Muestreo de suelo

Las muestras de suelo fueron colectadas de tres sitios colindantes, ubicados a 5 km al sur de la ciudad de Córdoba, Argentina. El área posee un clima semiárido con un promedio de 700 mm de precipitación anual, suelos Haplustoles típicos y de textura franco-limosa. El suelo de esta área incluyó tres niveles de manejo: L1) Testigo: suelo prístino (31º37´20.25´´S 64º18´6.37´´W); L2) Conservacionista: diez años de rotación 2:1 (soja-maíz) bajo siembra directa (SD) (31º37´17.76´´S 64º17´45.31´´W) y L3) Convencional: trece años de monocultivo de soja bajo labranza convencional (31º37´9.00´´S 64º17´21.17´´W) (Fig. 1). La historia de manejo de estos suelos se ha reportado en un estudio anterior (Dominchin et al., 2020). Estos sitios nunca han recibido aplicaciones de captan. El gradiente de deterioro edáfico fue categorizado en función del contenido de MOS (^{Manlay et al., 2007}). Las propiedades fisicoquímicas de las muestras de suelo se muestran en la Tabla 1. Las muestras de suelo fueron colectadas durante el cultivo de soja (cultivo presente en los dos tipos de manejo). Se tomaron tres muestras compuestas por sitio. Cada muestra compuesta consistió en la toma de 9 puntos de suelo del horizonte superficial (0-15 cm) con un barreno manual de la zona central de las parcelas evitando los bordes para constituir una muestra representativa de cada sitio. El suelo se transportó al laboratorio en una hielera y luego fue tamizado (2 mm de poro) para eliminar los residuos orgánicos visibles.

Fungicida y diseño experimental

Los suelos L1, L2 y L3 fueron tratados con la formulación comercial del fungicida Captan (Rovral 50 WP, CAS No.133-06-2). El experimento fue llevado a cabo en invernadero, bajo condiciones controladas de temperatura y humedad (24°C y 60% capacidad de campo) en macetas plásticas de 500 g. Todos los tratamientos fueron realizados por triplicado. La dosis de aplicación se determinó con base en tasas de aplicación recomendadas de campo (1x) (1.0 mg/kg suelo) y diez veces estas dosis (10x). Los suelos de control (0x) se rociaron con una cantidad igual de agua desionizada (ddH2O) a la que se usó para aplicar los fungicidas. La conversión de la proporción de campo a mg de fungicida por kilo de suelo se calculó suponiendo que todo el fungicida aplicado termina en el suelo y se incorpora a los 5 cm superiores de la superficie del suelo. La dosis 10x se recomienda en pruebas de laboratorio para evaluar el efecto de una contaminación accidental del suelo por una dosis sobrecargada de fungicida o derrames accidentales para analizar el efecto sobre la microflora del suelo (Sułowicz y Piotrowska-Seget, 2016). Antes del inicio del experimento, el suelo se equilibró durante 2 semanas. Los tratamientos fueron: L1 0x, L1 1x, L1 10x; L2 0x, L2 1x, L2 10x; L3 0x, L3 1x y L3 10x. Después de la aplicación de captan, los suelos se incubaron en invernadero durante 30 días. Se tomaron muestras de suelo para estudios microbiológicos 30 días después de la aplicación del fungicida (Podio et al., 2008; Verdenelli et al., 2012). Las muestras fueron almacenadas a 4°C para determinaciones químicas y de actividad enzimática y a -20°C para los análisis de estructura de las comunidades microbianas. La elección de dicho tiempo de incubación se corresponde con el plazo óptimo de respuesta microbiana a los diferentes fungicidas obtenidos por nuestro grupo en trabajos previos (Verdenelli et al., 2012).

Tabla 1 Propiedades físicas y químicas para cada manejo de suelo. Cada valor es la media de tres muestras compuestas y letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas entre sitios (LSD; P<0,05). L1: Testigo (suelo bajo bosque nativo); L2: Rotación 2:1 (soja-maíz) bajo siembra directa; L3: Monocultivo de soja bajo labranza convencional. Table 1. Physical and chemical properties for each soil management. Each value is the mean of three composite samples and different letters indicate statistically significant differences between sites (LSD; P<0.05). L1: Control (soil under native forest); L2: Rotation 2:1 (soybean-corn) under direct sowing; L3: Soybean monoculture under conventional tillage.  

Figura 1 (A) Localización del área de estudio (31°19’ lat. Sur; 64°13’ long. Oeste) en Córdoba, Argentina. Vista satelital (Google Earth®) de las parcelas con diferente uso del suelo. Tres sitios pueden ser identificados: L1: suelo prístino L2: Conservacionista: diez años de rotación 2:1 (soja-maíz) bajo siembra directa y L3: Convencional: trece años de monocultivo de soja bajo labranza convencional. Las estrellas amarillas muestran los sitios de muestreo. (B) Detalle del sitio L1. (C) Detalle del sitio L2. (D) Detalle del sitio L3 Figure 1. (A) Location of the study area (31°19’ lat. South; 64°13’ long. West) in Córdoba, Argentina. Satellite view (Google Earth®) of the plots with different land use. Three sites can be identified: L1: pristine soil L2: Conservationist: ten years of 2:1 rotation (soybean-corn) under no-tillage (SD) and L3: Conventional: thirteen years of soybean monoculture under conventional tillage. The yellow stars show the sampling sites. (B) Detail of the L1 site. (C) Detail of the L2 site. (D) Detail of the L3 site. 

Actividad metabólica/funcional: Actividades enzimáticas total y específicas

La actividad deshidrogenasa (DHA): Fue determinada de acuerdo a ^{Garcia et al. (1997}) Brevemente, a 1 gr de suelo se le adicionaron 0.2 mL de INT (iodo-nitrotetrazolio) al 0.4% durante 24 hs a 28ºC en oscuridad. El INTF formado (iodo-nitrotetrazolioformazan) fue extraído con 10 mL de metanol y medido en espectrofotómetro UV-Vis Perkin Elmer Lamda 25 a 485 nm. La concentración de INTF se calculó utilizando la curva de calibración construida con patrones de 1 a 50 µg.mL^-1.

La actividad microbiana total (FDA): Esta actividad fue estimada por la hidrólisis de diacetato de fluoresceína (FDA) usando el protocolo de ^{Adam y Duncan, (2001}). Brevemente se colocaron 2 g de suelo en un tubo para centrífuga, se agregaron 15 mL de buffer fosfato pH 7,6 y 0,2 mL de solución stock de FDA, se tapó y agitó en vortex. Se incubó a 30ºC durante 30 min en un baño termostatizado. Se añadieron 15 mL de la mezcla cloroformo:metanol 2:1 (v/v) para detener la reacción y se agitó en vortex durante 5 min. Se dejó reposar 24 hs. El producto fue cuantificado en un espectrofotómetro UV-Vis Perkin-Elmer Lamda 25 a 490 nm. La concentración de fluoresceína fue calculada mediante una curva de calibración construida con patrones de 1 a 6 µg.mL^-1.

Actividad β-glucoronidasa y fosfatasa: Derivados de 4-Metilumbelliferona (4-MU-βD-Hidrato de glucurónido y 4-MU-fosfato) fueron usados como modelos de sustratos para β-glucoronidasa y para fosfatasa acorde con el ensayo de enzimas con sustratos múltiples (Stemmer, 2004). Para el análisis de las muestras se utilizó un cromatógrafo líquido de alta presión (HPLC Perking Elmer), columna C-18 (HP-Hipersil), velocidad de caudal de 1 mL.min^-1 y horno a 40ºC de temperatura. Los sustratos se estimaron con un detector UV a 320 nm (Dominchin et al., 2021).

Actividad ureasa: Fue determinada por el método propuesto por Kandeler y Gerber, (1988) levemente modificado. La técnica se basa en la determinación colorimétrica del amonio liberado de la incubación de suelo. Brevemente, 1 g de suelo fue incubado con una solución acuosa de urea 79,9 nM por 2 h a 37°C en oscuridad. La reacción enzimática se detuvo con ClK 2M. Luego, el amonio producido reaccionó con dicloroisocianurato al 0,1% y salicilato produciendo una solución verde-azulada. Se cuantificó en espectrofotómetro UV-VIS Perkin-Elmer Lamda 25 a 690 nm, donde la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de nitrógeno amoniacal.

Estructura y biomasa taxonómica: Perfiles de ácidos grasos de fosfolípidos (PLFA)

La estructura de taxones de las comunidades microbianas de suelo fue estudiada mediante sus perfiles de fosfolípidos de ácidos grasos (PLFA). La metodología de extracción y condiciones de análisis de los PLFA se realizó de acuerdo a Meriles et al. (2009). Brevemente, los lípidos del suelo fueron extraídos mediante una mezcla de cloroformo: metanol: buffer fosfato (1:2:0.8 v/v/v), y posteriormente fueron separados en un gradiente de polaridad mediante cromatografía en columna (Silicicacid, Sil350-Sigma). Las fracciones de glicolípidos, lípidos neutros y lípidos polares (fosfolípidos) fueron eluídas con cloroformo, acetona y metanol, respectivamente. Finalmente, los fosfolípidos fueron metilados e inyectados en un cromatógrafo gaseoso Perkin-Elmer Clarus 600 equipado con una columna Elite-5 (Crossbond 5% difenil -95% dimetilpolisiloxano), detector de llama (FID) y detector de masa (MS) para su identificación y cuantificación. Para la cuantificación se utilizó un estándar interno (19:0), identificándose los ácidos grasos mediante una corrida previa de un estándar de ésteres metílicos de ácidos grasos bacterianos (Bacterial Acid Methyl Esters mix, Supelco, Bellefonte, PA). La concentración total de PLFA se estimó mediante la sumatoria de todos los ácidos grasos de fosfolípidos identificados (Tabla 2) utilizándose como un estimador de la biomasa microbiana de cada taxón (Verdenelli et al., 2019).

Tabla 2 Ácidos grasos de fosfolípidos utilizados como biomarcadores para grupos específicos de microorganismos. En negrita los utilizados en el presente estudio Table 2. Phospholipid fatty acids used as biomarkers for specific groups of microorganisms. Those used in the present study are in bold. 

Extracción de ADN y análisis de la abundancia de bacterias y hongos totales mediante qPCR

El ADN total del suelo se extrajo de 0,5 g de muestra de suelo utilizando un kit de extracción de ADN PuriPrep SUELO-kit (Highway®) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron extracciones por triplicado para cada tratamiento. La calidad del ADN se determinó mediante observación en geles de agarosa al 1% (SYBR Safe; Invitrogen, Mulgrave, Australia).

Se determinaron los números de copias. g^-1 de suelo del gen 16S ARNr bacteriano (conjunto de cebadores 338F/534R) (Fierer y Jackson, 2005) y los números de copias. g^-1 de suelo del gen fúngico 18S ARNr (conjunto de cebadores SSU 1536/Fu 1851) (May et al., 2001) aplicando la metodología de Liu et al. (2009). Las reacciones de qPCR de 25 μl contenían 10 ng de ADN, 0,2 mg. mL^-1 de BSA, 0,2 μM de cada cebador, 12,5 μl de premezcla PerfeCTaSYBR®GreenFastMix®ROX (Quanta BioSciences, Inc.) y agua ultra pura hasta completar el volumen final. La reacción se llevó a cabo en un Line-Gene 9600 Plus mediante monitorización flourométrica con SYBRGreen (Applied Biosystems). Se utilizaron controles positivos de ADN (Pseudomonas aeruginosa, 10 veces diluidos en serie) y controles sin templado (agua ultrapura). Las muestras se realizaron en una sola placa y por triplicado. Las curvas estándar se construyeron utilizando plásmidos de genes de los ARNr clonados (Takara) para bacterias y hongos utilizando un kit pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega Corporation). Los plásmidos se construyeron con fragmentos de la región 16S de Bacillus sp. para bacterias y del 18S Rhizoctonia solani para hongos, respectivamente. Las curvas estándar se generaron utilizando diluciones de 10 veces por triplicado de ADN de plásmido, con un rango de 2,07 × 10² a 2,07 × 10⁸ copias para el gen ARNr bacteriano 16S y de 4,60 × 10² a 4,60 × 10⁸ copias para el gen ARNr 18S fúngico, por ensayo. Las eficiencias de amplificación se calcularon utilizando la fórmula Eff = [10/(−1/^slope)] (Hai et al., 2009). Se obtuvo una eficiencia de amplificación de cuantificación del 93% para el gen ARNr 16S bacteriano y del 99% para el gen ARNr 18S fúngico, con un valor de R² y una pendiente de 0,981 y −3,5021, y 0,995 y −3,345, respectivamente. Se realizó un análisis de la curva de fusión después de cada ensayo para confirmar la amplificación específica. La electroforesis en gel de agarosa (2%) se realizó adicionalmente en los productos de amplificación de PCR para verificar si se logró un tamaño apropiado.

La concentración del número de copias de ARNr para muestras desconocidas se calculó utilizando una ecuación de regresión que describe la relación lineal entre concentración (número de copias de ARNr) y el valor del umbral del ciclo (Ct) (^{Frasier et al., 2016}). El número de copias = m * (Ct) +b (donde “m” es la pendiente de la curva, “b” es la ordenada en el origen y “Ct” es el valor del umbral del ciclo). Luego se calcularon los valores del número de copias realizando la siguiente fórmula: N° copias = (ng del templado) *6,023*10²³ / longitud del plásmido pb * ng/g * g/mole bp (donde ng/g = 10⁹ y g/mole of bp = 660) (Serri et al., 2022).

Análisis de datos

Para el análisis de datos se utilizó el programa estadístico InfoStat (Di Rienzo et al., 2017). Los datos obtenidos se sometieron a análisis de varianza (ANAVA) bajo el marco de modelos lineales, generales y mixtos. El análisis de datos se realizó bajo un diseño a dos factores fijos (gradiente de deterioro edáfico y dosis de fungicida). Para evaluar diferencias entre tratamientos se realizó un test de comparaciones múltiples con diferentes niveles de significancia (LSD; p ≤0,05). El cumplimiento del supuesto de normalidad de los datos fue testeado en todos los casos (Shapiro-Wilks modificado).

Las relaciones entre las diferentes dosis de fungicida, el gradiente de deterioro edáfico, las variables de funcionalidad microbiana y estructura de comunidades microbianas fueron analizadas mediante análisis multivariado de componentes principales (ACP).

Actividad metabólica/funcional: Actividades enzimáticas total y específicas.

El ACP de las actividades enzimáticas reveló diferencias en la función de la comunidad microbiana (Fig. 2). CP1 explicó el 60,5% de la varianza, mientras que CP2 explicó el 20,5%, para un total acumulado del 81%. El gráfico indicó que L1 se separó de L2 y L3 a lo largo del eje 1. Esta separación se basó principalmente en la asociación con mayores valores de actividad enzimática FDA, DHA, β-glucoronidasa y ureasa en L1 en comparación con L2 y L3. Por otro lado, el CP2 separó a los suelos L2 de los L3, pero no tuvo influencia sobre L1. El eje 2 relacionó directamente a L3 con la actividad fosfatasa. Ninguno de los ejes del ACP diferenció claramente grupos en función de las dosis (Fig. 2).

Se observó un significativo efecto en la respuesta de las diferentes actividades microbianas en la interacción de los factores: dosis aplicadas y manejo del suelo (Tabla 3). Además, el impacto de captan en las diferentes actividades microbianas analizadas fue altamente significativo, en cada factor por separado; tanto para dosis del fungicida como para manejo del suelo (Tabla 3). Todas las actividades enzimáticas, con excepción de Fosfatasa presentaron valores de actividad significativamente mayores en los suelos L1 en relación a los suelos bajo manejo agrícola (Tabla 3). El nivel de deterioro L3, mostró valores significativamente más bajos de las actividades generalistas FDA y DHA y de la actividad β-glucoronidasa, relacionada al ciclo del carbono (Tabla 3). La aplicación de fungicida 10x produjo pérdidas significativas de las actividades enzimáticas (con excepción de fosfatasa) en relación a las dosis 0x y 1x (Tabla 3). En general la actividad fosfatasa no presentó una respuesta concluyente sobre el efecto que ejerce captan en relación al nivel de manejo del suelo o a la aplicación del fungicida (Tabla 3).

El efecto de cada dosis aplicada en función de cada nivel de manejo edáfico se observa en la Fig. 3. La actividad de la FDA presentó los mayores valores en el suelo L1. En los tres niveles de manejo edáfico, la aplicación de captan 1x aumentó significativamente la actividad de la FDA en comparación con el control 0x. En L1, los mayores valores de actividad se observaron con la aplicación de la dosis 10x, contrario a lo que se observó en L2 y L3 (Fig. 3A). Captan a dosis 10x redujo significativamente la actividad de la DHA en todos los niveles de manejo edáfico. La aplicación de captan 1x redujo significativamente la actividad DHA en los suelos L2 y L3 en relación a 0x. Sin embargo, en suelos L1, dicha dosis, incrementó significativamente DHA en relación a 0x (Fig. 3B). La actividad de la β-glucoronidasa presentó los mayores valores en el suelo L1. La tendencia de respuesta a la aplicación de captan fue similar a la actividad DHA, las dosis 1X y 10X redujeron significativamente la actividad β-glucoronidasa en relación a la dosis 0X tanto en L2 como en L3. Sin embargo, en los suelos L1 la aplicación de la dosis 1x presentó incrementos de actividad. (Fig. 3C). La actividad fosfatasa incrementó significativamente sus valores con la aplicación de captan en los suelos L1. Sin embargo, la respuesta de la fosfatasa a las aplicaciones de captan en los suelos L2 y L3 fue inconsistente. Los valores más elevados de actividad fosfatasa se observaron en suelo L3 bajo dosis 0x (Fig. 3D). La actividad ureasa presentó los mayores valores de actividad en el suelo L1. La aplicación de captan 10x disminuyó significativamente en los tres niveles de manejo edáfico en relación al control (Fig. 3E). La dosis 1x incrementó significativamente la actividad ureasa en el suelo L1 en relación al control. Sin embargo, en L2 disminuyo la actividad y en L3 no presentó diferencias significativas en relación a 0x (Fig. 3E).

Tabla 3 Análisis de la varianza del efecto del grado de deterioro edáfico y dosis de fungicida en diferentes actividades enzimáticas del suelo. FDA: actividad de la hidrólisis de diacetato de fluoresceína; DHA: actividad deshidrogenasa; FOSFA: Actividad fosfatasa ácida; GLUCO: Actividad glucoronidasa; L1: Testigo (suelo bajo bosque nativo); L2: Rotación 2:1 (soja-maíz) bajo siembra directa; L3: Monocultivo de soja bajo labranza convencional. Nota: Los asteriscos indican el nivel de significancia p (***<0,001; ** <0,01; ns: no significativo). Table 3. Analysis of variance results for the effect of degree of edaphic deterioration and dosage of fungicide in different enzyme activities of soil. FDA: fluorescein diacetate hydrolysis activity; DHA: dehydrogenase activity FOSFA: Acid phosphatase activity; GLUCO: Glucoronidase activity; L1: control (pristine forest soil). L2: rotation 2:1 (soybean-corn) under no-tillage management. L3: soybean monoculture under conventional tillage management. Note: Asterisks indicate the level of significance p (***<0.001; **<0.01; ns: not significant).  

Figura 2 Análisis de componentes principales (ACP) de las actividades enzimáticas en los diferentes usos del suelo y dosis de captan. L1: testigo (suelo bajo bosque nativo). L2: rotación 2:1 (soja-maíz) bajo siembra directa. L3: monocultivo de soja bajo labranza convencional. Figure 2. Principal component analysis (PCA) of enzyme activities in different land uses and captan dosages. L1: control (pristine forest soil). L2: rotation 2:1 (soybean-corn) under no-tillage management. L3: soybean monoculture under conventional tillage management.  

Figura 3 Análisis de actividades enzimáticas en respuesta a diferentes usos del suelo y dosis de captan. A: FDA (actividad de la hidrólisis de diacetato de fluoresceína). B: DHA (actividad deshidrogenasa). C: Glucoronidasa. D: Fosfatasa. E: Ureasa. L1: testigo (suelo bajo bosque nativo); L2: rotación 2:1 (soja-maíz) bajo siembra directa; L3: monocultivo de soja bajo labranza convencional. Diferentes letras indican diferencias estadísticas significativas entre tratamientos. (LSD; n=3; P<0,05). Figure 3. Analysis of enzyme activities in response to different land uses and captan dosages. A: FDA (fluorescein diacetate hydrolysis activity). B: DHA (dehydrogenase activity). C: β-glucuronidase. D: phosphatase. E: Urease. L1: control (pristine forest soil); L2: rotation 2:1 (soybean-corn) under no-tillage management; L3: soybean monoculture under conventional tillage management. Different letters indicate statistically significant differences between treatments. (LSD; n=3; P<0.05).  

Estructura y biomasa taxonómica: Perfiles de ácidos grasos de fosfolípidos (PLFA).

El ACP reveló diferencias en la estructura taxonómica microbiana. El CP1 explicó un 49,9% y el CP2 un 23% de la variabilidad de los datos, para un total acumulado del 72,9% (Fig. 4). El CP1 separó al suelo L3 en sus tres dosis de L2 y L1 a dosis 0x y 1x. Esta separación se basó principalmente en la asociación de los suelos L1 y L2 a todos los taxones estudiados, con excepción de Gram-negativas que se asociaron con L3 a sus tres dosis. El CP2 no tuvo marcada influencia sobre la separación de los tratamientos.

El efecto de captan en la abundancia de PLFA estuvo asociada particularmente a cada grupo taxonómico (Tabla 4). Las bacterias Gram-positivas mostraron incrementos significativos a dosis 1X en suelos con menor deterioro edáfico L1 y L2. La dosis 10x presentó los menores valores de abundancia de Gram-positivas en los tres manejos de suelo (Fig. 5A). La misma tendencia fue observada en Actinobacterias donde captan 10x disminuyó significativamente la abundancia del taxón, en todos los manejos (Fig. 5B). Contrariamente, el efecto de captan sobre Gram-negativas mostró incrementos significativos con dosis 10x en los suelos L1 y L2, y, en L3 una disminución significativa de la abundancia respecto al control (Fig. 5C). Tanto hongos como HMA (hongos micorrícicos arbusculares) presentaron mayor abundancia en los suelos L1 y a dosis 0x (Tabla 4). La aplicación de Captan 10x produjo una disminución significativa de la abundancia en los tres manejos de suelos en relación a la dosis 1x. No se encontraron diferencias significativas de la abundancia de hongos entre 0x y 1x en los suelos L2 y L3 (Fig. 5D). Sin embargo, la dosis 1x en el manejo L3 incrementó significativamente la abundancia HMA (Fig. 5E).

Tabla 4 Análisis de la varianza del efecto del grado de deterioro edáfico y dosis de fungicida en biomarcadores de ácidos grasos de fosfolípidos (PLFA). Actino: Actinomycetes; HMA: Hongos micorrícicos arbusculares; L1: Testigo (suelo bajo bosque nativo); L2: Rotación 2:1 (soja-maíz) bajo siembra directa; L3: Monocultivo de soja bajo labranza convencional. Nota: Los asteriscos indican el nivel de significancia p (***<0,001; ** <0,01; ns: no significativo). Table 4. Analysis of variance of the effect of the degree of edaphic deterioration and dosage of fungicide on biomarkers of phospholipid fatty acids (PLFA). Actin: Actinomycetes; AMF: arbuscular mycorrhizal fungi; L1: control (pristine forest soil). L2: rotation 2:1 (soybean-corn) under no-tillage management. L3: soybean monoculture under conventional tillage management. Note: Asterisks indicate the level of significance p (***<0.001; **<0.01; ns: not significant).  

Figura. 4 Análisis de componentes principales (ACP) de la estructura de la comunidad microbiana estimada por los perfiles de ácidos grasos de fosfolípidos (PLFA), en los diferentes usos del suelo y dosis de captan. HMA: hongos micorrícicos arbusculares. L1: testigo (suelo bajo bosque nativo). L2: rotación 2:1 (soja-maíz) bajo siembra directa. L3: monocultivo de soja bajo labranza convencional. Figure. 4. Principal component analysis (PCA) of the microbial community structure estimated by the phospholipid fatty acids profiles (PLFA), in the different land uses and captan dosages. AMF: arbuscular mycorrhizal fungi. L1: control (pristine forest soil). L2: rotation 2:1 (soybean-corn) under no-tillage management. L3: soybean monoculture under conventional tillage management.  

Figura 5 Abundancia de grupos microbianos del suelo en respuesta a diferentes usos de la tierra y dosis de captan. A: bacterias gram-positivas; B: bacterias gram-negativas; C: actinobacterias. D: hongos; E: HMA (hongos micorrícicos arbusculares). L1: testigo (suelo bajo bosque nativo). L2: rotación 2:1 (soja-maíz) bajo siembra directa. L3: monocultivo de soja bajo labranza convencional. Diferentes letras indican diferencias estadísticas significativas entre tratamientos (LSD; n=3; P<0,05). Figure 5. Abundance of PLFA biomarkers of specific microbial groups in response to different land uses and captan dosages. A: gram-positive bacteria; B: gram-negative bacteria; C: actinobacteria. D: fungi; E: AMF: arbuscular mycorrhizal fungi. L1: control (pristine forest soil). L2: rotation 2:1 (soybean-corn) under no-tillage management. L3: soybean monoculture under conventional tillage management. Different letters indicate statistically significant differences between treatments (LSD; n=3; P<0.05).  

Cuantificación de genes: Análisis de la abundancia de bacterias y hongos totales mediante qPCR

El suelo L1 mostró 3.10×10²⁷ copias. g^-1 de genes de ARNr 16S a dosis 0x, siendo significativamente mayor al resto de los tratamientos. Cuando el fungicida se aplicó a dosis 10x, suprimió significativamente la abundancia de genes ARNr 16S bacterianos revelando valores de 3.35×10²⁵, 9.73×10²⁵ y 3.39 ×10²⁶ copias. g^-1 de genes ARNr 16S para L1, L2 y L3, respectivamente. La aplicación de dosis 1x en suelos L2 y L3 no presentó diferencias significativas con el control 0x (Fig. 6A).

La abundancia del gen ARNr 18S de los tratamientos 0x fue significativamente mayor que los tratamientos bajo dosis 1x y 10x para cada manejo observándose valores de 6.50×10¹¹, 5.98×10¹¹ y 2.19×10¹¹ de genes ARNr 18S/g^-1 para L1, L2 y L3, respectivamente (Fig. 6B). La aplicación de captan suprimió consistentemente el tamaño de la población fúngica y la inhibición aumentó en los tratamientos 1x con excepción del suelo L3, donde 10x presentó los menores valores. Se calcularon las proporciones de las copias. g^-1 del gen ARNr 16S a 18S, que fue de 4.74×10¹⁵, 7.9×10¹⁴ y 3.46×10¹⁵ en los tratamientos 0x de L1, L2 y L3, respectivamente. De los tratamientos con fungicidas, solo 10x en L1 redujo significativamente la proporción de genes ARNr 16S a 18S a 1.86×10¹⁴, que fue aproximadamente 1/25 del control. Por el contrario, se observó un aumento de 4 y 18 veces en los tratamientos con fungicidas 1x en los suelos L1 y L2, respectivamente (Fig. 6C).

Figura 6 Abundancia de microorganismos de suelo determinada por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) en respuesta a diferentes usos del suelo y dosis de captan. A: Abundancia bacteriana (número de copias. g-1 de ARNr 16S). B: Abundancia fúngica (número de copias. g-1 del ARNr 18S). C: Proporción de genes ARNr 16S/18S. L1: testigo (suelo bajo bosque nativo). L2: rotación 2:1 (soja-maíz) bajo siembra directa. L3: monocultivo de soja bajo labranza convencional. Diferentes letras indican diferencias estadísticas significativas entre tratamientos (LSD; n=3; P<0,05). Figure 6. Abundance of soil microorganisms determined by quantitative real-time PCR (qPCR) in response to different land uses and captan dosages. A: Bacterial abundance (copy number of 16S rRNA). B: Fungal abundance (copy numbers of 18S rRNA). C: 16S/18S rRNA gene ratio. L1: control (pristine forest soil). L2: rotation 2:1 (soybean-corn) under no-tillage management. L3: soybean monoculture under conventional tillage management. Different letters indicate statistically significant differences between treatments (LSD; n=3; P<0.05).  

Actividad metabólica/funcional

La actividad enzimática es un indicador consistente de los cambios que ocurren en el suelo y puede utilizarse potencialmente para evaluar la calidad y la fertilidad del suelo (Ye et al., 2018). Las enzimas extracelulares son los principales catalizadores en la descomposición de la materia orgánica y están involucradas en numerosos procesos de ciclado de nutrientes del suelo (Burns et al., 2013). El ensayo FDA se utilizó para proporcionar una estimación de la actividad microbiana general en diferentes manejos del suelo. Nuestros resultados indicaron que FDA fue significativamente mayor en suelos L1, y a dosis recomendada para todos los manejos en relación al control. Diversos autores observaron que la actividad FDA incrementó 20-30 días posteriores a la aplicación de la dosis recomendada de diferentes fungicidas en relación al control en suelos agrícolas y de pastizales naturales (Verdenelli et al., 2012). En adición, ciertos grupos de microorganismos son capaces de utilizar metabolitos de los fungicidas como fuente nutricional para acelerar la síntesis de enzimas extracelulares (Shao y Zhang, 2017), existiendo una estrecha relación entre la cinética hidrolítica del FDA y la biomasa microbiana del suelo (Perucci, 1992).

La actividad DHA está asociada a los microorganismos proliferantes y es una de las enzimas encargadas de la oxidación biológica de los compuestos orgánicos del suelo. DHA juega un rol preponderante en el mantenimiento de la fertilidad y calidad de los suelos (^{Madejón et al., 2009}). Los valores de DHA en los tratamientos bajo manejo agrícola mostraron pérdida de actividad con la aplicación de fungicidas. Similarmente, numerosos autores informaron disminuciones significativas en la actividad DHA del suelo con la aplicación de fungicidas (Bending et al., 2007; Guo et al., 2015; Wang et al., 2018; Zhang et al., 2019). Medina, (2018), reportó que, en general, todas las actividades enzimáticas se correlacionaron positivamente con el contenido de MOS. Nuestros resultados mostraron que L1 presentó incrementos de la actividad a dosis recomendada. En estudios previos se observó que la aplicación de fungicidas puede incrementar la actividad debido a procesos relacionados con la desintoxicación celular, principalmente, en suelos prístinos con alto contenido de MOS y/o biomasa microbiana (Verdenelli et al., 2012). Como resultado de esto, los procesos fisiológicos de los microorganismos se alteran, generando modificaciones en la actividad de algunas enzimas (Tortella et al., 2013).

Las actividades específicas de las enzimas permiten conocer el estado microbiano del suelo. En este sentido, están marcadamente influenciadas por cambios en la comunidad microbiana que sintetizan las enzimas (Muñoz-Leoz et al., 2011). Nuestros resultados reportaron que las actividades enzimáticas estuvieron influenciadas por el manejo del suelo y por la dosis de captan aplicada. La dosis de captan 10x disminuyó las actividades de β-glucoronidasa y ureasa en relación al control 0x, principalmente en los suelos bajo manejo agrícola. Las actividades específicas β-glucoronidasa, fosfatasa y ureasa presentaron incrementos a dosis recomendada en relación al control 0x. Similarmente, Zhang et al., (2019), obtuvieron incrementos de actividades específicas a bajas dosis de fungicida en la etapa inicial de incubación (días 14 y 21). Por otro lado, Wightwick et al. (2013), reportaron que captan a dosis elevadas, generó disminución de la actividad ureasa y de las enzimas relacionadas al ciclo de C como la enzima β-glucoronidasa. Estos resultados, también fueron observados con la aplicación de otros fungicidas (Baćmaga et al., 2019; Guo et al., 2015; Muñoz-Leoz et al., 2011; Saha et al., 2016; Zhang et al., 2019). La transformación de pesticidas en el suelo puede lograrse a través de muchos procesos, pero los mecanismos biológicos catalizados por enzimas, como la oxidación, la hidrólisis, la reducción y la conjugación, se consideran los medios principales para lograrlo (Chowdhury et al., 2008). En general, el efecto residual de los pesticidas sobre los microorganismos tiende a variar con la dosis de aplicación, el tipo de suelo, el manejo y la cantidad de aplicaciones (Cycoń et al., 2010)mancozeb (MB. Se puede inferir que, cuando se aplica captan en dosis recomendadas, el fungicida tiende a ser neutral o menos tóxico para los microbios del suelo, así como para las funciones del suelo, pero el mismo pesticida puede volverse altamente tóxico con una dosis de aplicación mayor. Respecto a la actividad fosfatasa, se obtuvieron niveles altos de actividad, tanto a dosis recomendada como a dosis 10x principalmente en suelos prístinos. En este sentido, Satapute et al. (2019), reportaron aumentos de la actividad fosfatasa a dosis recomendadas de fungicidas en relación al control. Resultados similares fueron reportados por Jiang et al. (2022), donde la aplicación del fungicida clorotalonil, generó incrementos de la actividad en los suelos tratados con dosis tóxica a los 30 días de incubación. En general, los fungicidas actúan inhibiendo la proliferación de hongos, e incrementando así los posibles efectos indirectos sobre comunidad bacteriana del suelo (Muñoz-Leoz et al., 2011; Verdenelli et al., 2012). Megadi et al., (2010), descubrieron que una cepa de Bacillus sp. utilizó el fungicida captan como única fuente de carbono y energía degradando captan por una vía que involucra su hidrólisis inicial para producir cis-1,2,3,6-tetrahidroftalimida, un compuesto sin actividad fungicida. En este sentido, los fungicidas pueden ser utilizados por los microorganismos como fuente de carbono y nitrógeno, provocando incrementos en la secreción y actividad enzimática (Ullah et al., 2021; Zhang et al., 2019).

Estructura y biomasa taxonómica

Los cambios en el ambiente del suelo causados por la presencia de fungicidas generalmente conducen a una reducción en la abundancia y diversidad de microorganismos (Podio et al., 2008; Verdenelli et al., 2012). Sin embargo, el impacto de estos, sobre los microorganismos del suelo, depende principalmente de la estructura química del fungicida y su dosis, así como del tipo de suelo (Hansda et al., 2014). Las bacterias representan el grupo taxonómico más abundante del suelo. Nuestros resultados mostraron un incremento en bacterias Gram-positivas a concentraciones recomendadas de fungicida y una disminución a dosis 10x, principalmente en suelos con bajo nivel de deterioro edáfico (L1 y L2). Similarmente, (Zhang et al., 2017), observaron incrementos bacterianos con la aplicación de las dosis recomendadas de fungicidas y pérdidas por la aplicación de dosis en exceso. Por otro lado, nuestros resultaron mostraron aumento de bacterias Gram-negativas en suelos L1 y L2 con altas concentraciones del fungicida captan. En este sentido, la aplicación de captan pudo haber estimulado el incremento de biomasa bacteriana a través de su uso como fuente de carbono (Ullah et al., 2021). Megadi et al. (2010), observaron que Bacillus circulans degradó captan a través de una vía de oxidación (o-ftalato de protocatecuato) regida por enzimas específicas. Esta degradación permitió la generación de metabolitos intermediarios del captan que fueron utilizados como fuente de carbono e indujeron el crecimiento microbiano. Por otro lado, la aplicación de captan afectó negativamente la biomasa de los hongos, permitiendo el incremento de biomasa bacteriana consecuencia de la falta de competencia interespecífica con los hongos (Sułowicz y Piotrowska-Seget, 2016). Similarmente, Podio et al. (2008) reportaron que la aplicación de captan tanto a dosis recomendadas (1X) como a dosis diez veces más elevadas (10X) aumentó la molécula marcadora de biomasa Gram-negativa 18:1ω9c, principalmente en suelos con elevado contenido de MOS. El efecto de captan en los grupos bacterianos Gram-positivas y Gram-negativas del suelo pueden ser el resultado de varios factores. Por un lado, estos filos presentan diferentes habilidades para usar fuentes de C. Las bacterias Gram-negativas se alimentan solo de material fácilmente disponible, mientras que las bacterias Gram-positivas pueden usar C derivado de fuentes más complejas (^{Malik et al., 2015}; Thoms et al., 2010). Por otro lado, la liberación de competencia de los grupos fúngicos podría generar cambios en la estructura de la comunidad bacteriana y estimular el crecimiento de grupos bacterianos específicos vinculados a cada manejo (El Azhari et al., 2018). Por lo tanto, se podría proponer que los cambios observados en la biomasa bacteriana no se deben únicamente a la exposición a fungicidas.

En nuestros resultados, las Actinobacterias mostraron los menores valores de biomasa en los tratamientos con dosis 10x en los tres manejos edáficos. Diversos autores informaron que la abundancia de Actinobacteria se correlacionó negativamente con fungicidas como Iprodione, 3,5-DCA y Thiabendazole, demostrando una elevada sensibilidad de este filo a altas concentraciones de pesticidas en el suelo (Papadopoulou et al., 2018; Vasileiadis et al., 2018). La aplicación de captan a dosis recomendada no presentó diferencias significativas con el control a excepción del suelo L2. Es ampliamente conocido que las Actinobacterias tienen una gran adaptabilidad al hábitat. En un estudio realizado por ^{Malek et al. (2020}), se encontró que aislados de streptomyces podían crecer en presencia de fungicidas a dosis recomendada, entre ellos captan. En este sentido, nuestros resultados podrían indicar que ciertos grupos de bacterias en condiciones ambientales desfavorables, desarrollan mecanismos de adaptación y resistencia incrementando su biomasa (Baćmaga et al., 2018).

La aplicación de fungicidas modifica drásticamente la población de hongos del suelo, afectando a los ácidos nucleicos al inhibir la actividad del sistema de ARN polimerasa I, la mitosis y la división celular (Kalia y Gosal, 2011). Nuestros hallazgos están en línea con estudios previos que informaron la supresión directa del crecimiento de hongos en el suelo luego de la aplicación de fungicidas de amplio espectro como Iprodione (Verdenelli et al., 2012; Zhang et al., 2017), carbendazim (Wang et al., 2009; Yan et al., 2011), tebuconazol (Bending et al., 2007; Muñoz-Leoz et al., 2011) y azoxistrobina (Vuyyuru et al., 2018), entre otros. La reducción de la biomasa fúngica resultante de estos diversos compuestos sugiere que los hongos son más sensibles al estrés químico (Wu et al., 2014). Algunos autores reportaron inhibición de la respiración fúngica y efecto inhibidor del crecimiento en directa relación con la concentración del fungicida en el suelo (Yan et al., 2011). En este sentido, nuestros resultados revelaron que los tratamientos con mayores dosis de captan disminuyeron significativamente la biomasa de hongos en relación con el tratamiento control. Por otro lado, nuestro estudio mostró que la biomasa fúngica fue significativamente mayor en suelos L1 en comparación con las observadas en suelos bajo manejo agrícola. Similarmente, Martínez-Toledo et al. (1998), observaron que las poblaciones de hongos en diferentes suelos de uso agrícola, se redujeron significativamente en presencia del fungicida captan. La inhibición fue más evidente a medida que aumentaba la concentración del fungicida. Esta tendencia es similar a las observadas en trabajos previos con el uso de diferentes fungicidas (Brodie et al., 2003; Podio et al., 2008; Verdenelli et al., 2012). Los HMA participan en el aumento de los nutrientes de las plantas (P, N y micronutrientes), brindan protección contra los patógenos transmitidos por el suelo en la raíz y aumentan la absorción de agua (Covacevich y Echeverría, 2010). Al igual que lo observado con la biomasa fúngica, captan disminuye la biomasa de hongos micorrícicos arbusculares, principalmente en dosis más altas. Varios estudios informaron que los fungicidas tienen efectos directos sobre las poblaciones de hongos micorrícicos arbusculares (Chiocchio, 2000; Kalia y Gosal, 2011). De manera similar, Kurle y Pfleger, (1996) catalogaron los efectos negativos de la aplicación de un gran número de fungicidas sobre la población de micorrizas arbusculares, la germinación de esporas y el crecimiento de hifas.

Cuantificación de genes

La cuantificación de genes de ARNr puede usarse para determinar la abundancia de bacterias y hongos (Rousk et al., 2010). El menor número de copias. g^-1 del gen ARNr 16S en todos los tratamientos bajo dosis 10x de captan, indicó una supresión significativa de la población bacteriana a los 30 días de incubación con el fungicida. Resultados similares fueron reportados indicando que captan es un inhibidor relativamente potente, efectivo en bacterias incluso en concentraciones recomendadas (Pan et al., 2019; Rousk et al., 2009). Sin embargo, diversos autores indicaron que el efecto de los fungicidas sobre la abundancia bacteriana está relacionado con el tiempo de incubación, indicando que el efecto tóxico disminuye con el tiempo (El Azhari et al., 2018; Zhang et al., 2017). Coppola et al. (2011), evaluaron el impacto de diferentes mezclas de fungicidas habitualmente aplicados con una mezcla de compost en viñedos y mostraron una modificación evidente de las comunidades fúngicas y bacterianas después de la adición de fungicidas en el día 1. Sin embargo, al final del experimento no se observaron cambios significativos en la composición, mostrando la adaptación de las comunidades microbianas. Por otro lado, en los suelos bajo manejo agrícola, no se observaron diferencias significativas entre la dosis 1x y el control. Estos resultados podrían relacionarse en primer lugar, con la capacidad de algunos microorganismos de utilizar inhibidores como sustrato de crecimiento (^{Ingham, 1985}; Megadi et al., 2010). En segundo lugar, los microorganismos muertos perderían la integridad de la estructura celular y se convertirían en nutrientes de los microorganismos resistentes (Pan et al., 2019). Por último, podrían relacionarse con la naturaleza del tipo de suelo y un historial de aplicación de agroquímicos, generando la presencia de bacterias resistentes a fungicidas.

Nuestros resultados demostraron que, en comparación con el tratamiento con 0x, las aplicaciones de captan redujeron notablemente la abundancia de la comunidad fúngica del suelo. Un estudio realizado por Zhang et al. (2017), reportó que la disminución fúngica podría relacionarse con la supresión de la síntesis de proteínas eucariotas y la posterior muerte celular, mecanismo de acción del captan (Pan et al., 2019). Resultados similares fueron reportados con la aplicación de otros fungicidas de amplio espectro (Pan et al., 2019; Sułowicz y Piotrowska-Seget, 2016; Verdenelli et al., 2012; Vuyyuru et al., 2018; Wang et al., 2020; Zhang et al., 2017). En general, la aplicación de fungicidas y quizás sus productos de degradación aumentan las ecotoxicidades sobre los organismos blanco en el suelo (Pan et al., 2019; Zhang et al., 2017). Sin embargo, en L1 y L2, la aplicación de captan 10x presentó mayor número de copias. g-1 de 18S que la dosis 1x. Varios autores plantearon la hipótesis de que es posible que algunos fungicidas como captan aumenten el N del suelo al reducir las comunidades bacterianas responsables de capturar N y al proporcionar carbono digerible de la biomasa bacteriana, disminuyendo el impacto de las dosis toxicas sobre los hongos en relación a las dosis recomendadas (Megadi et al., 2010; Ullah et al., 2021).