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INTRODUCCIÓN
La hipótesis de que la disfunción del tejido adiposo perivascular (TAPV) constituye un proceso fisiopatológico común que podría vincular las enfermedades metabólicas y cardiovasculares se hace cada vez más fuerte, y es uno de los nuevos objetivos terapéuticos para tener en cuenta. 1,2,3
Los modelos experimentales en ratas con dietas nutricionalmente desequilibradas como la dieta alta en grasas y sobrecarga de fructosa se asemejan a los trastornos característicos del síndrome metabólico humano 4,5,6 y resultan esenciales para comprender aspectos fisiopatológicos de este síndrome, así como su utilización para estudios farmacológicos. 7
El lecho vascular mesentérico permaneció casi sin relevancia clínica, pero es importante considerarlo ya que está formado por arterias de resistencia y el TAPV consiste principalmente en tejido adiposo visceral blanco el cual posee mayor potencial patogénico. Además, es una fuente de prostanoides que incluye prostaglandinas (PG) y tromboxanos (TX) que participan en la regulación del tono vascular. 8,9 Previamente hemos encontrado un patrón alterado de liberación de prostanoides en los vasos mesentéricos. 10
Tanto el losartán como la metformina son fármacos ampliamente establecidos utilizados en la práctica clínica diaria para el tratamiento de la hipertensión arterial y el síndrome metabólico, pero se les reconocen efectos pleiotrópicos que siguen generando gran interés. 11,12
En este contexto, el objetivo de este trabajo fue analizar los efectos de losartán y metformina sobre el índice de adiposidad y la liberación de prostanoides del lecho vascular mesentérico, así como su relación con la presión arterial sistólica (PAS) en un modelo de síndrome metabólico inducido por una dieta alta en grasa y sobrecarga de fructosa en la rata.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se utilizaron ratas Sprague-Dawley machos de seis semanas de edad que pesaban 180-210 g al comienzo del experimento divididos aleatoriamente en seis grupos (n = 6 cada uno) para el estudio durante 9 semanas: C (control), dieta estándar para roedores (Asociación Cooperativas Argentinas, con la siguiente composición [P/P]: 20% de proteínas, 3% de grasas, 2% de fibras, 6% de minerales y 69% de almidón y suplementos vitamínicos) y agua corriente para beber; DGF (dieta alta en grasa + sobrecarga oral de fructosa), 50% (p/p) de grasa bovina adicionada a la dieta estándar para roedores (elaborada en nuestro laboratorio) y solución 10% P/V de fructosa para beber; CL y DGFL tratadas con losartán 30 mg/kg/día en la bebida; CM y DGFM tratadas con metformina 500 mg/kg/ día en la bebida. Todos los animales tuvieron libre acceso al agua y a la comida durante toda la duración del experimento. Los tratamientos dietarios y farmacológicos comenzaron al mismo tiempo. Las dosis de losartán y metformina se eligieron de acuerdo con estudios previos y bibliografía. 10,13,14,15,16,17 Se usó losartán y metformina del grado comercial más alto disponible se compraron en la Droguería Saporiti SACIFIA (Buenos Aires, Argentina).
Determinación de la presión arterial
Los animales fueron entrenados tres veces por semana. La PAS se determinó antes de comenzar el estudio y al final del período experimental a través de un método pletismográfico indirecto por medio de un esfigmomanómetro en la cola de la rata, usando un manguito inflable y un micrófono conectado a un amplificador Grass DC (modelo 7 DAC, Grass Instruments Co.) acoplado a un polígrafo (modelo 79 D, Grass Instruments Co.).
Determinación del peso corporal y del índice de adiposidad del lecho vascular mesentérico
El peso corporal de las ratas se controló durante todo el período de estudio. El aumento de peso corporal se calculó como la diferencia entre el peso corporal al final y al comienzo del tratamiento. El índice de adiposidad del lecho vascular mesentérico se calculó como el peso de la grasa del lecho vascular mesentérico/peso corporal final × 100.
Determinación de parámetros metabólicos en sangre
Al final del tratamiento, todos los animales ayunaron durante 5 h e inmediatamente antes del sacrificio se recogieron muestras de sangre del seno retroorbital bajo anestesia ligera (xilazina 2 mg/kg y ketamina 60 mg/kg intraperitoneal) y se centrifugaron a 2700 rpm durante 20 min a 4 °C. Se determinaron: glucemia (ACCU-Check®, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), niveles plasmáticos de triglicéridos con equipo comercial (TG Color GPO/PAP AA, Wiener Labs, Rosario, Santa Fe, Argentina) por espectrofotometría e insulina por ELISA (Millipore Corporation, Billerica, MA, EE.UU.). El modelo de evaluación de la homeostasis de la resistencia a la insulina (HOMA-IR) se calculó después del tratamiento utilizando la siguiente ecuación: HOMA = glucosa en ayunas (mmol / L) × insulina en ayunas (mIU l-1) /22,5. 18
Determinación de la liberación de prostanoides
El lecho vascular mesentérico (que incluye tejido adiposo perivascular y vasos sanguíneos) de los animales de todos los grupos se diseccionó y se transfirió a una placa de Petri con solución de Krebs (mmol/L), NaCl 118, KCl 4,7, MgSO4 1,2, NaH2PO4 1,0, CaCl2 2,6, NaHCO3 25,0, glucosa 11,1, y se incubaron durante 60 min a 37 °C. Luego, se extrajeron los lechos vasculares mesentéricos y se pesaron. Para medir la liberación de prostanoides, al final del período de incubación, el medio se acidificó a pH 3,5 con 1 mol/L de ácido fórmico y se extrajo tres veces con dos volúmenes de cloroformo. Las fracciones clorofórmicas se agruparon y se evaporaron a sequedad. Se realizó cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) de fase inversa en una columna (BBS Hypersil C18, Thermo Electron Co., Bellefonte, PA, EE. UU.). El sistema disolvente era 1,7 mmol/L de H3PO4 67,2: acetonitrilo 32,8 v/v. La velocidad de flujo fue de 1 ml/min, y la absorción UV fue de 218 nm. Las muestras secas se resuspendieron en 0,15 mL de la fase móvil y se inyectaron en el sistema de HPLC. Los patrones auténticos de los prostanoides 6-ceto prostaglandina (PG) F1a (metabolito estable de PGI2 o prostaciclina), PGE2, PGF2α y tromboxano (TX) B2 (metabolito estable de TXA2) (Sigma Chemical Co., Saint Louis, MO, EE. UU.) se corrieron junto con las muestras, y se realizó un ensayo de soporte para determinar la cantidad de prostanoides. Todos los valores fueron corregidos para la pérdida de recuperación según lo determinado por estándares paralelos. Los resultados se expresaron como nanogramos de prostanoide por miligramo de peso de tejido húmedo.
Análisis estadístico
Los datos se procesaron con el programa de software InfoStat, versión 2018, FCA, Argentina. Las comparaciones intergrupales fueron realizadas por ANOVA seguido de prueba Tukey. Los coeficientes de correlación de Pearson (r) de los puntos de datos a partir de ratas experimentales se calcularon por regresión lineal. Todos los resultados se expresan como media ± SEM. Un valor de P inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Consideraciones éticas
Los experimentos fueron aprobados previamente por el comité de ética local sobre investigación animal (CICUAL, Comité Institucional para el Cuidado y uso de Animales de Laboratorio, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Res. N° 2259). Todos los animales incluidos en los protocolos experimentales fueron manejados y alojados de acuerdo con las recomendaciones contenidas en las directrices CICUAL de acuerdo con las normas éticas de regulaciones internacionales y principios de cuidado y uso de animales experimentales.
RESULTADOS
Efectos del losartán y de la metformina sobre la glucosa, triglicéridos, insulina y HOMA-IR
Al final del tratamiento, las ratas alimentadas con una dieta alta en grasa y sobrecarga de fructosa mostraron niveles plasmáticos significativamente más altos de glucosa, triglicéridos e insulina, así como del índice HOMA-IR en comparación con el grupo control (DGF vs. C, p < 0,01; Tabla 1). La administración tanto del losartán como de metformina atenuaron todas estas alteraciones a las 9 semanas de tratamiento (DGFL vs DGF, DGFM vs DGF, p < 0,01, p < 0,05; Tabla 1) en el grupo de dieta alta en grasa y sobrecarga de fructosa.
Tabla 1 Presión arterial sistólica, índice de adiposidad del lecho vascular mesentérico, ganancia de peso, triglicéridos, glucemia, insulina e índice de HOMA-IR.
| PAS | Índice de adiposidad | Ganancia de peso | Triglicéridos | Glucemia | Insulina | HOMA-IR | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| (mmHg) | (%) | (g) | (mg/dL) | (mg/dL) | (ng/mL) | ||
| C | 119 ± 2 | 0,7 ± 0,1 | 182 ± 4 | 65 ± 9 | 116 ± 3 | 1,2 ± 0,1 | 0,1 ± 0,003 |
| CL | 108 ± 1† | 0,7 ± 0,06 | 187 ± 10 | 66 ± 8 | 119 ± 4 | 0,9 ± 0,1 | 0,1 ± 0,01 |
| CM | 122 ± 1 | 0,6 ± 0,07 | 177 ± 4 | 56 ± 9 | 117 ± 3 | 1,3 ± 0,2 | 0,1 ± 0,02 |
| DGF | 150 ± 3* | 1,8 ± 0,1* | 308 ± 21* | 188 ± 16* | 141 ± 3* | 3,4 ± 0,4* | 0,4 ± 0,05* |
| DGFL | 112 ± 1‡ | 1,0 ± 0,05‡ | 169 ± 13‡ | 74 ± 8‡ | 131 ± 4 | 1,6 ± 0,2‡ | 0,1 ± 0,03§ |
| DGFM | 125 ± 1‡ | 1,3 ± 0,04‡ | 175 ± 9‡ | 64 ± 6‡ | 126 ± 2‡ | 1,3 ± 0,4‡ | 0,1 ± 0,05§ |
Los valores se indican como promedio ± ESM. C: Control; DGF: Dieta alta en grasas y sobrecarga de fructosa; CL: Control + losartán; DGFL: Dieta alta en grasas y sobrecarga de fructosa + losartán; CM: Control + metformina; DGFM: Dieta alta en grasas y sobrecarga de fructosa + metformina; PAS: Presión arterial sistólica. HOMA-IR: Homeostasis de la resistencia a la insulina. *p < 0,01 vs. C, CL, CM; † p < 0,01 vs. C; ‡ p < 0,01 vs. DGF; § p < 0,05 vs. DGF.
Efectos del losartán y de la metformina sobre la presión arterial sistólica, índice de adiposidad del lecho vascular mesentérico y ganancia de peso corporal
Las ratas alimentadas con una dieta rica en grasas y con sobrecarga de fructosa exhibieron un aumento significativo en la PAS, el índice de adiposidad del lecho vascular mesentérico y la ganancia de peso corporal en comparación con el grupo control (DGF vs C, p < 0,01; Tabla 1). Por su parte, el losartán disminuyó la PAS en el grupo control (CL vs C, p < 0,01; Tabla 1). Además, hemos encontrado que el aumento en el índice de adiposidad del lecho vascular mesentérico se correlaciona positivamente con la presión arterial sistólica (r = 0,82, p < 0,01; Figura 1). Los tratamientos farmacológicos no solo previnieron el aumento de la PAS, sino que también previnieron el aumento del índice de adiposidad del lecho vascular mesentérico y la ganancia de peso corporal en ratas alimentadas con una dieta alta en grasas y sobrecarga de fructosa (DGFL vs DGF, DGFM vs DGF, p < 0,01; Tabla 1).
Efectos del losartán y de la metformina sobre la liberación de prostanoides del lecho vascular mesentérico
La DGF aumentó la liberación de los prostanoides vasoconstrictores, el tromboxano B2 y de la prosta-glandina F2α (ng PR/mg de tejido, DGF vs C, p < 0,01, Figura 2 y Figura 3) respecto al grupo control. Por otro lado, hemos encontrado que los aumentos de ambos prostanoides se correlacionan positivamente con el incremento de la PAS (TXB2: r = 0,89, p < 0,01; PGF2α: r = 0,80, p < 0,01) y un mayor índice de adiposidad del lecho vascular mesentérico (TXB2: r = 0,90, p < 0,01 y PGF2α: r = 0,84, p < 0,01). Estos incrementos fueron prevenidos tanto con el losartán (ng PR/mg de tejido, DGFL vs DGF, TXB2: p < 0,01, Figura 2; PGF2alfa: p < 0,05, Figura 3) como con la metformina (ng PR/mg de tejido, DGFM vs DGF, TXB2: p < 0,05, Figura 2; PGF2alfa: p < 0,05, Figura 3).
A su vez, la DGF aumentó significativamente la liberación de la prostaglandina (PG) E2 (ng/mg, DGF vs C, p < 0,01, Figura 4), un marcador de inflamación, respecto al grupo control. Además, hemos encontrado que este aumento se correlaciona positiva y significativamente con un incremento de la PAS (r = 0,75, p < 0,01, Figura 5) y con el índice de adiposidad del lecho vascular mesentérico (r = 0,82, p < 0,01). Ambos tratamientos farmacológicos previnieron dicho aumento (ng PR/mg de tejido, DGFL vs DGF, DGFM vs DGF, p < 0,05, Figura 4).
La relación PGI2/TXA2 (medida como sus metabolitos estables) se redujo significativamente por la dieta alta en grasas y sobrecarga de fructosa a las 9 semanas de tratamiento en comparación con el grupo control (DGF vs C, p < 0,01, Figura 6). Losartán como metformina atenuaron la disminución de esta relación (DGFL vs DGF, DGFM vs DGF, p < 0,01, Figura 6).
DISCUSIÓN
El presente estudio es la primera evidencia reportada del efecto preventivo del losartán y de la metformina sobre el aumento de la adiposidad del lecho vascular mesentérico y la liberación de prostanoides vasoconstrictores (TXB2 y PGF2α) e inflamatorios (PGE2) en un modelo experimental de síndrome metabólico inducido por la combinación de dos dietas que refleja más adecuadamente los parámetros de consumo de las sociedades actuales. Además, mostramos el efecto beneficioso de ambos fármacos en la disminución de la relación PGI2/TXA2, un marcador de disfunción endotelial.
Con respecto a los resultados en el índice de adiposidad, hemos encontrado diferentes criterios para la selección de grasas viscerales para determinar las alteraciones en la masa de tejido adiposo blanco. Mourand y cols. 19 informaron el efecto de losartán sobre la proporción de grasa visceral/músculo gastrocnemio considerado como un índice de composición corporal. Tikko y cols. 20 mostraron que la proporción de tejido adiposo blanco/peso corporal aumentó en ratas alimentadas con una dieta alta en grasas y que el tratamiento con metformina disminuyó ese parámetro. Sin embargo, ninguno de ellos especifica el órgano donde se midió el tejido adiposo blanco. Wang y cols. 21 encontraron que las ratas SHR (otro modelo experimental) tratadas con losartán en una dieta alta en grasas exhibieron una disminución significativa en el peso del depósito de grasa mesentérico/peso corporal (%).
La acumulación de grasa ectópica en TAPV puede ser relevante para la patogénesis de la hipertensión arterial asociada a la resistencia a la insulina. 22 Uno de los posibles mecanismos involucrados podría deberse a la disfunción del TAPV (de acuerdo con el lecho vascular específico) inducida por una dieta alta en grasas y sobrecarga de fructosa que produce cambios en la cantidad y en el patrón de expresión de los factores vasoactivos, lo que contribuye a la propensión de los vasos a desarrollar enfermedades vasculares. Tanto el aumento de la masa como la falta del efecto anticontráctil del TAPV inducido por la alimentación con alto contenido de grasa podrían producirse por un desequilibrio en la liberación de adipocinas, inflamación, estrés oxidativo y disfunción endotelial. 23,24,25
Los prostanoides son fundamentales para la fisiología endotelial y el interés en sus posibles acciones sobre los vasos sanguíneos ha ido en aumento. Hoy se sabe que estas sustancias pueden derivar no solo del endotelio, sino también del TAPV, considerado parte de la estructura vascular con función paracrina. El aumento de los prostanoides vasoconstrictores puede estar relacionado con una producción aumentada de especies reactivas de oxígeno, que parecen jugar un papel importante en la alteración vascular inducida por el tejido adiposo perivascular. Esto conduciría a una disminución en la expresión de eNOS que afecta la biodisponibilidad de NO, lo que contribuye a la disfunción endotelial, que se correlacionaría con la disminución de AMPK. 26,27,28
De acuerdo con nuestros resultados, Matsumoto y cols. 29 informaron previamente que la metformina redujo significativamente la presión arterial y disminuyó la liberación de TXB2 y PGE2 en las arterias mesentéricas estimuladas por acetilcolina de ratas OLETF, un modelo experimental de diabetes mellitus tipo 2 hipertensiva. Por otra parte, encontraron que la liberación de prostanoides estimulada por el endotelio (6-ceto-PGF1α, PGE2, PGF2α y TXB2) en el anillo de las arterias mesentéricas se suprimió significativamente en el grupo OLETF tratado con losartán. 30
La metformina es un activador de AMPK, que regula el metabolismo de los adipocitos y la estructura y función vascular. 31,32,33 Por otro lado, el TAPV de las arterias mesentéricas presenta un sistema renina-angiotensina local con alta densidad de receptores de angiotensina II tipo 1 (AT1). 34,35,36
CONCLUSIONES
En conclusión, tanto el losartán como la metformina ejercen efectos beneficiosos, más allá de su efecto anti-hipertensivo e insulinosensibilizante, respectivamente, sobre el tejido adiposo perivascular que mejoran la disfunción endotelial inducida por el desbalance de sustancias vasoactivas en el lecho vascular mesentérico en este modelo experimental dietario.
