Inoculación con Azospirillum spp. en la Región Semiárida-Central de Argentina: factores que afectan la colonización rizosférica

Adriana Abril¹; Carlos Biasutti²; Ricardo Maich³; Lucas Dubbini¹ & Laura Noe¹

¹Microbiología Agrícola. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Córdoba. cc 509, 5000, Córdoba. Argentina. e-mail: aabril@agro.uncor.edu. (autor responsable)
²Mejoramiento Vegetal. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Córdoba. Argentina. cc 509, 5000, Córdoba. Argentina. e-mail: cbiasutti@agro.uncor.edu
³Genética. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Córdoba. Argentina. cc 509, 5000, Córdoba. Argentina. e-mail: rmaich@agro.uncor.edu

Recibido: 29/1/05
Aceptado: 30/06/06

RESUMEN
La efectividad de la inoculación con Azospirillum spp. en condiciones de campo a menudo es poco consistente. La colonización de la rizosfera por las bacterias del inoculante es un prerrequisito para el éxito de la inoculación. El objetivo de este trabajo fue evaluar el grado de colonización de raíces en 11 ensayos de campo con diferentes tratamientos (localidades, cepas, cultivos, cultivares, etc.) en la Región semiárida central de la Argentina. Todos los ensayos se realizaron con similar diseño experimental y metodología de análisis para permitir su comparación. El grado de colonización mostró alta variabilidad entre los casos analizados (CV 173%, rango: -18 a >100%). Sólo 11 de los 32 casos analizados presentaron diferencias significativas entre el tratamiento inoculado y el control. No se detectó un patrón definido que permita explicar la alta heterogeneidad de los resultados, sin embargo, se podría especular, que los principales factores que pueden haber afectado el grado de colonización son: el estrés hídrico y el origen de las cepas del inoculante. Bajo condiciones de estrés puede existir una fuerte competencia entre las poblaciones rizosféricas, situación en la cual, las cepas nativas tienen ventaja por su mayor adaptación al medio.

Palabras clave. Condiciones de campo; PGPR; Fijación de N₂; Cepas nativas.

Inoculation with Azospirillum spp. in the semiarid-central region of Argentina: factors involved in rhizosphere colonization

ABSTRACT
The effectivity of inoculation with Azospirillum spp. often lacks consistency under field conditions. Microbial colonization of the rhizosphere is considered a prerequisite for successful inoculation. The objective of this study was to determine the degree of rhizosphere colonization in 11 field inoculation assays under different treatments (sites, crops, strains, cultivars, etc.) performed in the semiarid central region of Argentina in the last 15 years, conforming a total of 32 study cases. For comparative purposes, all the assays were performed following the same experimental design and inoculation and analytic methods. Variation results relative to control treatment were clustered according to each assay characteristic. Colonization degree measurements showed high variation among different cases studied (CV 173%, range: -18 to >100%). In 11 situations, measurements differed significantly from results obtained in the control treatment. No defined pattern that could explain the highly heterogenic results was found. However, it could be speculated that water stress and strain of origin would be the principal factors responsible for the variation observed in rhizosphere colonization by Azospirillum spp. Plant carrying capacity may decrease under stress conditions, promoting microbial competition in the rhizosphere, where native strains appear to take advantage due to their higher adaptation capacity.

Key words. Field conditions; PGPR; N₂ fixation; Water stress; Native strains.

INTRODUCCIÓN

   Es bien conocido que las bacterias rizosféricas tienen un efecto benéfico para el crecimiento de las plantas (Döbereiner 1992; Baldani et al.,1997; Mantelin & Touraine, 2004). Por ese motivo las rizobacterias han sido ampliamente difundidas como alternativa para reducir el uso de agroquímicos (fertilizantes y biocidas) con la finalidad de disminuir costos y contaminación ambiental y preservar la salud humana (Dobbelaere et al.,2002; Roy et al.,2002; Kozdroj et al.,2004) .

   La respuesta de las plantas a la inoculación con bacterias rizosféricas promotoras de crecimiento vegetal (PGPR) es un fenómeno muy complejo que resulta de la combinación de mecanismos que afectan varios aspectos de la nutrición mineral, el metabolismo del carbono y el desarrollo radicular de las plantas (El-Komy et al.,2003; Mantelin & Touraine, 2004). Los beneficios de la inoculación con Azospirillum spp. han sido demostrados en numerosas oportunidades, sin embargo la respuesta en condiciones de campo a menudo es poco consistente (Schulze & Pöschel, 2004; Kozdroj et al.,2004). Por tal motivo, la inoculación con Azospirillum spp. está asociada a resultados impredecibles e inconstantes (Bacilio-Jiménez et al., 2001; Kaushik et al., 2002; Saubidet et al., 2002), lo que ha restringido el desarrollo comercial de inoculantes a gran escala (Dobbelaere et al.,2002; Kozdroj et al.,2004).

   El productor agropecuario que inocula con bacterias rizosféricas espera resultados equivalentes a los obtenidos con la inoculación de leguminosas con rizobios. Sin embargo, existen marcadas diferencias entre ambos microorganismos que se relacionan con el grado de interacción con la planta. A diferencia de las bacterias simbióticas que se encuentran dentro de la raíz, la colonización por organismos rizosféricos está fuertemente afectada por las condiciones de medio ambiente edáfico (Saubidet et al., 2002; Dobbelaere et al., 2002; Reis Jr. et al., 2004), lo que podría ser la causa de los resultados contradictorios y variables encontrados en inoculaciones realizadas en condiciones de campo.

    Numerosos trabajos analizan los efectos de la inoculación con Azospirillum spp. a campo sobre el contenido de nutrientes y el rendimiento de los cultivos (Fulchieri & Frioni, 1994; Bhattarai, 1999; Dobbelaere et al.,2002). Schulze & Pöschel (2004) afirman que un prerrequisito indispensable para el éxito de la inoculación es la proliferación de las bacterias en la rizosfera. Generalmente, los trabajos sobre colonización se han realizado en condiciones controladas y en sistemas gnotobióticos donde una sola cepa de bacterias interactúa con la planta hospedadora (Mantelin & Touraine, 2004). Son muy escasas las referencias sobre sobrevivencia y colonización de Azospirillum spp. inoculados en condiciones de campo (Fulchieri & Frioni, 1994; Basham et al.,1995; Kopp & Abril, 1997).

   Las condiciones ambientales (suelo, clima, fertilización, etc.) y las características de los microorganismos nativos e introducidos son factores determinantes para la sobrevivencia y actividad en la rizosfera (Bacilio- Jiménez et al.,2001; Chotte et al.,2002; Kaushik et al.,2002; Tsagou et al.,2003; Kozdroj et al.,2004). Sin embargo, un estudio realizado sobre colonización rizosférica por Pseudomonas chlororaphis mejorada genéticamente e introducida con fines de control biológico, demostró que no es posible predecir con exactitud la sobrevivencia en la rizosfera mediante un modelo que incluye características de suelo y abundancia de microorganismos nativos (Edge & Wyndham, 2002).

   Los conceptos de dinámica de población que se aplican comúnmente en organismos superiores han sido escasamente considerados para el análisis de microorganismos (Beeby, 1993). Bajo esta perspectiva, sería de suma utilidad evaluar la tasa de sobrevivencia específica y la existencia de capacidad de carga de las plantas para comprender la respuesta de la inoculación a campo con Azospirillum spp. El mejor entendimiento de los parámetros que regulan la colonización de la raíz puede ayudar a mejorar la eficacia de los inoculantes bajo variadas condiciones ambientales y estimular la aplicación a gran escala en el campo (Dobbelaere et al.,2002).

   El objetivo de este trabajo fue evaluar las variaciones en el grado de colonización de raíces de plantas inoculadas con Azospirillum spp. en diferentes cultivos de la región central de la Argentina, con la finalidad de establecer si existe un patrón en la dinámica de las poblaciones introducidas que permita explicar las respuestas poco consistentes a nivel de campo.

MATERIALES Y MÉTODOS

   Se procesaron resultados obtenidos en 11 ensayos de campo realizados durante los últimos 15 años en suelos de la Región semiárida central de la Argentina, con diferentes tratamientos de inoculación con Azosprillum spp. (cultivos, cepas, cultivares, etc), constituyendo 32 casos de análisis (Tabla 1).

Tabla 1. Características de los sitios y tratamientos de los ensayos analizados. (1) ver sección Materiales y Métodos.
Table 1. Characteristics of the sites and treatments of analyzed trials. (1) see Materials and Methods section.

   Se compararon ensayos que fueron realizados con igual metodología en relación a técnica de inoculación, diseño de muestreo y métodos analíticos. En todos los casos las semillas se inocularon con un cultivo de Azospirillum spp. en fase exponencial con aproximadamente 10⁸ bacterias mL^-1. El medio de cultivo utilizado fue NFb líquido con ClNH4 (0,25%) como fuente de N. La dosis aplicada varió en función del tamaño de la semilla (entre 25 y 50 mL por kg de semilla) para garantizar al menos 104 bacterias por semilla. El inóculo fue diluído en una solución al 10% de sucrosa para permitir una distribución homogénea sobre las semillas (Kaushik et al., 2002). En el caso de la inoculación de pasturas nativas se siguió la técnica utilizada por Zaadi et al.,(1992): regar las parcelas con el inóculo diluído en solución buffer fosfato (200 mL en 5L). La cantidad de solución utilizada garantizó 2 x 10¹⁰ bacterias por m².

   Todos los ensayos se realizaron con un tratamiento control sin inocular. En todos los casos se colectaron cinco plantas por tratamiento al 50% de floración de los cultivos. Las raíces de las plantas fueron cuidadosamente lavadas en agua corriente y se realizó el conteo de bacterias de la zona rizosférica mediante las técnicas de recuento tradicionales descriptas por Döbereiner (1995). Se suspendieron 2 g de raíces lavadas en 100 mL de solución salina (ClNa 9‰) y se realizaron diluciones decimales seriales hasta 10^-7. De cada dilución se extrajo 1 mL que fue inoculado en frascos conteniendo 10 mL de medio de cultivo semisólido LGI sin N. Se consideró crecimiento positivo a la formación de una película típica subsuperficial en el medio después de 7 días de incubación a 30 °C. La población de bacterias fue estimada por el método del Número Más Probable (NMP) mediante la tabla de McCrady con tres réplicas por dilución (Reis Jr. et al., 2004). La metodología utilizada no permite afirmar que las bacterias contadas pertenezcan al género Azospirillum, por lo que los resultados expresan el número de bacterias fijadoras de N₂ en microaerofilia presentes en suelo rizosférico.

Análisis de datos

    Para poder comparar el grado de colonización en los diferentes ensayos se calcularon los porcentajes de variación entre los tratamientos inoculados y los control en cada caso analizado. Para investigar las asociaciones entre ensayos y casos, los porcentajes de variación fueron sometidos a un análisis de conglomerados utilizándose el método de encadenamiento promedio o UPGMA (Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Averages) (Dillon et al.,1984).

   Para analizar el efecto de los diferentes factores que pueden afectar la colonización (clima, cultivos, cepa, etc.), los resultados se agruparon según las características de los ensayos. Las agrupaciones realizadas fueron por: a) época de cultivo: invierno y verano; b) tipo de cultivo: trigo, maíz y pasturas; c) cultivares dentro de un mismo ensayo; d) diferentes años para un mismo cultivo; y e) origen de la cepa utilizada como inoculante: provistas por el Banco de Cepas del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), provistas por el Banco de Cepas de la Universidad Nacional de Río Cuarto (UNRC), inoculantes comerciales (IC) y aisladas de regiones semiáridas en el Laboratorio de Microbiología Agrícola de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Nacional de Córdoba (FCA). No se realizaron agrupaciones por tipo de suelos, debido a que los suelos de las zonas de los ensayos son muy similares (Moscatelli, 1990) (Tabla 1).

    El procesamiento estadístico de los datos dentro de cada agrupamiento se realizó mediante análisis de varianza (ANOVA), transformando los porcentajes utilizando la función La comparación de medias se realizó mediante la prueba de LSD protegido (P< 0,05). Se realizaron correlaciones entre el porcentaje de variación en la colonización y el contenido de materia orgánica del suelo y el número absoluto de bacterias en la rizosfera del tratamiento control (INFOSTAT).

RESULTADOS

    La cantidad de bacterias fijadoras de N₂ en micro-aerofilia colonizando la rizosfera varió entre 0 y log 7,3 g^-1 de raíz en los cultivos inoculados y entre 0 y log 5,4 g^-1 en las plantas del control (Tabla 2). El grado de colonización en los tratamientos inoculados presentó diferencias significativas respecto a los testigos, en 11 de los 32 casos analizados (34%) (Tabla 2). El porcentaje de variación fue altamente variable en el conjunto de casos (CV 173%). Se detectaron valores mayores al 100% en el ensayo con diferentes cultivares de trigo en el sitio Campo Escuela durante el año 2003. El análisis de conglomerados distinguió claramente un grupo formado por las diferencias obtenidas en cultivo de maíz durante la campaña 2003-2004 inoculado con cepas nativas y los cultivares de ciclo corto de trigo, del resto de los casos (Fig. 1).

Tabla 2. Abundancia [log N° de bacterias (g raiz)-1] de bacterias fijadoras de N₂ en microaerofilia en la rizosfera en los casos analizados y la variación (%) entre los tratamientos inoculados y control. * diferencia significativa (P< 0,05).
Table 2. Abundance [log number of bacteria (g root)^-1] of N₂ fixing microaerobic bacteria in the rhizosphere of analyzed cases and variability (%) between inoculated and control treatments. * Significant difference (P<0.05).

Figura 1: Dendrograma de asociacion de los diferentes ensayos y casos analizados, basado en la variabilidad entre tratamientos inoculados con Azospirillum spp. y controles sin inocular.
Figure 1. Dendrogram showing the associations of different trials and cases based on the variability between inoculated and control treatments.

   La variación en el grado de colonización entre cultivos de verano e invierno no presentó diferencias significativas (Fig. 2 a), al igual que entre diferentes tipos de cultivo (trigo, maíz y pasturas) (Fig. 2 b). La colonización obtenida con las diferentes cepas utilizadas en la inoculación tampoco mostró diferencias significativas (Fig. 2 c).

Figura 2. Variaciones en el grado de colonización de la rizosfera en cultivos inoculados con Azospirillum spp. agrupados según las características de los ensayos: a) época de cultivo (invierno, verano), b) tipo de cultivo (trigo, maíz, pasturas); c) origen de la cepa utilizada (comercial, INTA, UNRC, nativas); d) cultivares de trigo en un mismo ensayo (M: FCA3, KE: Klein Don Enrique, II: Pro INTA Imperial, BH: Buck Halcon, BR: Buck Raudal, F: FCA1, L: FCA2, KL: Klein Martillo, BS: Buck Sureño); d) duración del ciclo de cultivo de los cultivares de trigo.
Figure 2. Variability in the degree of colonization of the rhizosphere in crops inoculated with Azospirillum spp. grouped according trials characteristics: a) cropping season (winter, summer), b) crop type (wheat, corn, pasture), c) strain source (commercial, INTA, UNRC, native), d) wheat cultivars in the same trial (M: FCA3, KE: Klein Don Enrique, II: Pro INTA Imperial, BH: Buck Halcon, BR: Buck Raudal, F: FCA1; L: FCA2, KL: Klein Martillo, BS: Buck Sureño, d) Length cycle of wheat cultivars.

   Los nueve cultivares de trigo analizados en un mismo ensayo durante el año 2003 e inoculados con la cepa Az 39 INTA presentaron diferencias significativas en el grado de colonización. Buck Halcon, Pro INTA Imperial y FCA1 presentaron variaciones significativamente mayores y Buck Raudal, FCA2 y Buck Sureño variaciones menores (Fig. 2 d). En la comparación entre los cultivares de trigo agrupados según la duración del ciclo de cultivo se obtuvieron diferencias significativas, siendo los de ciclo corto (110 días a antesis) los que presentaron las mas altas variaciones en relación a las plantas testigos (Fig. 2 e). La colonización en los cultivares de ciclo largo (150 dias a antesis) no difirió de los testigos, excepto la línea FCA1, que es un cultivar de ciclo intermedio.

   No se estableció correlación significativa entre el contenido de materia orgánica del suelo y la variación en el grado de colonización de las plantas (r²= 0,1455, P= 0,454), ni entre la cantidad de bacterias en la rizosfera del testigo y el porcentaje de variación con los tratamientos inoculados (r²= 0,0071, P= 0,851).

DISCUSIÓN

   Nuestros resultados indican que no existe un patrón definido de colonización rizosférica por las bacterias introducidas del género Azospirillum a nivel de campo. En todos los casos analizados el número de bacterias fijadoras de N₂ en microaerofilia de la rizosfera presentó alta variabilidad. Esta variabilidad, que fluctúa entre valores negativos y mayores al 100% de diferencia con el control, ha sido escasamente mencionada con anterioridad (Kaushik et al.,2002).

   Contrariamente, existen referencias sobre alta variabilidad cuando se analizan los efectos de la inoculación a campo sobre parámetros del cultivo (Döbereiner, 1992; Baldani et al.,1997; Mantelin & Touraine, 2004).

   Efectos positivos son mencionados frecuentemente, pero también existen referencias sobre efectos neutros y negativos atribuídos a la especificidad cepa-planta y a una posible competencia por nutrientes con la planta (Dobbelaere et al.,2002; Kozdroj et al.,2004).

   Existen numerosos referencias sobre variaciones en la colonización en condiciones controladas (laboratorio e invernáculo) atribuidas a: a) contenido de humedad del suelo (El-Komy et al.,2003), relacionadas con el deficit hidrico y la saturacion del suelo (Reis Jr. et al.,2004; _ahin et al.,2004); b) distribución de las bacterias sobre la raíz: las zonas con mayor tasa de crecimiento producen mas exudados, que favorecen la colonización (Fischer et al., 2000); c) especificidad cepa-planta (Schulze & Pöschel, 2004; Ramey et al.,2004); y d) competencia con microorganismos nativos: Saubidet et al. (2002) mencionan mayor colonización cuando inoculan en suelo estéril.

   Las agrupaciones realizadas en este trabajo para interpretar los factores que regulan la colonización en condiciones de campo indican que la alta variabilidad detectada a nivel general se mantiene en todos los agrupamientos. La única excepción la constituye la duración del ciclo de los cultivares de trigo para una misma zona de cultivo y en una misma campaña.

   Características del suelo: Los datos obtenidos en este trabajo no permiten testar si las características edáficas fueron factores determinantes para la colonización debido a que los suelos de la Región semiárida central donde se realizaron los ensayos son muy semejantes. Aunque los valores de materia orgánica están dentro de rangos muy estrechos (entre 1,2 y 3,7%), nuestra observación sería coincidente con lo mencionado por numerosos autores en relación a que los factores abióticos del suelo no pueden explicar por si mismos la sobrevivencia de las bacterias introducidas (Basham et al., 1995; Edge & Wyndham, 2002; ahin et al., 2004).

   Cultivos: La época de cultivo (invierno y verano) y el tipo de cultivo (trigo, maíz y pasturas) no fueron factores determinantes para el grado de colonización en nuestros ensayos. Kaushik et al. (2002) también observaron que la colonización no varía entre cultivos de invierno y verano. Sin embargo, vale la pena destacar la alta variabilidad detectada en los cultivos de invierno (CV 206%) y en el cultivo de trigo en particular (CV 207%).

   Variaciones temporales: Las variaciones interanuales (CV 86%) registradas para el mismo cultivo y cultivar (maíz, CEC) inoculados con la misma cepa (INTA Az 39) y en el mismos sitio (Campo Escuela) serían indicadoras de una relación entre colonización y factores climáticos (Kaushik et al., 2002; Reis Jr. et al., 2004).

   La cantidad de precipitación registrada durante la campaña 2003-2004 fue menor (247 mm) que en los años precedentes, lo que podría explicar los valores negativos de colonización respecto al testigo.

   La alta variabilidad en la colonización detectada entre diferentes cultivares de trigo en un mismo sitio y año de cultivo podría deberse a factores de índole genética (Schulze & Pöschel, 2004). Sin embargo, la diferencia encontrada entre los cultivares según la duración de su ciclo, estaría indicando una interacción entre factores fenológicos y climáticos. Probablemente, las diferencias en la colonización entre cultivares de ciclo corto y largo dentro del mismo año de cultivo de trigo podrían deberse a las condiciones de estrés hídrico durante el período de antesis. Los cultivares de ciclo corto sembrados temprano pueden haber tenido mejores condiciones de humedad que los tardíos. En la Región semiárida central de la Argentina la cantidad de agua para el cultivo de trigo depende más del agua almacenada en el suelo que de las precipitaciones registradas durante el cultivo, que son escasas e impredecibles.

   Durante el año 2003 los cultivos se iniciaron con escasa agua en el perfil del suelo y las primeras lluvias se registraron recién en octubre con sólo 18 mm. Probablemente los cultivares de ciclo largo soportaron déficit hídrico en antesis.

   Especificidad cepa-planta: Nuestros resultados muestran que no existe diferencia en el grado de colonización según el origen de la cepa utilizada. Sin embargo, es de destacar que fueron muy pocos los casos considerados en los cuales se evaluaron las cepas nativas aisladas de la región semiárida de Córdoba. Merece destacarse la gran diferencia encontrada en maíz en el Campo Escuela durante el ciclo 2003-2004. En este caso la colonización con una cepa nativa fue casi 70 veces más alta que con una cepa aislada en la Pampa Húmeda (INTA Az 39). Probablemente estos resultados se deban a que las cepas nativas poseen mayor competitividad en condiciones de estrés ya que durante la campaña 2003-2004 las condiciones de humedad fueron limitantes para el cultivo de maíz (247 mm). Numerosos autores mencionan que bajo condiciones de estrés la planta cancela la emisión de exudados a la raíz, lo que ocasiona falta de alimento para las bacterias rizosféricas (Fischer et al.,2000; Schulze & Pöschel, 2004).

   Cuando la fuente carbonada es escasa se produce una fuerte competencia entre los microorganismos cuyo resultado es la sobrevivencia de los mejor adaptados (Edge & Wyndham, 2002; Fischer et al., 2000; Ramey et al., 2004).

   Capacidad de carga: La dependencia de las bacterias rizosféricas a la provisión de exudados, indica que la raíz no tienen una ilimitada capacidad de carga de bacterias y que cualquier cambio en la situación de la planta puede afectar esa capacidad de carga (ahin et al., 2004). Este aspecto fue muy evidente en nuestros resultados durante el año 2003. Cuando el déficit hídrico fue muy pronunciado, la cantidad de bacterias en la rizosfera fue muy baja, tanto en los tratamientos testigos como en los inoculados (por ejemplo, en Gatton Panic), llegando a ser negativo en el caso del trigo durante los meses de invierno.

   Competencia: Aunque ha sido mencionado con frecuencia que el éxito de la inoculación depende de la capacidad de las cepas para competir con la microflora nativa, desafortunadamente han sido reportados escasos estudios sobre este problema (Bacilio-Jiménez et al., 2001). Kosdroj et al. (2004) afirman que la competencia de las bacterias del inoculante se establece en dos etapas: primero deben competir por nutrientes con microflora libre del suelo para poder sobrevivir y proliferar antes que se forme la raíz de la planta y después, cuando colonizan la raíz, deben competir con bacterias rizosféricas por los exudados. Ambas situaciones marcan una gran diferencia con el mecanismo de infección del rizobio en leguminosas, debido a que la penetración en la radícula evita en gran medida la competencia en ambos ambientes.

CONCLUSIONES

   La falta de un claro patrón que justifique la alta heterogeneidad de los resultados, permite especular que los principales factores que pueden afectar el grado de colonización de raices por Azospirillum spp., son el estrés hídrico y el origen de las cepas del inoculante. Bajo condiciones de estrés podría existir una fuerte competencia entre las poblaciones rizosfericas, situación en la cual, las cepas nativas tendrían ventaja por su mayor adaptación al medio. Quizás los ensayos con cepas nativas sean demasiado escasos en este trabajo como para generalizar este aspecto pero parece promisoria la utilización de cepas nativas, lo que justifica un seguimiento más exhaustivo sobre el tema. Bajo esta perspectiva, sería conveniente evaluar el grado de colonización provocado por la inoculación en estadíos juveniles de la planta y no en etapa de antesis especulando con: a) mayor capacidad de carga en las raíces jóvenes por la mayor producción de exudados y b) menor tiempo de competencia con las bacterias nativas.

   Teniendo en cuenta las políticas actuales a nivel mundial para reducir la cantidad de fertilizantes químicos, la inoculación con Azospirillum spp. ofrece perspectivas para una agricultura sustentable sin comprometer los rendimientos. Sin embargo, a partir de los resultados presentados aquí, es claro que debe ser realizado mucho trabajo antes que Azospirillum spp. pueda ser utilizado como inoculante eficiente en todos los casos.

AGRADECIMIENTOS

    Los autores agradecen a S. Alonso y G. Galantti por el apoyo en las tareas de laboratorio. Este trabajo pudo realizarse gracias al financiamiento de la Secretaría de Ciencia y Técnica (SECYT) de la Universidad Nacional de Córdoba.

BIBLIOGRAFÍA

1. Bacilio- Jimenez, M; S Aguilar- Flores; MV Del Valle; A Perez; A Zepeda & E Zenteno. 2001. Endophytic bacteria in rice seeds inhibit early colonization of roots by Azospirillum brasilense. Soil Biol. Biochem. 33:167-172.        [ Links ]

2. Baldani, JI; L Caruso; V Baldani; SR Goi & J Döbereiner. 1997. Recent advances in BNF with non-legume plants. Soil Biol.Biochem. 29:911-922.        [ Links ]

3. Basham, Y; ME Puente; MN Rodriguez-Mendoza; G Toledo; G Hoguin; R Ferrera-Cerrato & S Pedrin. 1995. Survival of Azospirillum brasilense in the bulk soil and rhizosphere of 23 soil types. Appl. Environ. Microbiol. 61: 1938-1945.        [ Links ]

4. Beeby, A. 1995. Applying Ecology. Chapman & Hall. London. 441 pp.        [ Links ]

5. Bhattarai, T. 1999. Azospirillum wheat association. Pp. 121-137 In: BN Prasad (ed.). Biotechnology and Biodiversity in Agriculture/Forestry. Harcourt Brace & Company Publishers. London.        [ Links ]

6. Chotte, Jl; A Schwartsmann; E Bally & LJ Monrozier. 2002. Changes in bacterial communities and Azospirillum diversity in soil fractions of a tropical soil under 3 or 19 years of natural fallow. Soil Biol. Biochem. 34:1083-1092.        [ Links ]

7. Dillon, WR & M Goldstein. 1984. Multivariate Analysis, Methods and Applications. John Wiley & Sons. London.        [ Links ]

8. Dobbelaere, S; A Croonenborghs; A Thys; D Ptacek; Y Okon & J Vanderleyden. 2002. Effect of inoculation with wild type Azospirillum brasilense and A. irakense strains on development and nitrogen uptake of spring wheat and grain maize. Biol. Fert. Soils 36: 284-297.        [ Links ]

9. Döbereiner, J. 1992. History and new perspectives of diazotrophs in association with non legumenous plants. Symbiosis 13: 1-13.        [ Links ]

10. Döbereiner, J. 1995. Isolation and identification of aerobic nitrogen fixing bacteria from soil y plants [4] Pp. 134 -141 In: K Alef & P Nannipieri (eds.). Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press. Harcourt Brace y Company Publishers. London. 576 pp.        [ Links ]

11. Edge, TA & RC Wyndham. 2002. Predicting survival of a genetically engineered microorganism, Pseudomonas chlororaphis 3732RN-L11, in soil and wheat rhizosphere across Canada with linear multiple regression models. Can. J. Microbiol 48: 717-727.        [ Links ]

12. EL-Komy, HM; MA Hamdia & GK EL-Baki. 2003. Nitrate reductase in wheat plants grown under water stress and inoculated with Azospirillum spp. Biol. Plant 46:281-287.        [ Links ]

13. Fischer, S; V Rivarola & G Mori. 2000. Colonization of wheat by Azospirillum brasilense Cd is impaired by saline stress. Plant Soil 225: 187-191.        [ Links ]

14. Fulchieri, M & L Frioni. 1994. Azospirillum inoculation on maize (Zea mays): effect on yield in a field experiment in central Argentina. Soil Biol. Biochem 26:921-923.        [ Links ]

15. Kaushik, R; AK Saxena & KVBR Tilak. 2002. Can Azospirillum strains capable of growing at a sub-optimal temperature perform better in field-grown-wheat rhizosphere. Biol. Fert. Soils 35:92-95.        [ Links ]

16. Kopp, S & A Abril. 1997. Efecto de la inoculación con Azospirillum spp. sobre gramíneas forrajeras de un pastizal de altura de las Sierras de Córdoba, Argentina. Rev. Arg. Microbiol. 29:103- 107.         [ Links ]

17. Kozdroj, J; JT Trevor & JD Van Elsas. 2004. Influence of introduced potential biocontrol agents on maize seedling growth and bacterial community structure in the rhizosphere. Soil Biol.Biochem 36:1775-1784.        [ Links ]

18. Mantelin, S & B Touraine. 2004. Plants growth-promoting bacteria and nitrate availability: impacts on root development and nitrate uptake. J. Exp. Bot. 55:27-34.        [ Links ]

19. Moscatelli, M. (ed.). 1990. Atlas de Suelos de la República Argentina. INTA. Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca. Buenos Aires.        [ Links ]

20. Ramey, B; M Koutsoudis; SB Von Bodman & C Fuqua. 2004. Biofilm formation in plant-microbe associations. Curr. Opin. Microbiol. 7:602-609.        [ Links ]

21. Reis Junior, FB; MF Silva; KRS Teixeira; S Urquiaga & VM Reis. 2004. Identification of Azospirillum amazonense isolates associated to Brachiaria spp. at differents stages and growth conditions, and bacterial plant hormone production. R Bras Ci Solo 28:103-113.        [ Links ]

22. Roy, RN; RV Misra & A Montanez. 2002.Decresing reliance on mineral nitrogen- Yet more food. Ambio 31:177-183.        [ Links ]

23. Sahin, F; R Çakmakçi & F Kantar. 2004. Sugar beet and barley yield in relation to inoculation with N₂-fixing and phosphate solubilizing bacteria. Plant Soil 265:123-129.        [ Links ]

24. Saubidet, M; N Fatta & AJ Barneix. 2002. The effect of inoculation whith Azospirillum brasilense on growth and nitrogen utilization by wheat plants. Plant Soil 245:215-222.        [ Links ]

25. Schulze, J & G Pöschel. 2004. Bacterial inoculation of maize affects carbon allocation to roots and carbon turnover in the rhizosphere. Plant Soil 267:235-241.        [ Links ]

26. Tsagou, V; I Kefalogianni; K Sini & G Aggelis. 2003. Metabolic activities in Azospirillum lipoferum grown in presence of NH₄ ⁺. Appl. Microbiol. Biotechnol. 62:574 -578.        [ Links ]

27. Zaadi, E; Y Okon; A Prevolotzky & R Yonatan. 1992. Inoculation and fertilization effect on the productivity of natural pasture in temperature and semiarid region of Israel. Hassadeh 72:1- 10.         [ Links ]