INTRODUCCIÓN

La hipercolesterolemia familiar (HF, OMIM 143890) es un trastorno hereditario autosómico dominante, que se caracteriza por una reducción de la capacidad hepática para depurar las lipoproteínas aterogénicas de baja densidad (LDL), lo que redunda en una marcada elevación de los niveles séricos de colesterol unido a LDL (cLDL). En consecuencia, la HF causa tempranamente

morbimortalidad por eventos cardiovasculares. (¹) Las herramientas de uso común para el diagnóstico

clínico de HF establecen un puntaje basado en la concentración plasmática de cLDL, la presencia de xantomas tendinosos, la aparición prematura de arco corneal, el desarrollo de enfermedad cardiovascular y los antecedentes de HF. La prevalencia de HF se estima en 1/200 a 1/500, aunque puede ser incluso mayor en determinadas poblaciones con efecto fundador. (2-3)

La HF es causada mayoritariamente por defectos en el gen codificante del receptor de LDL (LDLR). Como causas menos frecuentes de HF se señalan las mutaciones en la apolipoproteína B (APOB) -ligando del receptor

LDL- y en la proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9), involucrada en la recirculación del receptor LDL.(2-5) Las mutaciones patogénicas del LDLR pueden afectar en las diferentes etapas del ciclo del receptor: en la síntesis de la proteína, en la maduración, en la expresión en la superficie celular y en la correcta inserción en la membrana celular, así como en la unión a las LDL, la internalización o el reciclado.

Las alteraciones más graves son aquellas que conducen a una falta de producción de proteína. Estas son usualmente mutaciones que afectan la expresión y síntesis proteica (por ejemplo, cuando se introduce un codón STOP prematuro o hay mutaciones en la región promotora). (1)

Como se ha demostrado previamente, el grado en que la mutación afecta la actividad del receptor LDL puede determinar el fenotipo de los pacientes. (6) Sin embargo, la actividad del receptor LDL en un individuo puede verse influenciada por factores ambientales o por otras alteraciones génicas involucradas en el metabolismo

lipídico. (7) Por lo tanto, la relación entre la actividad

del receptor y el fenotipo no siempre es directa.

El objetivo principal del presente trabajo fue evaluar la frecuencia de mutaciones en el gen LDLR en una población con diagnóstico clínico de HF. En segundo lugar, se investigó la existencia de correlación entre el genotipo y el fenotipo. Por último, se quiso evaluar la presencia de nuevas variantes genéticas en una población argentina y así contribuir al registro de mutaciones conocidas de esta enfermedad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Selección de pacientes

Se consideraron para este estudio a todos los pacientes que consultaron en el Servicio de Lípidos de nuestro centro por una hipercolesterolemia grave (cLDL ≥ 190 mg/dL), entre enero y diciembre de 2015. Se calculó el puntaje de acuerdo con los criterios de la Dutch Lipid Clinic Network (DLCN) para el diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar en casos índices, con sospecha de presencia de esta enfermedad (9). A los pacientes con un puntaje mayor de 8 se los consideró como casos de HF definitiva y se los invitó a participar en este estudio. (9) Se excluyeron pacientes con causa clara de hipercolesterolemia secundaria (hipotiroidismo, insuficiencia renal crónica, síndrome nefrótico o colestasis), con hipertrigliceridemia

grave o en ausencia de datos clínicos fehacientes del grupo familiar.

Extracción de ADN-amplificación y secuenciación

Se realizó una extracción de 10 ml de sangre por punción venosa del antebrazo, dichas muestras se recolectaron en tubos con EDTA como anticoagulante. La extracción de ADN se efectuó por el método conocido como salting- out (precipitación

salina). El ADN obtenido se cuantificó por un método fluorométrico (QuantusTM Fluorometer, Promega), empleando el kit Quantifluords DNA System, de Promega.

Los oligonucleótidos que se utilizaron como cebadores, tanto para la reacción de amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) como para la secuenciación de los 18 exones y las regiones intrónicas adyacentes del gen LDLR (MN_0000527.4), fueron diseñados utilizando la plataforma bioinformática Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Los oligonucleótidos fueron sintetizados por la firma Invitrogen by Life Technologies, en escala de 25 nanomoles, y purificados por desalado. Los productos de amplificación se chequearon mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y purificados mediante un método enzimático, utilizando ExoSAP-IT® (Affimetrix, USB). La reacción de secuenciación completa del gen LDLR se realizó utilizando el reactivo Big Dye®Terminator v1.1 (Applied Biosystems). Tanto la reacción de amplificación como la de secuenciación se efectuaron en un equipo Gene Amp®PCR System 9700 (Applied Biosystems). Los productos secuenciados fueron purificados mediante precipitación alcohólica con etanol-isopropanol. Se utilizaron muestras de 10 voluntarios normolipidémicos

como control interno del proceso de secuenciación y en la puesta a punto de la técnica.

Análisis de secuencias y fragmentos

Las secuencias resultantes fueron analizadas con el programa Sequencing Analysis 5.3.1 (Applied Biosystems) y alineadas con la secuencia de referencia del gen LDLR (NM_0000527.4), (10) utilizando el programa SeqScape 2.5 (Applied Biosystems).

Las variantes del gen LDLR halladas en la población estudiada fueron buscadas en la base de datos Human Gene Mutation Database (HGMD®) y ClinVar (NCBI). Se utilizaron los predictores Mutation Taster (http://www.mutationtaster.org), Polyphen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2), Mutation Assesor (http://mutationassessor.org/r3/), y SIFT (www. http://sift.jcvi.org), según correspondiera. El análisis del componente ancestral, para estimar el mestizaje de la población estudiada a partir de poblaciones parentales amerindias/

europeas/africanas, se realizó utilizando el programa Admixture (https://www.genetics.ucla.edu/software/admixture/).

La representación de la distribución de las muestras en un análisis de componentes principales (Principal Component Analysis, PCA) se efectuó utilizando el programa Plink (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/).

Análisis de secuencias InDel

El componente ancestral de las muestras analizadas se estudió

aplicando el protocolo propuesto por Pereira y colaboradores.

(11) Se utilizó un conjunto de 46 marcadores informativos de inserción/deleción incluyendo tres poblaciones parentales (africana, europea y nativo-americana). Todos los marcadores fueron analizados en fragmentos cortos (< 230 pb) mediante una única PCR, seguido de la separación de dichos fragmentos por electroforesis capilar. A partir de este análisis se estimó la composición ancestral de cada uno de los individuos estudiados

por comparación con dichas poblaciones parentales.

Análisis estadístico

Las variables discretas se describieron como n y porcentaje; las variables continuas, mediante la media y la desviación estándar. Las comparaciones entre grupos se realizaron utilizando

la prueba t de Student o la prueba de Wilcoxon para las variables continuas, y X2 de Pearson y prueba exacta de Fisher para las variables categóricas, según fuera apropiado. Se aceptó un p valor de 0,05 como límite de significancia estadística.

Consideraciones éticas

Todos los participantes firmaron un consentimiento informado

antes de la toma de muestras. Se utilizaron los datos provenientes de las historias clínicas de los pacientes o los obtenidos en un interrogatorio directo al momento de la toma de muestra. Durante todas las fases del estudio se mantuvo el anonimato de los pacientes y la confidencialidad de los resultados. El estudio se llevó a cabo con la aprobación del Comité de Bioética de la Fundación Favaloro.

RESULTADOS

Se analizaron 38 pacientes como casos índices de HF, con una edad promedio de 43,4 ± 13,5 años. La mayoría

fueron de sexo masculino (68,4%). El puntaje DLCN promedio fue de 12,4 ± 3,3. Como otros factores

de riesgo cardiovascular agregados a la presencia de dislipidemia, se observó hipertensión arterial en 7 pacientes (18,4%) y diabetes mellitus tipo II en 3 pacientes (7,9%). Tres pacientes refirieron ser tabaquistas

activos (7,9%) y el mismo número refirió tener antecedentes de tabaquismo (7,9%). El antecedente de enfermedad cardiovascular en familiar de primer grado estuvo presente en el 65,8% de la población estudiada (25 pacientes). Con respecto al perfil lipídico, el nivel máximo de cLDL reportado por los pacientes (sin tratamiento

farmacológico) fue de 322,3 ± 82,7 mg/dL. El colesterol HDL (cHDL) asociado a ese laboratorio fue de 48 ± 15 mg/dL, y la concentración de triglicéridos, de 134 ± 55,7 mg/dL. La mayoría de los pacientes (27; 71,2% del total estudiado) tuvieron mediciones de Lp(a), con un valor promedio de 113,9 ± 113,2. Solo un paciente no recibía estatinas al momento del relevamiento,

debido a intolerancia muscular. La estatina más utilizada fue la rosuvastatina, seguida por la atorvastatina

y la simvastatina. Veintiocho pacientes estaban

bajo tratamiento con ezetimibe 10 mg/día. Como drogas asociadas, 4 pacientes requerían colestiramina y otros 5 fenofibrato. Bajo este esquema de tratamiento, el cLDL promedio fue de 145,9 ± 74,3 mg/dL, el cHDL promedio de 50 ± 14,7 mg/dL, y los niveles promedio de triglicéridos fueron de 112,4 ± 50,8 mg/dL.

Con la secuenciación de los 18 exones codificantes y las regiones intrónicas adyacentes del gen LDLR se evidenciaron un total de 50 variantes, de las cuales 24 (48%) se consideraron patogénicas por los predictores utilizados y comprendieron 23 pacientes. En la Tabla 1 se resumen las características clínicas asociadas a la presencia de mutación en el gen LDLR.

En cuanto a la distribución de variantes a los largo del gen LDLR, el 25% se detectaron en el exón 4, el 16,7% en el exón 12, el 12,5% en el exón 13, el 12,5% en el exón 14, el 8,3% en el exón 10, y las restantes estuvieron distribuidas en los exones 8, 9 y 15, en el intrón 12 y en la región 5’UTR. (Figuras 1A y 1B). De ellas, 8 variantes (33,3%) no se hallaron reportadas en las bases de datos consultadas. (Tabla 2)

A partir del análisis de un panel de 46 marcadores informativos para ancestralidad de tipo InDel utilizando

poblaciones de África, de Europa y de nativos americanos como poblaciones parentales, observamos que la población de individuos estudiados posee un componente ancestral predominantemente europeo (Figura 2).

DISCUSIÓN

En nuestra población, el 60,5% de los pacientes presentaron

alguna mutación sobre el gen LDLR. En los estudios que han evaluado las causas genéticas de la HF, esta frecuencia varía entre diferentes series. (12, 13) Existen varias causas por las cuales el estudio de mutaciones en este gen puede dar resultado negativo. En primer lugar, cabe señalar que en los últimos años se han vinculado nuevos genes en el diagnóstico de la enfermedad. El gen LDLRAP1 codifica una proteína adaptadora requerida para la captación hepática de las LDL, de modo que mutaciones de este gen explican una forma de HF con herencia autosómica recesiva. (14) De la misma manera, mutaciones del gen STAP1, posiblemente

relacionado con la regulación de la producción de colesterol, genera formas clínicamente indistinguibles de la HF. (15) A su vez, se ha observado que la confluencia

de variantes génicas incapaces de generar HF en forma monogénica pueden en conjunto dar un fenotipo similar; los genes comprometidos en este fenómeno han sido varios (LIPA, APOE, ABCG5/8). (16)

Es importante destacar que la mayor frecuencia de mutaciones se observó sobre el exón 4 del gen LDLR (Figura 1B) , en coincidencia con lo referido en algunos estudios realizados en países europeos. (13,17) Este dato es concordante con el análisis de ancestralidad. Los marcadores de ancestralidad son similares a los previamente publicados para la Argentina, lo que revela que nuestros pacientes con dislipidemia muestran un origen ancestral homogéneo en relación con la población

del país. (18, 19)

Las características clínicas de los pacientes portadores

de mutación son de gran relevancia; en nuestro estudio, estos individuos mostraron un peor perfil de riesgo, aun con un puntaje diagnóstico similar. (Tabla

1) En este sentido, es importante destacar el estudio de Khera y colaboradores, (20) en el cual la presencia de mutaciones relacionadas con HF asociadas a niveles de cLDL > 190 mg/dL estuvo vinculada con un OR de 22,3 (p < 0,0001), comparados con los sujetos no portadores, con cLDL < 130 mg/dL. Además, el riesgo de padecer enfermedad coronaria fue de 2 a 3 veces mayor entre los que presentaron la mutación, comparados con los que no la presentaron, aun a niveles semejantes de cLDL. (20) Por este motivo, el hallazgo de mutaciones responsables de HF está revelando un mayor riesgo para esta población.

Muchos pacientes portadores de HF están subdiagnosticados;

consecuentemente, la implementación del análisis genético para la cascada familiar es una herramienta de buena relación costo/beneficio para el análisis de los familiares de primer grado. El tratamiento

efectivo y temprano puede asociarse con una reducción del 75% del riesgo de muerte por enfermedad cardiovascular a lo largo de la vida. (21)

La lipoproteína (a) pequeña (Lpa) es un factor de riesgo independiente de enfermedad coronaria. (22) Algunos estudios han sugerido que mutaciones en el gen LDLR podrían estar relacionadas con niveles plasmáticos elevados de Lp(a); en tal sentido, se ha informado que niveles elevados de Lp(a) tendrían similar contribución al riesgo de infarto de miocardio en aquellos individuos con HF que en los que no tienen HF. Los sujetos con niveles elevados de Lp(a) podrían contribuir desproporcionadamente al estimar la preva lencia de HF si los niveles de Lp(a) no son medidos y su contribución al cLDL aparente no es tenida en cuenta. (23) Esta podría ser la causa por la cual observamos en nuestra población un aumento de Lp(a) en aquellos individuos sin mutación detectada.

Consideramos que la falta de estudio de los genes APOB y PCSK9 constituye una limitación del presente análisis. Sin embargo, estas mutaciones son minoritariamente

responsables de la enfermedad, ya que representan menos del 10% del total. (24) De hecho, otros grupos solo analizan mutaciones del gen LDLR en sus estudios poblacionales. (25, 26)

La detección de grandes desarreglos génicos se realiza por medio de la técnica conocida como MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), lo cual complementa el diagnóstico cuando no se encuentran

mutaciones puntuales. Si bien esta técnica no fue incluida en nuestro análisis, nuevamente, la presencia de este tipo de mutaciones es poco frecuente para explicar la HF, aunque es bien conocido su efecto deletéreo sobre la función normal de la proteína receptora

de LDL. Este tipo de desarreglo génico representa el 1,4% en la base de datos del American College of Medical Genetics and Genomics. (25)

En conclusión, el hallazgo de nuevas variantes génicas

en una población de nuestro medio con diagnóstico

clínico de HF resalta la importancia de continuar estudiando las bases genéticas de esta enfermedad en la Argentina. Más aún, considerando que el análisis del componente ancestral demostró ser mayoritariamente europeo, se podría presumir erróneamente que la población

portadora presenta un espectro de variantes génicas conocidas y estudiadas. La identificación de una variante génica puntual de cada caso índice facilitará el diagnóstico genético familiar en cascada con una metodología simplificada de bajo costo. Consideramos que la utilización de estos métodos diagnósticos puede ser de gran utilidad en la identificación temprana de pacientes portadores de HF, lo que puede contribuir a reducir el riesgo que estos individuos tienen de desarrollar

esta patología metabólica.

Declaración de conflicto de intereses

Los autores declaran que no poseen conflicto de intereses. (Véanse formularios de conflicto de intereses de los autores en la web/ Material suplementario).

Agradecimientos

Queremos agradecer la colaboración de la Licenciada en Ciencias Biológicas María Laura Parolín, por su aporte en el análisis de datos de ancestralidad, y la de la Licenciada en Ciencias Biológicas Luciana Kaeser, por su intervención en el diseño de las estrategias de secuenciación y análisis de secuencias.

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