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INTRODUCCIÓN
La diabetes es un grupo de trastornos que presentan la ausencia relativa o absoluta de insulina, y se caracteriza por hiperglucemia.1 Debido a esta condición, los glóbulos rojos (GR) son modificados químicamente por efecto de la glicación,2 la cual produce una disminución de la carga eléctrica superficial negativa.3 En consecuencia, la glicación de los GR por efecto de la hiperglucemia disminuye la repulsión electrostática, favoreciendo la agregación eritrocitaria y alterando sus parámetros hemorreológicos.4,5
Por otra parte, se ha observado que las técnicas anestésicas pueden afectar los parámetros hemorreológicos y hemostáticos.6,7 Los anestésicos aplicados por vía intravenosa más usuales consisten en una combinación de los anestésicos propofol, remifentanilo y bromuro de vecuronio.8 El propofol es un agente hipnótico de corta duración y rápida recuperación anestésica. El remifentanilo se emplea como analgésico, y para ayudar a la inducción y mantenimiento de la anestesia general. El bromuro de vecuronio es un bloqueador neuromuscular que no afecta el potencial de membrana.9
Estudios realizados por Alet et al.10,11 en muestras de sangre de pacientes diabéticos tratadas in vitro con propofol describen alteraciones hemorreológicas al comparar con los valores correspondientes a muestras de dadores sanos. Asociado a esto se encontraron alteraciones en la agregación eritrocitaria, debidas probablemente a alteraciones de la carga eléctrica superficial y, en menor grado, de la bicapa lipídica. Además, Batista da Silva et al.12 encontraron que el propofol puede alterar las propiedades viscoelásticas dinámicas de la membrana del GR.
Dado que los pacientes diabéticos presentan alteraciones hemorreológicas de base, el uso de anestésicos podría agravarlas. Por ese motivo la detección y cuantificación de dichas alteraciones antes de una cirugía, es de gran importancia para poder tomar medidas preventivas y obtener el máximo beneficio para el paciente.
El objetivo de este trabajo fue realizar un estudio preliminar de los efectos de agentes anestésicos (propofol, remifentanilo y bromuro de vecuronio) en GR glicados in vitro simulando el estado de hiperglucemia in vivo. El estudio se realizó utilizando técnicas ópticas de difractometría láser y de transmisión láser para determinar parámetros viscoelásticos y de cinética de agregación eritrocitaria.
MÉTODOS
Muestras biológicas
Se utilizaron muestras de sangre de dadores sanos (
) obtenidas por punción venosa y anticoaguladas con EDTA. Posterior a la extracción, los GR se lavaron dos veces con buffer fosfato salino (PBS: 300 mOsM, pH = 7.4), y se reservó el plasma para uso posterior. La extracción y el procesamiento de las muestras se realizó según las recomendaciones del panel de expertos en Hemorreología del Consejo Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH).13
Glicación in vitro
La glicación no enzimática in vitro difiere de la glicación in vivo, particularmente por los cambios fisiológicos, el consumo de glucosa y la continua renovación de las células sanguíneas que ocurre en el cuerpo humano. Por tal motivo, a fin de modelizar in vitro la glicación que se produce in vivo en la diabetes, se han propuesto diversas técnicas que utilizan distintas concentraciones de glucosa y en las cuales el tiempo de incubación puede variar desde minutos hasta días.14-17 En nuestro grupo de investigación se han realizado ensayos poniendo a punto diversos protocolos en los cuales se analizó el grado de glicación, y las alteraciones bioquímicas y hemorreológicas de las muestras incubadas con soluciones de glucosa.18-22
Teniendo en cuenta las experiencias previas y las condiciones del presente experimento, se estableció como condición óptima la incubación de volúmenes iguales de GR con una solución de glucosa 0.5% p/v (equivalente a una glicemia de 250 mg/dL), adicionada con albúmina sérica humana 0.5% v/v en PBS, durante 5 horas a 37 ∘ C con agitación constante. Luego de que los GR fueron incubados, se lavaron dos veces con PBS. La muestra control (C) consistió en una alícuota de la misma muestra de sangre, pero utilizando solo PBS durante la incubación.
Tratamiento con anestésicos
Los anestésicos utilizados para la incubación fueron:
P: propofol (Propofol Gray( 10 mg/mL, DR. GREY, Buenos Aires, Argentina).
R: remifentanilo (5 mg - Fresenius Kabi, L: 76KL521041. Martínez, Buenos Aires - Argentina).
V: bromuro de vecuronio (Scott Cassara - 10 mg).
Los anestésicos fueron diluidos en forma seriada hasta llegar a la concentración de trabajo en solución fisiológica. Para realizar el tratamiento in vitro, los GR glicados y sin glicar se suspendieron en plasma autólogo al 40%, y se incubaron por partes iguales con la solución del anestésico correspondiente en PBS, siendo la concentración final de incubación la presentada en steady-state durante una cirugía:
El esquema de incubación consistió en muestras glicadas y sin glicar, tratadas con cada anestésico por separado (P, R y V) y sus combinaciones (PR, PV y RV) y los respectivos controles. La incubación se realizó en estufa a 37 ∘ C durante 30 minutos bajo agitación suave y constante. Luego, las muestras fueron centrifugadas a 533 RCF y los GR se lavaron dos veces con PBS. Los GR lavados de cada muestra fueron suspendidos al 40% en plasma autólogo.
Parámetros viscoelásticos
Para observar los posibles efectos de los anestésicos en los GR glicados analizamos los parámetros hemorreológicos utilizando el Reómetro Eritrocitario23,24 (Patente AR 091467 A1, 2013). Este instrumento se basa en la técnica de difractometría láser y permite obtener los siguientes parámetros viscoelásticos de los GR en estudio:25
ID: índice de deformabilidad.
: módulo elástico de la membrana del GR.
: viscosidad superficial de la membrana del GR.
Para cada tratamiento los datos fueron obtenidos por quintuplicado.
Parámetros de agregación
Se estudió la cinética de agregación de los GR utilizando el Agregómetro de Chip Óptico26,27 también desarrollado en nuestro grupo de investigación y basado en la técnica de transmisión láser. Mediante el análisis de las curvas obtenidas es posible calcular los siguientes parámetros de agregación eritrocitaria:
RESULTADOS
En la Tabla 1 se presentan los valores medios de los parámetros viscoelásticos de los GR controles, glicados, y tratados con los diferentes anestésicos, solos y en combinación. En la Tabla 2 se presentan los parámetros de cinética de agregación t 1/2 y la Amp 1/2 normalizados al control correspondiente, para las muestras sin glicar y para las muestras glicadas. Todos los resultados son presentados como Media ± SD.
TABLA 1: Parámetros Viscoelásticos de GR de muestras glicadas y no glicadas incubadas con los anestésicos. DND: dato no determinado. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001.
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
En la Tabla 1 se observa que los valores de aumentaron significativamente en las muestras no glicadas tratadas con PR y PV (
; 
). También se observó un aumento de para las muestras glicadas tratadas con V (). Por el contrario, el tratamiento con R disminuyó levemente la viscosidad en los GR de las muestras no glicadas ().
En los GR no glicados el 
disminuyó para los tratados con R y RV () indicando una disminución en la rigidez de la membrana eritrocitaria por la acción de dichos anestésicos. En cambio, se observó un aumento de 
debido al tratamiento con P y PR (
; ). Para los GR glicados no hubo variaciones significativas de , indicando un posible efecto protector de la glucosa a la concentración utilizada.
Los valores de ID estuvieron aumentados significativamente para los GR no glicados y glicados tratados con R y RV (). En cambio, el P presentó una leve disminución del ID la cual fue significativa solo para las muestras glicadas ().
La Tabla 2 presenta los resultados obtenidos de los parámetros de cinética de agregación. El t de los GR no glicados presentaron un aumento significativo para los tratamientos con P y R (; ) y una disminución significativa para los tratados con PR y PV (), indicando que los anestésicos modificarían la velocidad de agregación de los GR. Por otro lado, la Amp presentó un aumento significativo solo para las mezclas PR y PV ().
Los GR glicados tratados con P, R y PR mostraron una disminución significativa en el t (). La Amp también presentó un aumento significativo para los GR glicados tratados con P, R y PR ().
CONCLUSIÓN
Los resultados obtenidos muestran que los anestésicos podrían afectar los parámetros viscoelásticos de GR glicados de diferentes maneras. Se observan alteraciones similares a las encontradas previamente por Alet et al.11 por la acción del P. El estudio sobre los anestésicos V y R también mostraron alteraciones significativas de la viscosidad superficial de membrana, del módulo elástico y del ID. Este resultado es de importancia dado que Lupton et al.8 señalan que esos anestésicos junto con el propofol forman la combinación más utilizada en procedimientos quirúrgicos. Los resultados obtenidos con el agregómetro de chip óptico también mostraron alteraciones significativas por efecto de los anestésicos en los GR incubados con la concentración de glucosa equivalente a una glicemia de 250 mg/dL.
Si bien este es un estudio preliminar, los resultados obtenidos son una importante contribución para la evaluación de la prevención de complicaciones en procedimientos quirúrgicos.
