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I. INTRODUCCIÓN
Los concentrados de glóbulos rojos son el componente que se emplea en forma más frecuente en las transfusiones sanguíneas. La irradiación gamma de la unidad transfusional está indicada cuando un paciente corre el riesgo de desarrollar la enfermedad de injerto contra huésped asociada a una transfusión (EICH o TA-GVHD), especialmente en pacientes pediátricos o inmunosuprimidos .1
La EICH ocurre debido a que las células del sistema inmune del donante (injerto) reconocen a las células y los tejidos normales del paciente (huésped) como extraños y los atacan. La gravedad radica en que puede producir daño en el hígado, la piel, las mucosas y el tracto gastrointestinal. Para la prevención de la EICH se debe disminuir la capacidad funcional y de reproducción de los linfocitos T exponiendo las unidades de sangre a radiación gamma con dosis que van de 25 a 50 Gy . También se suele utilizar rayos X en las mismas dosis, pero hasta el momento no se ha demostrado que tengan la misma efectividad.
Si bien estas dosis de radiación gamma permiten desactivar los linfocitos T, se ha observado que incrementan la lesión debido al almacenamiento en los concentrados de glóbulos rojos, aumentando los niveles plasmáticos de potasio y disminuyendo los de sodio . La bomba de Na+/K+ desempeña un papel muy importante en el mantenimiento del volumen celular, iguala la presión osmótica a ambos lados de la membrana y mantiene el potencial de membrana. Se ha visto, además, que la irradiación promueve la generación de especies reactivas del oxígeno y la peroxidación de lípidos de la membrana de los glóbulos rojos , incrementa la permeabilidad de la membrana eritrocitaria al potasio, sodio y hemoglobina, y disminuye su deformabilidad . Todos estos efectos sobre los glóbulos rojos reducen la viabilidad transfusional de las unidades irradiadas almacenadas disminuyendo su viabilidad de 42 a 28 días .
El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de diferentes dosis de radiación sobre la concentración de iones plasmáticos en las bolsas irradiadas, los cuales son indicativos de posibles alteraciones de las membranas de los glóbulos rojos y de los leucocitos.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico
Se utilizaron 2 unidades de concentrados de glóbulos rojos de voluntarios adultos sanos almacenados en bolsas de cloruro de polivinilo que contenían citrato-fosfato-dextrosa-adenina (CPDA) como conservante. Cada unidad de sangre se dividió en 6 alícuotas de concentrados de glóbulos rojos (almacenados a 4°C). El plasma sin irradiar fue centrifugado a 3500 rpm por 6 min (Centrífuga PresVac DCA-300RVT, rotor R12/15), fraccionado en condiciones de esterilidad bajo campana de flujo laminar y almacenado en frízer a -20°C.
Irradiación del material biológico
De las 6 bolsas de concentrado de glóbulos rojos de cada donante, una fue preservada sin irradiar como control (0 Gy), y las otras fueron irradiadas a las 24 horas de la extracción con dosis de 2, 5, 10, 15 y 25 Gy utilizando un irradiador Biobeam GM 8000. Cada bolsa se irradió independientemente, ubicándola en el interior del irradiador de tal forma que hubiese homogeneidad de dosis de acuerdo a los datos provistos por el fabricante. Luego, todas las bolsas se almacenaron a 4°C durante 35 días.
Extracción de las muestras
Cada día de medición se procedió a extraer de cada bolsa la alícuota de concentrado de glóbulos rojos a ser utilizada para las experiencias. Se tomaron muestras a los 0, 2, 7, 9, 14, 16, 21, 23, 28, 30 y 35 días post-irradiación. El plasma congelado necesario para las experiencias se retiró de -20°C el mismo día de medición, y se descongeló a 37°C hasta llegar a temperatura ambiente.
Determinación de la concentración de iones
Se realizaron determinaciones de la concentración de iones Na+ y K+ en el sobrenadante de cada muestra cada tres días durante los 35 días. Las determinaciones se realizaron con un equipo ion-selectivo (Diestro-103) según indicaciones del fabricante.
Determinaciones complementarias
Se evaluó el contenido de glucosa plasmática por medio de la técnica enzimática GOD-PAP con autoanalizador (Biosys-tems A25), el recuento de leucocitos y el volumen corpuscular medio (VCM) con un contador hematológico (Sysmex XN350).
Extendidos y análisis microscópico
Las muestras se prepararon para su observación en el microscopio realizando un extendido a partir de la fracción obtenida de cada bolsa en el Centro Regional de Hemoterapia el día correspondiente. El extendido se dejó secar al aire y posteriormente se realizó la tinción de May Grumwald Giemsa. Los preparados se observaron en microscopio directo, utilizando objetivo de inmersión 100X y las imágenes fueron digitalizadas y almacenadas para su análisis.
Análisis estadísticos
Se empleó el programa GraphPad Prism 9 para analizar los datos mediante Two-way ANOVA y regresión lineal simple con prueba de diferencia de pendiente y ordenada al origen estableciendo si las diferencias son significativas. Además, las curvas se ajustaron por decaimiento de una fase y ajuste de meseta exponencial.
III. RESULTADOS
En la Fig 1 se presenta la variación con el tiempo de almacenamiento de la concentración de glucosa en el medio de suspensión para las distintas dosis de radiación analizadas. Estos resultados muestran que a medida que aumentó el tiempo de almacenamiento, la concentración de glucosa disminuyó, independientemente de la dosis de radiación. Estos resultados indicarían que el consumo de la glucosa presente en el medio de conservación no es alterado por la irradiación.
FIG. 1: Concentración de glucosa en el medio de suspensión. El error correspondiente al parámetro medido es del 2 %.
En la Fig.se presenta la gráfica de la variación con el tiempo de conservación de la concentración de sodio y potasio en el medio de suspensión para las distintas dosis estudiadas.
FIG. 2: Concentración de sodio (azul) y potasio (rojo) en el medio de suspensión. El error correspondiente al parámetro medido es del 2%.
Se observa una disminución del contenido de sodio y un aumento de la concentración de potasio en el sobrenadante. Esto se debe a que a medida que se consumía la glucosa disponible en el medio de conservación, la eficiencia de la bomba Na-K-ATPasa disminuía. Se observa que esta disminución en la eficiencia fue mayor para mayores dosis de radiación.
Por lo tanto, los resultados sugieren que existe un aumento de la permeabilidad de la membrana de los glóbulos rojos con dosis de radiación superiores a 2 Gy.
FIG. 3: Volumen corpuscular medio de los glóbulos rojos en función de los días de almacenamiento y las dosis de irradiación. El error correspondiente al parámetro medido es del 2 %.
En la Fig.se puede observar que el volumen corpuscular medio (VCM) aumentó significativamente con la dosis de radiación después de 20 días de almacenamiento, lo que corrobora que la radiación gamma aumenta la permeabilidad de la membrana de los eritrocitos.
FIG. 4: Recuento de glóbulos blancos en función de los días de almacenamiento y las dosis de irradiación. El error correspondiente al parámetro medido es del 2 %.
En la Fig.se representa el número de leucocitos remanentes donde se observa la disminución con los días de almacenamiento, independientemente de la dosis de radiación.
El análisis microscópico de las fotografías de las muestras presentadas en la Fig.y tomadas a los 2 y 14 días postirradiación (2 dpi y 14 dpi), indican que, si bien la radiación no ha disminuido el número de los leucocitos (elementos nucleados de las fotos), estos han perdido su estructura celular normal.
FIG. 5: Imágenes microscópicas de las muestras almacenadas registradas a los 2 y 14 días post-irradiación (2 dpi y 14 dpi) donde se observan las alteraciones morfológicas de los glóbulos blancos (células nucleadas) debido a las distintas dosis de radiación ensayadas.
IV. CONCLUSIONES
El análisis de los resultados de este trabajo permite concluir que la dosis de radiación no afecta el consumo de glucosa. Sin embargo, la permeabilidad de la membrana de los eritrocitos aumenta con la radiación, indicando que este tipo de alteraciones podrían ser dosis dependiente. Los resultados de este trabajo contribuirían a la optimización y diseño de nuevos protocolos y a la evaluación de nuevos aditivos para los medios de conservación a fin de reducir el daño en la membrana eritrocitaria inducido por la radiación, tal como se ha sugerido en otras publicaciones .
