Introducción

El hígado graso (HG) es relevante en medicina veterinaria ya que afecta a diferentes especies animales, entre ellas al ganado bovino productor de leche, particularmente en el período del peri-parto. Es considerada la mayor alteración metabólica del peri-parto, con disminución de la ingesta de alimento y de la producción de leche ^6,24. Por ello, compromete tanto la producción como la salud animal, con un impacto económico negativo en el sector agropecuario ³.

Las expectativas de la vaca lechera de alta producción abarcan las de concebir y llevar a buen término la preñez, simultáneamente a una elevada producción lechera. La condición después del parto de la vaca, afecta la totalidad de los parámetros de función ovárica y de fertilidad, asociados con los cambios funcionales de adaptación ²¹.

Se ha establecido que durante los primeros 90 días en producción, la aplicación de colina a vacas recién paridas, como medida preventiva para evitar el HG, mejora la producción láctea, disminuye la cetosis alrededor del parto y por consiguiente el riesgo de sufrir enfermedades del periparto y de la lactancia ¹⁷.

Los modelos experimentales para investigar el HG (hepato-esteatosis) en animales de laboratorio, no sólo han aportado información relevante en la fisiopatología del HG no alcohólico (HGNA), sino también en relación al uso de agentes terapéuticos naturales²⁰⁾ y en el diseño de nuevos tratamientos de la esteato-hepatitis humana ¹².

En el hígado se producen todas las rutas metabólicas, con algunas excepciones, como la oxidación de los cuerpos cetónicos. La principal función del hígado es suministrar una fuente continua de energía, regulada por factores hormonales y nerviosos que modifican el flujo de combustibles en base a la demanda celular.

En condición absortiva, gran parte de los nutrientes que llegan por la circulación portal son metabolizados, distribuidos al resto de órganos o almacenados como reservas para ser movilizados posteriormente en condición post-absortiva¹⁴. La regulación de la glucemia es rigurosa en el organismo; constituye el principal combustible del cerebro, los eritrocitos y la médula suprarrenal.

El hígado ocupa un lugar central en la homeostasis de la glucosa¹³, por su capacidad de almacenarla como glucógeno en condición absortiva (glucogeno-génesis) y de producirla del glucógeno almacenado (glucógeno-lisis) o sintetizarla a partir de precursores no glucídicos (gluco-neogénesis), en condiciones de ayuno o ejercicio, como ser: el lactato obtenido de la oxidación de la glucosa en anaerobiosis, los aminoácidos glucogénicos provenientes de la proteólisis musculary del glicerol deriva­ do de las grasas almacenadas en el tejido adiposo.

Un nivel normal de glucosa es necesaria para el funcionamiento del sistema nervioso central, pues la utiliza como combustible, aún en el ayuno. Si éste es superior a 24 horas, el cerebro utiliza cuerpos cetónicos, con decremento de la demanda de glucosa y por consiguiente de la gluco-neo-génesis. La regulación de la síntesis y el transporte de los ácidos grasos a los tejidos es otra de las funciones del hígado, orientada hacia el mantenimiento de la homeostasis calórica ¹³.

En el hígado, el exceso de glucosa puede ser convertida a ácidos grasos, re-esterificados y transportados como lipoproteínas en la sangre para ser almacenados en territorios tisulares distantes, como el tejido adiposo, para su posterior utilización. La síntesis de ácidos grasos en el citosol del hepatocito está bajo el control de la insulina y de la disponibilidad de la acetil CoA proveniente del piruvato obtenido de la glucosa.

Está bien establecida la participación del hígado en la movilización sanguínea de los lípidos a los tejidos periféricos, así como su influencia en el metabolismo de los lípidos del organismo¹⁴.

Esta investigación se planteó con el objetivo de determinar la variación de los niveles plasmáticos de glucosa y triglicéridos en ratones IRMN adultos de ambos sexos con hígado graso experimental, inducido por DL-etionina.

Material y métodos

Animales, manejo. El estudio fue conducido de acuerdo al Código de Bioética y Bioseguridad de FO- NACIT-Venezuela, 2009. Se utilizaron ratones (Mus musculus) adultos hembras y machos, provenientes de la población de ratones de la cepa NMRI del Bioterio Central de la Universidad Centroccidental L.A. (UCLA).

Las hembras eran vírgenes, colocadas en un laboratorio diferente al de los machos, para evitar el efecto de las feromonas. Mediante muestreo aleatorio simple se seleccionaron 20 ratones adultos de cada sexo, cuyo peso corporal promedio fue de 27,5 ± 1,5 g, determina­ do en una balanza Ohaus para animales.

Fueron mantenidos en jaulas de acero inoxidable individuales, bajo ciclos de 12 horas luz/12 horas oscuridad, en las condiciones estandarizadas del Bioterio de la Unidad de Investigación en Ciencias Funcionales “Dr. H. Moussatché” (UNIHM) del Decanato de Ciencias Veterinarias (DCV), con libre acceso al agua y a un alimento comercial para ratones Ratarina® (Protinal, Venezuela).

Inducción de HG. Para cada sexo, los 20 animales se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos de 10 animales cada uno, un grupo control y otro tratado con DL-etionina (Sigma Chemical Co, MO, EUA.).

La DL-etionina fue disuelta en solución fisiológica estéril y administrada intraperitonealmente en dosis de 7,5 mg/20 g de peso corporal. A los controles se les inyectó i.p. sólo solución fisiológica estéril, vehículo de la DL-etionina. Todos los animales se sometieron a un ayuno de 48 horas con libre acceso al agua de bebida. Este protocolo inductor genera HG según hemos des­ crito anteriormente ¹¹.

Toma de muestras y análisis: Terminado el ayuno de 48 horas, se obtuvo una muestra de sangre de cada uno de los animales mediante venopunción coccígea. La sangre fue depositada en un tubo Eppendorf con anticoagulante (ácido etilendiamino tetra acético (EDTA)-Na al 2%). Los plasmas se separaron por centrifugación (800 g, 20 minutos) en micro-centrífuga refrigerada Eppendorf 5402 (Brinkman Instr., NY, EUA).

Obtenidos los plasmas se colocaron en baño de hielo y se les cuantificó la concentración de Gluc (en mg/dL) por el método de Trinder²³ mediante el kit comercial de Qualitest (Caracas, Venezuela) y la concentración de TG (en mg/dL) por método de Patton¹⁵, mediante el kit comercial Qualitest. En ambos casos se leyó la absorbancia a 510 nm en un espectrofotómetro Genesys 5 (Rochester, NY, EUA).

Una vez obtenida la muestra de sangre, a los anima­ les se les practicó la eutanasia bajo ligera anestesia con éter. Se disecó el hígado, se evaluó su aspecto macroscópico y se homogeneizó 1,5 g de hígado con 3 veces su peso en tampón Tris-sacarosa 250 mM pH 7,2 a (°C en un potter Bodine (Electric Comp, Chicago, EUA).

El sobrenadante del homogeneizado, diluido 1:40 con agua des-ionizada, se mantuvo refrigerado y se le cuantificó la concentración de TG (en mg de TG por mg de proteínas). La concentración de proteínas se de­ terminó mediante el kit Pierce (Rockford, ILL, EUA) basado en la técnica de Bradford ⁵.

Una pequeña porción de hígado fijado en formol tamponado al 10% se utilizó para su estudio histopatológico, realizado en el Laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital Veterinario “Dr. Humberto Ramírez Daza” del DCV-UCLA. Se obtuvieron secciones de (micras del tejido mediante el uso de un micrótomo Jung AG (Heidelberg, Alemania) y posterior tinción de los cortes con hematoxilina-eosina de acuerdo a la técnica convencional.

El análisis estadístico se realizó mediante el programa SPSS versión 17.0 para Windows. Los resulta­ dos se expresaron como el promedio de los valores ± error estándar (EE). Para establecer la significación estadística de los resultados se utilizó la prueba “t” de Student exigiéndose un 95% de certeza (p<0,05).

Resultados y discusión

En el hígado tienen lugar la mayoría de las rutas metabólicas y su normal funcionamiento asegura la homeostasis celular. Las lesiones hepáticas agudas o crónicas pueden alterar su capacidad biosintética y metabólica, lo cual inducirá diversos trastornos.

La principal función del hígado es suministrar una fuente continua de energía para el organismo y en este sentido los carbohidratos y lípidos tienen un papel relevante. Dicha función es regulada por factores hormonales y nerviosos, que modifican el flujo de combustibles de acuerdo a la demanda celular.

En el presente estudio, el HG experimental afectó a los parámetros plasmáticos estudiados en diferente forma según el sexo. Así, en los machos, los niveles plasmáticos de TG y de glucosa no resultaron alterados por el tratamiento con DL-etionina.

Sin embargo, en las hembras, la inducción de HG disminuía significativamente (p<0,01) los TG plasmáticos (Figura 1), mientras que aumentaba los niveles de Gluc plasmática (p<0,05) (Figura 2). Este efecto podría ser debido a una posible resistencia a la insulina en dichos animales, anormalidad clave en el HG ¹⁷.

El disminuido nivel de la insulina en vacas lecheras contribuye a la regulación metabólica de adaptación (homeorresis), orientando a los nutrientes, particularmente a la Gluc, hacia territorios tisulares menos sensibles a la acción de la insulina, entre ellos la placenta y la glándula mamaria en lactación ⁷.

La disminución de la Gluc plasmática dependiente de la liberación de insulina posprandial es un hallazgo importante para comprender la disminuida acción de la insulina después del parto en vacas lecheras ²⁵.

La hiperglicemia e hiperinsulinemia inducen la síntesis de ácidos grasos libres (AGL) a partir de Gluc, así como la inhibición de la b-oxidación de AGL, cuyo exceso se transforma a TG que se acumulan en el hígado con disminuida secreción hepática de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) ²⁰. En los machos no se modificó el nivel de TG circulantes lo que respondería a la glicemia normal que mostraron.

En el metabolismo lipídico, normalmente los AGL circulan entre el hígado y el tejido adiposo periférico sin que se produzca ninguna acumulación apreciable en los hepatocitos ¹⁸ . En este sentido, dos son las vertientes principales de AGL hacia el hígado. Una proviene de la hidrólisis de los TG contenidos en los adipocitos mediante la acción de la lipasa sensible a hormonas. La otra vía la constituye la hidrólisis de los quilomicrones en los tejidos periféricos por efecto de la lipasa lipoproteica.

Otro proceso generador de AGL es su propia síntesis en el hepatocito, especialmente en condiciones de exceso de Gluc dietaria, que por vía lipogénica forma AGL, que al esterificarse con glicerol-3P, se orientan hacia el depósito de TG ¹⁶.

Los eventos metabólicos descritos son aplicables a la movilización de reservas lipídicas, particularmente desde el tejido adiposo, necesarias para satisfacer las demandas energéticas de la lactancia en vacas. El exceso de lípidos movilizados se acumula en las células del hígado en forma de TG con instauración de un HGNA ¹³.

En el presente estudio, el grupo control de los machos mostró una concentración de TG hepáticos (0,69±0,05 mg TG/mg proteínas) significativamente mayor (p<0,001 que el valor control de los ratones hembras (0,18±0,01 mg TG/mg proteínas) (Figura 3).

Este resultado es concordante con quienes, estudiando los niveles normales de TG hepáticos en nueve cepas diferentes de ratones machos y hembras ¹⁰, observaron un amplio rango de variación, desde 49,7±5,5 mg TG/g proteínas presentado por la cepa SWR (antecesora de la NMRI) hasta 316,5±25,8 mg TG/g proteínas en la cepa BALB/cByJ. Los autores indican que, en todas las cepas, los ratones machos mostraron niveles superiores de TG hepáticos que las hembras.

Nuestros resultados muestran que el tratamiento con DL-etionina aumenta la concentración de triglicéridos hepáticos de forma estadísticamente significativa (p<0,001) tanto en los ratones machos como en las hembras (Figura 3).

De forma coincidente, se ha descrito ampliamente la presencia de una elevada concentración de TG hepático en variadas condiciones inductoras de HGNA. Entre ellas, la administración i.p. de CCl4 puro, en dosis única de 0,2 ml/kg de peso, causa en ratas machos albinas Wistar un aumento significativo del contenido intrahepático de triglicéridos ¹.

De igual manera, una dieta deficiente en metionina y colina, administrada durante cuatro semanas a ratones machos genéticamente obesos (db/db), de seis semanas de edad, duplica la concentración de TG en el hígado con respecto al nivel inicial²⁶. También la administración durante cuatro semanas de una dieta con alto contenido graso, induce en ratas machos Sprague Dawley, un exacerbado depósito de TG en los hepatocitos ⁹.

En el presente estudio se observó que las concentraciones de TG hepático en ratones machos con HG son mucho mayores que en las hembras con HG (p<0,001). Sin embargo, estudios realizados en ratas²² mostraron una mayor acumulación de TG hepáticos en las hembras que en los machos, efecto que atribuyeron a diferencias en la biosíntesis de la fosfatidil-colina en el hígado de las ratas.

En el hepatocito, los cuerpos lipídicos no son al­ macenajes estáticos de grasa, sino que poseen un metabolismo muy activo y una composición que recuerda a la de una lipoproteína^2,19 . Los TG son los principales involucrados en este depósito hepático ⁸, hecho plenamente coincidente con los resultados del presente estudio, en el cual la concentración de TG hepáticos se mostró aumentada significativamente en los ratones machos y hembras con HG, en relación a sus respectivos controles.

Estos resultados corroboran los hallazgos histológicos observados en la hepatoesteatosis micróscopica (Figura 4). Así, en el hígado de ratones machos y hembras se observaron vacuolas lipídicas en el citoplasma de los hepatocitos, siendo la metamorfosis grasa hepática severa en las hembras y moderada en los machos.

A la luz de la evidencia acumulada, con respecto al depósito lipídico en el hígado, autores ⁴ han expresado que la síntesis de TG es el resultado de una adaptación fisiológica ante condiciones agresivas enfrentadas por los hepatocitos. Así, la acumulación grasa en muchos casos no es dañina, sino que más bien es protectora, porque es la respuesta a un consumo calórico aumen­ tado.

Los resultados obtenidos en el presente estudio hablarían en favor a esta aseveración, puesto que los ratones machos con HG por DL-etionina mostraron un daño histológico moderado a diferencia de las hembras con HG cuya metamorfosis grasa hepática fue severa, acompañada con un depósito de TG en el hígado notablemente menor que la observada en los machos con HG.

Como conclusión, la inducción de HG por acción de la DL-etionina afectó los parámetros plasmáticos estudiados en forma diferente en machos y hembras, quizás debido a variables adaptativas ante el hígado graso, propias de cada sexo.