aumentaron su frecuencia y virulencia.

La piscicultura en Argentina tuvo un notable desarrollo en la región nordeste, con numerosos productores de pacú, carpas, dorado, surubí, tilapia, sábalo, boga y salmón de río. Pseudoplatystoma reticulatum es una especie muy apreciadas para el consumo, por lo que el avances en el conocimiento de las patologías contribuye a evitar pérdidas por muerte o devaluación comercial de los peces enfermos, por el descenso de la producción o por los gastos de tratamiento, profilaxis y control sanitario que se deben realizar en las instalaciones afectadas.

En este trabajo se observa que el brote que ocasionó la mortandad de numerosos ejemplares se produjo al final de la primavera y afectó a ejemplares juveniles de Pseudoplatystoma reticulatum, lo cual estaría relacionado con lo descrito en algunos trabajos que reportan mayor susceptibilidad en ejemplares jóvenes 32.

La lactococosis fue reportada en numerosas especies de peces en todo el mundo, ocasionando elevadas pérdidas económicas 17, 32, caracterizándose por producir una septicemia hemorrágica hiperaguda, que evoluciona cuando la temperatura del agua es superior a 15ºC 4, 28.

El aislamiento permitió identificar bacterias esféricas inmóviles, Gram +, catalasa y oxidasa negativa. Usando API 20 se identificó a Lactococcus garvieae, cuyas propiedades bioquímicas fueron similares a las descriptas en otros trabajos 2, 29.

Las lesiones observadas en el surubí atigrado coinciden con las descriptas en brotes infecciosos por Lactococcus. Las petequias y hemorragias en la superficie y órganos internos se producen por el daño en el endotelio vascular que ocasionan las toxinas 32. Los principales órganos afectados son hígado, bazo, cerebro, vejiga natatoria, intestino, riñón y corazón 24, 26, 27, 28. Histológicamente se caracterizaron lesiones hemorrágicas, inflamatorias, necróticas y fibroplásicas en los distintos órganos afectados 2, 4, 5, 6, 10.

Los microorganismos del género Lactococcus pasaron de considerarse patógenos oportunistas a patógenos emergentes 1. Su importancia se extiende más allá de la acuicultura, ya que existe un creciente número de casos en los que se aísla e identifica esta bacteria en seres humanos. En el nordeste argentino es la primera vez que se reporta esta enfermedad. 

 

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