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Revista argentina de cardiología

versión On-line ISSN 1850-3748

Rev. argent. cardiol. v.76 n.6 Ciudad Autónoma de Buenos Aires nov./dic. 2008

 

Programación temprana de alteraciones en el sistema del óxido nítrico renal y vascular inducidas por la deficiencia de cinc

Mariela M. Ploder1, Analía L. Tomat2, Roxana Elesgaray3, Andrea L. Fellet4, Ana M. Balaszczuk5, María A. Costa6, Cristina T. Arranz7

Cátedra de Fisiología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina
Premio "Prof. Dr. Bernardo Houssay" al Mejor Trabajo de Investigación Básica en Cardiología 2008 (otorgado por el Consejo de Investigación Básica de la Sociedad de Cardiología)
1 Licenciada en Ciencias Biológicas
2 Doctora de la Universidad de Buenos Aires, Área Fisiología. Jefa de Trabajos Prácticos de la Cátedra de Fisiología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires
3 Profesional asistente del CONICET. Ayudante de Primera de la Cátedra de Fisiología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires
4 Doctora de la Universidad de Buenos Aires, Área Fisiología. Investigadora asistente del CONICET. Jefa de Trabajos Prácticos de la Cátedra de Fisiología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires
5 Doctora de la Universidad de Buenos Aires, Área Fisiología. Profesora Adjunta de la Cátedra de Fisiología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires
6 Doctora de la Universidad de Buenos Aires, Área Fisiología. Investigadora Adjunta del CONICET. Profesora Adjunta de la Cátedra de Fisiología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires
7 Investigadora independiente del CONICET. Profesora Asociada de la Cátedra de Fisiología. Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires

Fuentes de apoyo: Este trabajo fue realizado con el aporte de la Universidad de Buenos Aires (UBACYT: B026), de la Agencia de Promoción Científica y Tecnológica (PICT: 12126) y de IQUIMEFA-CONICET, Argentina

Recibido: 17/11/2008
Aceptado: 19/11/2008

Dirección para separatas: Cristina Arranz Cátedra de Fisiología, Facultad de Farmacia y Bioquímica Junín 956 - Piso 7 (1113) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina Tel. (5411) 4964-8280 Fax: (5411) 4508-3645 e-mail: carranz@ffyb.uba.ar

RESUMEN

Introducción
Numerosos estudios mostraron que la deficiencia nutricional durante la vida fetal y posnatal predisponen al desarrollo de patologías en la vida adulta, como la hipertensión arterial y las enfermedades renales. La distribución ubicua del cinc y sus propiedades químicas determinan su esencialidad en los sistemas biológicos.

Objetivos
Evaluar si las alteraciones renales y cardiovasculares en la vida adulta inducidas por la restricción moderada de cinc durante la vida fetal, la lactancia y/o el crecimiento se asocian con cambios en el sistema del óxido nítrico.

Material y métodos
Ratas Wistar hembra recibieron durante la preñez hasta el destete de las crías una dieta control o una baja en cinc. Luego del destete, las crías macho se asignaron al azar a dos grupos que recibieron una dieta control o una baja en cinc durante 60 días.

Resultados
Los resultados mostraron que el aporte insuficiente de cinc durante el crecimiento previo y/o posterior al destete indujo un aumento de la presión arterial y una disminución del volumen de filtrado glomerular en la vida adulta, asociados con una disminución del sistema del óxido nítrico renal y vascular. Además, el bajo aporte de este mineral durante la vida fetal indujo un peso menor al nacer, que se correlacionó en forma negativa con la presión arterial en la vida adulta.

Conclusiones
Este trabajo brinda evidencias importantes que sugieren que el aporte inadecuado de cinc durante el crecimiento prenatal y posnatal constituye un factor de riesgo cardiovascular y renal, dado que induce alteraciones en la regulación de la presión arterial y en la función renal en el individuo adulto.

Palabras clave: Presión arterial; Óxido nítrico; Riñón; Vasos sanguíneos; Cinc

Abreviaturas
Bb Madre dieta baja, cría dieta baja
Bc Madre dieta baja, cría dieta control
Cb Madre dieta control, cría dieta baja
Cc Madre dieta control, cría dieta control
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintetasa
OMS Organización Mundial de la Salud
PAS Presión arterial sistólica
UNICEF Fondo de las Naciones Unidas para la Infancia
VGF Volumen de filtrado glomerular

SUMMARY

Early Programming of Alterations in Renal and Vascular Nitric Oxide System Induced by Zinc-Related Deficiencies

Background
Several studies have reported that nutritional deficiencies during fetal and postnatal life predispose to the development of diseases such as hypertension and renal disorders during adulthood. The ubiquitous distribution of zinc and its chemical properties determine their essentiality in the biological systems.

Objectives
To assess whether renal and cardiovascular alterations induced by moderate zinc restriction during fetal life, lactation period and/or growth are associated with changes in the nitric oxide system.

Material and Methods
Female Wistar rats received low zinc diet or control diet from the beginning of pregnancy up to weaning. After weaning, male offspring were randomly fed with low zinc diet or control diet for 60 days.

Results
Zinc deficiency through pre-weaning and post-weaning growth induced increase in blood pressure and reduced glomerular filtration volume in adult life; these findings were associated with reductions in renal and vascular nitric oxide system. In addition, low zinc intake during intrauterine life induced low birth weight offspring which had a negative correlation with blood pressure in adulthood.

Conclusions
Zinc deficiency during prenatal and postnatal growth constitutes a risk factor for cardiovascular and kidney diseases as it induces alterations in blood pressure and renal function regulation in adult life.

Key words: Blood Pressure; Nitric Oxide; Kidney; Blood Vessels; Zinc

INTRODUCCIÓN

En los últimos años, numerosos estudios epidemiológicos y experimentales sugieren que la hipertensión y las enfermedades cardiovasculares pueden ser programadas en el útero. El aporte insuficiente de nutrientes y oxígeno durante la vida intrauterina, que limitan el crecimiento fetal, podrían inducir adaptaciones que alteran en forma permanente diferentes sistemas del organismo y que a largo plazo predisponen al desarrollo de enfermedades endocrinas, metabólicas, cardiovasculares y renales en la vida adulta. (1-3)
Uno de los problemas nutricionales que afecta a la población, principalmente a niños y a embarazadas, es lo que la OMS y el UNICEF han definido como desnutrición oculta: un conjunto de carencias específicas de micronutrientes que involucra a la deficiencia de cinc. (4, 5)
En la actualidad, los casos de deficiencia grave de cinc son poco comunes, mientras que su deficiencia moderada se ha informado notablemente. (6) Este micronutriente se encuentra ampliamente distribuido en una gran variedad de alimentos como carnes, pescados, mariscos, legumbres y cereales. Sin embargo, su deficiencia se debe principalmente a desequilibrios nutricionales en etapas de la vida en las cuales los requerimientos de cinc están aumentados, como el crecimiento, el embarazo y la lactancia. Además, se puede generar en enfermedades crónicas y por el consumo de dietas que se restringen a cereales, verduras y frutas, dado que las altas concentraciones de fitatos y de fibra en estos alimentos inhiben la absorción intestinal de cinc. (7-12)
En trabajos previos demostramos que la restricción dietética de cinc durante períodos críticos del desarrollo fetal y posnatal induce un aumento de la presión arterial y alteraciones de la función renal en la vida adulta, asociadas con la reducción de la superficie de filtración glomerular, la activación de procesos apoptóticos y el aumento del estrés oxidativo renal. (13-15)
Por otra parte, también hemos demostrado que una restricción de cinc durante el crecimiento posterior al destete induce alteraciones del sistema del óxido nítrico (NO) renal y vascular. (13, 14) Como es sabido, el NO es un gas altamente difusible sintetizado a partir de L-arginina por medio de las óxido nítrico sintetasas (NOS). (16, 17) Las tres isoformas de la NOS (neuronal, inducible y endotelial) presentan un cluster de cinc tiolato, en su interfase dimérica, que sería clave para mantener la actividad catalítica de la enzima. (18) Esta familia de enzimas se expresa en muchos tejidos del organismo, incluidos los vasos sanguíneos y el riñón. La producción de NO por las células endoteliales constituye un factor importante en la regulación del flujo sanguíneo y la presión arterial en mamíferos, ya que ejerce una acción relajante del músculo liso vascular. En el riñón, el NO cumple un papel importante en la regulación de la homeostasis glomerular, vascular y tubular. (19-21) Por lo tanto, una disminución en su producción y/o su biodisponibilidad podría estar involucrada en las alteraciones vasculares y renales previamente observadas en animales expuestos a la restricción de cinc durante el crecimiento.
Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo de este trabajo fue determinar si el aporte inadecuado de cinc durante la vida fetal y la lactancia modifica la actividad de la NOS vascular y renal en la vida adulta y evaluar si el aporte adecuado de cinc durante el crecimiento posdestete puede revertir estas alteraciones del sistema del NO.

MATERIAL Y MÉTODOS

Ratas Wistar hembra fueron apareadas con machos Wistar en edad fértil durante una semana. A partir de este momento, las madres recibieron durante los períodos de gestación y lactancia una dieta control que aportaba la dosis recomendada de cinc para esos períodos (C, 30 mg cinc/kg dieta) o una dieta baja en cinc (B, 8 mg cinc/kg dieta) para lograr una deficiencia moderada de este micronutriente.
Las crías fueron destetadas a los 21 días de vida posnatal. En ese momento, las crías macho provenientes de cada madre fueron asignadas al azar a dos grupos que recibieron una dieta control (grupos Cc y Bc) o una dieta baja en cinc (grupos Cb y Bb) durante 60 días (vida adulta).
Los animales tuvieron libre acceso a las dietas y al agua desionizada. Ambas dietas contenían los nutrientes necesarios para la etapa de crecimiento de acuerdo con lo especificado por AIN-93, excepto en el contenido de cinc. La composición de las dietas experimentales y las recomendaciones nutricionales según AIN-93 para roedores en crecimiento se detalla en la Tabla 1.

Tabla 1. Recomendaciones nutricionales para roedores en crecimiento y composición de dietas experimentales (g/kg de dieta)

Los animales fueron criados en jaulas de acrílico individuales, en un ambiente de humedad y temperatura controladas y con un ciclo luz-oscuridad de 12 horas en el Bioterio de la Cátedra de Nutrición y Bromatología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires. El cuidado de los animales se llevó a cabo según las normas de los National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, the American Physiological Society "Guiding Principles in the Care and Use of Animals," y con la regulación argentina 6344/96 de la Administración Nacional de Medicamentos Alimentos y Tecnología Médica (ANMAT).
Se determinaron los pesos corporales de las madres durante los períodos de gestación y lactancia y los pesos de las crías el día posterior al nacimiento y a los 60 días.
El consumo de alimento de las madres y de las crías se determinó como la diferencia entre el peso de alimento del día en que se llenó el comedero y el peso de alimento determinado dos días después, durante todo el experimento. El consumo de alimento de las madres y de las crías se expresó como el consumo promedio diario registrado durante los períodos estudiados.
A los 60 días se midió la presión arterial sistólica (PAS) de las crías por el método indirecto con un polígrafo Grass (model 79H, Grass Instrument Co., Quincy, MA, USA). Luego se colocaron los animales en jaulas metabólicas de acrílico para la recolección de muestras de orina durante 24 horas. Al día siguiente, luego de sacar a los animales de las jaulas metabólicas, se extrajo sangre de la cola de las ratas. La sangre fue anticoagulada con heparina y posteriormente centrifugada para obtener las muestras de plasma.

Los animales fueron sacrificados por decapitación y se les extrajeron ambos riñones y la aorta torácica para medir la actividad de la NOS, para lo cual se utilizó L-[U14C]- arginina como sustrato.
El volumen de orina se determinó gravimétricamente. El volumen de filtrado glomerular (VFG) se estimó mediante la depuración de creatinina, para lo cual se determinaron las concentraciones de creatinina en plasma y en orina por el método colorimétrico (Laboratorio Wiener).
Las concentraciones de cinc en el alimento, el plasma y el tejido renal se determinaron por espectrofotometría de absorción atómica a una longitud de onda de 213,9 nm (22) (espectrofotómetro Varian, modelo Spectr AA-20). El material de referencia NIST RM 8435 (leche entera en polvo) se sometió a un tratamiento idéntico para verificar la exactitud y reproducibilidad del método analítico. Todo el material de laboratorio se lavó previamente con ácido nítrico (20%) y agua desionizada.
La actividad de la NOS se determinó como la cantidad de [14C] L-citrulina generada a partir de [14C] L-arginina, por gramo de tejido por minuto en la arteria aorta torácica y la corteza y la médula renales como se describió previamente. (23, 24)

Análisis estadístico
Los resultados se expresaron como la media ± ESM (error estándar de la media). Se utilizó el software Prism (Graph Pad Software, Inc., San Diego CA, USA) para el análisis estadístico. Los datos se analizaron mediante ANOVA seguido a posteriori de la prueba de Bonferroni para comparaciones múltiples. Se utilizó el análisis de regresión lineal para determinar las relaciones entre el peso al nacer y la PAS a los 60 días en los grupos Cc y Bc, la actividad de la NOS en la corteza renal y el VFG a los 60 días, la PAS y el VFG a los 60 días en todos los animales. Se consideró significativo un valor de p < 0,05.

RESULTADOS

Las madres alimentadas con dieta control o baja en cinc presentaron pesos corporales similares antes del parto (C: 407 ± 16 versus B: 380 ± 23 g) y al momento del destete de las crías (C: 299 ± 10 versus B: 298 ± 7 g).
Dado que no se observaron diferencias en el consumo diario de alimento entre ambos grupos de madres durante los períodos de gestación y lactancia (gestación: C: 22 ± 2 versus B: 19 ± 2 g/día; lactancia: C: 43 ± 9 versus B: 40 ± 2 g/día), no fue necesario introducir en este trabajo un grupo de alimentación pareado (madres que reciben igual cantidad de dieta control que el que consumieron las madres con dieta baja en cinc).
Las crías macho nacidas de madres que fueron alimentadas con la dieta baja en cinc durante los períodos de gestación y lactancia presentaron pesos menores el día posterior al nacimiento con respecto a las crías nacidas de madres controles (C: 7,7 ± 0,1 versus B: 6,8 ± 0,2 g; p < 0,01). Sin embargo, al final del período de dieta (60 días), los animales expuestos a la deficiencia moderada de cinc durante el crecimiento previo y/o posterior al destete presentaron pesos corporales semejantes al grupo control (Cc: 400 ± 10 g; Cb: 379 ± 11 g; Bc: 390 ± 19 g; Bb: 373 ± 12 g).
No se observaron diferencias en el consumo diario de alimento entre los diferentes grupos experimentales (Cc: 22,2 ± 0,9 g/día; Cb: 21,3 ± 0,8 g/día; Bc: 22,9 ± 0,9 g/día; Bb: 23,0 ± 0,9 g/día), razón por la cual no fue necesario introducir en este trabajo un grupo de alimentación pareado.
En la Tabla 2 se detallan los niveles de cinc en plasma y tejido renal determinados durante el tratamiento dietético. Las crías nacidas de las madres alimentadas con una dieta baja en cinc durante la gestación y la lactancia presentaron concentraciones menores de cinc plasmático el día del destete con respecto a las crías nacidas de madres control. A los 60 días posdestete, los animales que durante el crecimiento recibieron una dieta baja en cinc (grupos Cb y Bb) mostraron concentraciones menores de cinc en plasma respecto de los animales alimentados con una dieta control (grupos Cc y Bc). La deficiencia moderada de este micronutriente indujo una reducción del contenido de cinc en el tejido renal de los animales Bb y Cb en comparación con el de las ratas Cc y Bc.

Tabla 2. Concentraciones de cinc en el plasma y el tejido renal

Los animales expuestos a la restricción de cinc durante la gestación, la lactancia y/o el crecimiento posdestete presentaron valores mayores de PAS a los 60 días con respecto al grupo control (Figura 1). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en los valores de este parámetro entre los grupos Cb, Bc y Bb. Se observó además una correlación negativa entre el peso al nacer y la PAS a los 60 días en los animales Cc y Bc (r = 0,8305; p < 0,001).


Fig. 1. Presión arterial sistólica (PAS) a los 60 días de tratamiento dietético. Cc: Madre dieta control, cría dieta control. Cb: Madre dieta control, cría dieta baja. Bc: Madre dieta baja, cría dieta control. Bb: Madre dieta baja, cría dieta baja. * p < 0,05 versus Cc; n = 10 para cada grupo.

En la Figura 2 se representan los resultados de la actividad de la NOS en la aorta torácica y el riñón de los animales Cc, Cb, Bc y Bb al final del período experimental. La restricción moderada de cinc durante la vida prenatal, la lactancia y/o el crecimiento posdestete indujo una disminución de la actividad de la NOS en la aorta torácica, la médula y la corteza renales, sin diferencias significativas en la actividad de la enzima entre los animales Cb, Bc y Bb en ninguno de los tejidos estudiados. Además, los animales Cb, Bc y Bb mostraron valores menores de VFG con respecto al grupo Cc (Figura 3) y se observó una correlación positiva entre la actividad de la NOS en la corteza renal y el VFG (r = 0,6131; p < 0,001), así como una relación inversa entre la PAS y el VFG a los 60 días (r = 0,7639; p < 0,01).


Fig. 2. Actividad de la NOS en la aorta torácica y el riñón a los 60 días de tratamiento dietético. Cc: Madre dieta control, cría dieta control. Cb: Madre dieta control, cría dieta baja. Bc: Madre dieta baja, cría dieta control. Bb: Madre dieta baja, cría dieta baja. * p < 0,001 versus Cc; n = 10 para cada grupo.


Fig. 3. Volumen de filtrado glomerular (VFG) a los 60 días de tratamiento dietético. Cc: Madre dieta control, cría dieta control. Cb: Madre dieta control, cría dieta baja. Bc: Madre dieta baja, cría dieta control. Bb: Madre dieta baja, cría dieta baja. * p < 0,01 versus Cc; n = 10 para cada grupo.

DISCUSIÓN

Los resultados de este estudio son trascendentes, ya que demuestran que la deficiencia moderada de cinc durante la vida fetal, la lactancia y/o el crecimiento induce un aumento de la presión arterial y alteraciones de la función renal en la vida adulta, asociadas con una disminución en la actividad del sistema del NO vascular y renal.
En nuestro modelo experimental se observó que la restricción moderada de este nutriente durante la vida fetal y la lactancia indujo un peso menor al nacer y un aumento de la presión arterial en la vida adulta. La correlación negativa observada entre el peso al nacer y la PAS a los 60 días están de acuerdo con muchos estudios de programación fetal en seres humanos y en animales. (25) Si bien los mecanismos involucrados no se han esclarecido hasta el momento, se postula que el crecimiento intrauterino restringido no sólo da por resultado un peso bajo al nacer, sino también en alteraciones en el desarrollo de órganos, como el riñón y el endotelio vascular, involucrados en la regulación de la presión arterial. (1, 26) En trabajos previos realizados en este modelo experimental evidenciamos una disminución en el número y en las áreas glomerulares. (15)
Por otra parte, si bien la restricción de cinc durante la preñez indujo un peso bajo al nacer, se observó que estos animales alcanzaron pesos semejantes a los de las crías nacidas de madres controles en la vida adulta. Nuestros resultados corroboran trabajos previos que indican que un crecimiento posnatal acelerado también constituye un factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares en seres humanos adultos. (27-30)
Los mecanismos que conducen al incremento de la presión arterial en los animales que durante algún período de su vida recibieron una restricción dietética de cinc parece que son diferentes y dependientes de las adaptaciones generadas durante períodos críticos del desarrollo. La relación negativa observada entre el volumen de filtrado glomerular y la presión arterial en la vida adulta sugiere que alteraciones de la función renal podrían contribuir al aumento de la presión arterial.
Nuestros resultados muestran que el bajo aporte de cinc durante la vida fetal y posnatal temprana promueve una disminución de la actividad del sistema del NO vascular y renal en la vida adulta, aun cuando el aporte adecuado de este mineral se restablezca luego del destete.
La disminución en la actividad de la NOS vascular y renal podría estar relacionada con una disponibilidad menor de cinc para la formación adecuada del cluster de cinc-tiolato, que es clave para mantener su actividad catalítica. (31)
El aumento del estrés oxidativo sistémico y renal, previamente comunicado en este modelo, podría ser uno de los factores que contribuiría a disminuir la biodisponibilidad del NO vascular y renal. (13-15) Se ha demostrado además que el aumento de las especies reactivas del oxígeno puede producir el desacople de la NOS y una síntesis menor de NO. (32-34)
Asimismo, nuestros resultados fortalecen la hipótesis de que el peso bajo al nacer y la hipertensión en la vida adulta se encuentran asociados con alteraciones de la función endotelial. En otros modelos de programación fetal se observó una alteración en la relajación vascular dependiente del NO endotelial y una actividad menor de la NOS en la arteria aorta. (35, 36)
En el presente estudio, la disminución de la actividad de la NOS en la arteria aorta torácica podría sugerir una disfunción endotelial, lo cual contribuiría al desarrollo de hipertensión arterial y podría inducir alteraciones en la capacidad de los vasos de conducción para regular cambios en el flujo sanguíneo y en las fuerzas de rozamiento.
La disminución de la actividad del sistema del NO renal a su vez podría tener un papel importante en las anormalidades hemodinámicas renales observadas en este modelo experimental. La correlación positiva entre el VFG y la producción de NO en la corteza renal sugiere que la deficiencia de cinc durante diferentes etapas del crecimiento podría contribuir a la disminución del filtrado glomerular mediante una reducción en la actividad de la NOS glomerular.
El aporte adecuado de cinc durante el crecimiento posdestete logró restituir las concentraciones de cinc renal, pero no fue suficiente para normalizar los niveles de la PAS y del VFG. Es probable que esto se deba a alteraciones inducidas in utero que no pudieron corregirse, como el número de nefronas y la actividad del sistema NO vascular y renal.
Este trabajo demuestra que la deficiencia moderada de cinc durante períodos críticos del desarrollo constituye un quebranto nutricional que puede contribuir, junto con otros factores, a determinar los valores de la presión arterial y la capacidad funcional renal en la vida adulta.

Agradecimientos

Los autores del presente trabajo agradecemos la valiosa colaboración técnica de: Luciana Veiras, Agustín González, María Débora López Ferrucci, Estefanía Prentki, Sebastián Finella (Cátedra de Fisiología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires), Adriana Weisstaub (Cátedra de Nutrición, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires), Héctor Fasoli (Facultad de Ciencias Fisicomatemáticas e Ingeniería, Universidad Católica Argentina) y la colaboración en el trabajo administrativo de Sandra Landín (IQUIMEFA-CONICET).

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