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INTRODUCCIÓN
Las enfermedades cardiovasculares son una de las mayores causas de morbilidad y mortalidad del mundo occidental y están relacionadas con patologías como la diabetes mellitus, la dislipidemia y la hipertensión; también con hábitos tóxicos como el tabaquismo y el consumo de alcohol, entre otros. 1 En los últimos años, sin embargo, se han investigado nuevos factores de riesgo que no se relacionan con el estilo de vida de los pacientes, sino con el proceso inflamatorio, cuyo mecanismo es clave para la formación de la placa ateroesclerótica. 2 Tal es el caso de mutaciones encontradas en interleucinas (IL), moléculas que participan en el proceso inflamatorio.3 Las interleucinas IL-1 e IL-6, por ejemplo, son péptidos señalizadores producidos como consecuencia de la agresión a un tejido, y ocasionan la respuesta inflamatoria.
Varios estudios han demostrado que existen algunos polimorfismos de nucleótidos simple de las interleucinas IL-1 e IL-6 que presentan asociación con la cardiopatía isquémica, los más estudiados son IL-1β C-511T (Rs16944), IL-1β C+3953T (Rs1143634), IL-6 G-174C (Rs1800795) e IL-6 G-572C (Rs1800796). El objetivo de este trabajo fue relacionar los cuatro polimorfismos de IL-6 e IL-1 antes mencionados con el riesgo de presentar cardiopatía isquémica (CI), en una muestra de la población ecuatoriana.
MATERIAL Y MÉTODOS
Población de estudio
Se diseñó un estudio de casos y controles. El grupo de casos estuvo conformado por 76 pacientes que cumplieron con criterios para el diagnóstico de CI, los cuales se tomaron de las guías de l a ACCF/AHA. Estos criterios fueron los siguientes: dos episodios de angina en reposo o un episodio de más de 20 minutos de duración en las últimas 48 horas, elevación del segmento ST diagnosticado por electrocardiografía (EKG) durante la angina, con movilización o no de enzimas de isquemia cardíaca (CK-Mb/troponina T), estenosis mayor del 50% demostrado por angiografía.
El grupo control estuvo conformado por 76 individuos sin antecedentes de enfermedad cardíaca, que acudieron por motivo de consulta distinto a la cardiopatía isquémica. En ambos casos los individuos fueron ecuatorianos, seleccionados en el servicio de hemodinámica del Hospital Carlos Andrade Marín de la ciudad de Quito, en el período agosto de 2014 a diciembre de 2015.
Obtención de ADN y genotipificación
Las muestras de sangre venosa fueron recogidas en tubos con EDTA para obtener ADN genómico. Este fue aislado a partir de los leucocitos, utilizando el kit comercial Wizard Genomic DNA Purification Kit. El ADN fue cuantificado por espectrofotometría a 260 nm y 280 nm en el equipo NanoDrop 2000®, de Thermo Scientific, y diluido hasta una concentración de 20 ng/µL.
La región del ADN que contiene el sitio polimórfico fue amplificada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se obtuvo un volumen final de 25 µL para cada muestra (polimorfismos Il-1 e Il-6): 12,5 µL de GoTaq® Green Master Mix (Promega), 0,5 µL de primer FW y 0,5 µL de primer RV (Invitrogen), 3 µL de DNA y 8,5 µL de agua UltraPure™ libre de nucleasas (Invitrogen). Los parámetros del ciclado para IL-1 fueron 94 °C por 3 minutos y luego 35 ciclos de 95 °C por 2 minutos, 53 °C por 1 minuto y 74 °C por 1 minuto, seguidos de una a extensión final a 72 °C por 5 min. Los parámetros del ciclado para IL-6 fueron 94 °C por 10 minutos y luego 35 ciclos de 95 °C por 1 minuto, 55 °C por 1 minuto 35 segundos y 72 °C por 1 minuto, seguidos de una a extensión final a 72 °C por 10 min. Los productos de amplificación fueron digeridos con enzimas de restricción específicos, luego separados por electroforesis horizontal en geles de agarosa (2,5 % p/v) teñidos con Gel Stain (Lonza). Los primers y las enzimas utilizadas se detallan en la Tabla 1.
Tabla 1 Secuencia de primers y enzimas de restricción utilizadas para la detección de los polimorfismos en IL-1 e IL-6.
| Polimorfismo | Identificación SNP | Secuencia del primer | Fragmento | Enzima | Tamaño del fragmento digerido (pb) | Referencia | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| N | H | M | ||||||
| IL-1β C-511T | rs16944 | FW: TGG CAT TGA | 305 pb | Ava I | 305 | 305, 190, 115 | 190,115 | 5 |
| TCT GGT TCA TC | ||||||||
| RV: GTT TAG GAA | ||||||||
| TCT TCC CAC TT | ||||||||
| IL-1β C+3953T | rs1143634 | FW: GTT GTC ATC | 249 pb | Taq I | 249 | 249,135,114 | 135, 114 | 20 |
| AGA CTT TGA CC | ||||||||
| RV: TTC AGT TCA TAT | ||||||||
| GGA CCA GA | ||||||||
| IL-6 G-174C | rs1800795 | FW: TGA CTT CAG CTT | 198 pb | SfaNI | 198 | 198, 140, 58 | 140,58 | 19 |
| TAC TCT TGT | ||||||||
| RV: CTG ATT GGA AAC | ||||||||
| CTT ATT AAG | ||||||||
| IL-6 G-572C | rs1800796 | FW: GGAGACGCCTTGAA | ||||||
| GTAACTGC | ||||||||
| RV: GAGTTTCCTCTGACT | 163 pb | MbiI | 163 | 163, 88, 75 | 88,75 | 21 | ||
| CCATCGCAG | ||||||||
FW: primer forward, RV: primer reverse, N: homocigoto normal, H: heterocigoto, M: homocigoto mutado.
Análisis estadístico
El tamaño de la muestra se calculó sobre la base de un nivel de confianza del 95%, para un poder del estudio del 80%. La frecuencia esperada de exposición en los controles fue de 32% y en los casos de 60%, y se le añadió un 20% más considerando pérdida y error.
Se desarrolló un estudio analítico retrospectivo de casos y controles. El análisis estadístico se realizó en el programa SPSSv23. Las diferencias en las frecuencias de los alelos y otras variables categóricas se compararon entre casos y controles con el test de Pearson x2 o test de Fisher. Se calculó tanto el OR como la regresión logística, considerando un valor de p < 0,05 como medida de significancia.
Mediante el análisis de Chi cuadrado se analizó si la población en estudio está en equilibrio de Hardy-Weinberg para los polimorfismos estudiados.
Consideraciones éticas
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador y por el Comité de Investigación en Salud del HCAM, y cumple con los lineamientos de la declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes.
RESULTADOS
La población de casos y controles estuvo compuesta por sujetos entre 40 y 70 años; sin embargo, la población de casos presentó mayor edad que la población de controles. Tanto en los casos como en los controles prevaleció el género masculino. En los casos hubo una mayor prevalencia de diabetes, hipertensión, dislipidemia y consumo de alcohol y tabaco (Tabla 2). Mediante el análisis de Chi cuadrado se obtuvieron valores que muestran que la población está en equilibrio de Hardy-Weinberg para los polimorfismos estudiados, excepto para el polimorfismo IL-6 G-174C (X2 = 1551,45).
Tabla 2 Características clínicas de los casos con cardiopatía isquémica y los controles
| Variables | Casos n = 76 | Controles n = 76 | Valor de p |
|---|---|---|---|
| Edad | 64,7 ± 12 | 57,5 ± 12 | b |
| Masculino | 66 (86,84%) | 52 (68,42%) | a |
| Femenino | 10 (13,16%) | 24 (31,58%) | a |
| HTA | 44 (57,89%) | 28 (36,84%) | b |
| DM 2 | 25 (32,89%) | 12 (15,79%) | a |
| Dislipidemia | 46 (60,53%) | 18 (23,6%) | b |
| Alcohol | 40 (52,63%) | 18 (23,7%) | b |
| Tabaco | 36 (47,37%) | 23 (30,26%) | a |
HTA: Hipertensión Arterial; DM 2: Diabetes mellitus 2; n: número de la población, a: p<0,05; b: p<0,01; NS: No significativo.
El genotipo CC del polimorfismo IL1β -511 se presentó con mayor frecuencia en los casos con cardiopatía isquémica (17,11%) al compararlo con los controles (11,84%), el OR fue de 1,53 (IC95%: 0,61-3,84; p = 0,05). También se encontró una diferencia significativa en el genotipo GG del polimorfismo IL-6-174, que se presentó con mayor frecuencia en los casos con cardiopatía isquémica (73,68%) al compararlo con los controles (40,79%), con un OR de 4 (IC95%: 2,04-8,06; p < 0,001) (Tabla 3).
Tabla 3 Frecuencias genotípicas de los polimorfismos IL-1β C-511T, IL-1β C+3953T, IL-6 G-174C e IL-6 G-572C en los casos con cardiopatía isquémica y los controles.
| Genotipos | Casos n = 76 | Controles n = 76 | Valor de p | OR (IC al 95%) |
|---|---|---|---|---|
| IL-1B C-511T | ||||
| TT | 33 (43,42%) | 48 (63,16%) | NS | 0,47 (0,24-0,90) |
| TC | 30 (39,40%) | 19 (25%) | NS | 1,95 (9,97-3,91) |
| CC | 13 (17,11%) | 9 (11,84%) | NS | 1,53 (0,61-3,84) |
| TT+TC vs CC | NS | 0,65 (0,26-1,62) | ||
| TT vs TC+CC | a | 0,44 (0,23-0,85) | ||
| IL-1B C-3953T | ||||
| TT | 0 (0%) | 4 (5,26%) | a | 1,05 (1,00-1,11) |
| TC | 14 (18,42%) | 11 (14,47%) | NS | 1,33 (0,56-3,16) |
| CC | 62 (81,58%) | 61 (80,26% ) | NS | 1 (0,44-2,27) |
| TT+TC vs CC | NS | 0,92 (0,48-2,06) | ||
| TT vs TC+CC | a | 0,00 (0,00-1,09) | ||
| IL-6 G-174C | ||||
| CC | 5 (6,58%) | 32 (42,11%) | b | 0,09 (0,03-0,26) |
| GC | 15 (19,74%) | 13 (17,11%) | NS | 1,19 (0,52-2,71) |
| GG | 56 (73,68%) | 31 (40,79%) | b | 4,06 (2,04-8,06) |
| CC+GC vs GG | b | 0,24 (0,12-0,48) | ||
| CC vs GC+GG | b | 0,09 (0,03-0,26) | ||
| IL-6 G-572C | ||||
| CC | 12 (15,79%) | 18 (23,68%) | NS | 0,6 (026-1,36) |
| GC | 31 (40,79%) | 31 (40,79%) | NS | 1 (0,52-1,91) |
| GG | 33 (43,42%) | 27 (35,53%) | NS | 1,39 (0,72-2,67) |
| CC+GC vs GG | NS | 0,71 (0,37-1,37) | ||
| CC vs GC+GG | NS | 0,60 (0,26-1,36) |
a: p < 0,05; b: p < 0,01; NS: No Significativo; n = número de la población
Se realizó el análisis de regresión logística (Tabla 4) para determinar los predictores más importantes de cardiopatía isquémica. El genotipo GG del polimorfismo IL-6 -174 se asoció con un incremento del riesgo de presentar cardiopatía isquémica en esta muestra de la población ecuatoriana. Esta asociación genotípica es independiente de otros factores de riesgo usuales, como el alcoholismo y la dislipidemia, que también presentaron una asociación significativa. No se halló ninguna asociación de riesgo significativa con los otros polimorfismos.
Tabla 4 Regresión logística para el riesgo de presentar cardiopatía isquémica
| Variable | B | Error estándar | Wald | OR | IC 95% | Valor de p |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Alcohol | 1,098 | 0,495 | 4,931 | 3,58 | 1,78-7,17 | a |
| Tabaco | 0,75 | 0,506 | 2,2 | 2,07 | 1,06-4,03 | NS |
| HTA | 0,475 | 0,441 | 1,159 | 2,35 | 1,22/4,55 | NS |
| DM2 | 0,624 | 0,499 | 1,569 | 2,61 | 1,19-5,70 | NS |
| Dislipidemia | 1,423 | 0,443 | 10,299 | 4,94 | 2,45-9,95 | b |
| IL6 -174 GG | 0,38 | 0,529 | 0,517 | 4,065 | 2,04-8,06 | b |
IL6-174GG VS GC+CC; HTA: Hipertensión arterial; DM 2: Diabetes mellitus 2; a: p < 0,05; b: p < 0,01; NS: No Significativo
DISCUSIÓN
En nuestra población, las comorbilidades más frecuentemente asociadas a la cardiopatía isquémica fueron la hipertensión arterial (HTA), la dislipidemia y la diabetes mellitus tipo 2 (DM 2), en concordancia con lo referido en poblaciones de Italia, Brasil y otros países de Latinoamérica. 4,5,6
Respecto del análisis de los polimorfismos IL-1β C-511T (Rs16944), IL-1β C+3953T (Rs1143634), IL-6 G-174C (Rs1800795) e IL-6 G-572C (Rs1800796), los resultados determinaron que únicamente hubo relación estadísticamente significativa entre la presencia del genotipo GG del polimorfismo IL-6 G-174C (Rs1800795) y la manifestación de eventos coronarios (OR = 4,06; IC95%: 2,04-8,06; p < 0,001).
El genotipo CC del polimorfismo IL-1β C-511T (rs16944) presentó un valor de p = 0,05 cuya significancia podría ser discutible.7
Un estudio en Brasil muestra que el genotipo GG se asocia con un riesgo incrementado de presentar enfermedad coronaria (OR = 2,037; p = 0,028). 8 En ese estudio, la distribución genotípica mostró una frecuencia de presentación del 69,6% en los casos contra un 60% en la población control. Estos resultados concuerdan con lo observado en nuestra investigación, donde la frecuencia para este genotipo en los casos fue del 73,68% y en los controles del 40,79%.
La explicación de este hecho se basa en que la interleucina 6 es una citocina pro-inflamatoria, por ende, los portadores de polimorfismos en su secuencia codificante tienen una susceptibilidad incrementada para el desarrollo de enfermedad isquémica cardíaca. 9 Se considera que la IL-6 promueve el camino de la aterosclerosis.
En una muestra de 106 pacientes turcos con síndrome coronario agudo (SCA), Ozdemir et al. hallaron una frecuencia del 82% para el homocigoto GG. Además, en los pacientes que presentaron el polimorfismo IL-6 G-174C, el 31% desarrollaron lesión multivaso vs. el 8% que se manifestó con lesión única durante la angiografía coronaria (p < 0,05). En esa investigación se demostró una relación entre el polimorfismo y la gravedad del compromiso coronario. Aquellos pacientes con el genotipo GG presentaron un mayor tiempo de hospitalización y complicaciones más graves a causa de una titulación plasmática superior de los valores de IL-6. 10
Diversas investigaciones han buscado correlacionar los valores de IL-6 y la gravedad de la patología coronaria, bajo la suposición de que los niveles séricos de IL-6 son superiores conforme el compromiso vascular aumenta. Deliargyris et al. muestran que la IL-6 es producida en la circulación coronaria de los pacientes con angina inestable, pero no en los pacientes con angina estable. 11 Un estudio realizado en Turquía describe niveles superiores de IL-6 y proteína C reactiva en pacientes que desarrollaron un infarto agudo de miocardio en comparación con quienes presentaron una cardiopatía isquémica estable. 10 Se ha demostrado que los niveles plasmáticos de IL-6 son superiores en pacientes portadores del genotipo GG del polimorfismo IL-6 G-174C. 12,13,14
En relación con el polimorfismo IL-6 G-174C, nuestros resultados concuerdan con los hallazgos de otros investigadores 6,8,12,13,15; sin embargo, vale la pena mencionar que otros estudios han realizado una asociación del genotipo CC con el riesgo de enfermedad cardiovascular, en lugar de encontrarla con el genotipo GG. 16,17,18 Como menciona M. Libra, “este conflicto de resultados sugiere que la relación del polimorfismo IL-6 G-174C con el desarrollo de enfermedades cardiovasculares es compleja”. 19
CONCLUSIONES
En el grupo de pacientes estudiados, la presencia del genotipo GG del polimorfismo IL-6 G-174C confiere un riesgo 4 veces superior de desarrollar cardiopatía isquémica. Consideramos necesario extender la investigación a una muestra más amplia y diversa, que permita generalizar los resultados a toda la población del Ecuador.
