INTRODUCCIÓN
La diabetes mellitus es una enfermedad metabólica crónica causada por una deficiencia en la producción de insulina por el páncreas o por la inefectividad en la acción de dicha hormona, lo que lleva a un incremento de la concentración de glucosa en sangre. Las complicaciones cardiovasculares son la principal causa de morbilidad y mortalidad entre la población diabética 1,2 siendo la hiperglucemia sostenida un factor de riesgo que conduce, finalmente, a la miocardiopatía diabética 3,4. Aunque esta última se asocia más frecuentemente a pacientes con diabetes tipo 2, los pacientes con diabetes tipo 1 también presentan una miocardiopatía inducida metabólicamente, que se presenta independientemente de hipertensión, nefropatía o de cardiopatía isquémica 5,6. Resultados previos de nuestro laboratorio, obtenidos utilizando un modelo experimental de diabetes tipo 1 en rata, muestran que la hiperglucemia sostenida durante 25 días conduce a una disfunción mitocondrial cardíaca generalizada, en ausencia de hipertrofia y de cambios en la función cardíaca en reposo, pero con compromiso cardíaco ante una sobrecarga de trabajo 7,8, lo que sugiere que el deterioro de la función mitocondrial precede a la falla miocárdica en pacientes diabéticos.
Considerando que la mayoría de los estudios publicados hacen referencia a la función mitocondrial cardíaca en modelos de diabetes tipo 2 -en asociación a la resistencia a la insulina, la obesidad, la hipercolesterolemia y la hipertensión- o en modelos de diabetes tipo 1 por períodos de hiperglucemia muy prolongados, el objetivo de este trabajo fue estudiar los eventos tempranos que ocurren en las mitocondrias de corazón de rata en un modelo experimental de diabetes tipo 1.
MATERIALES Y MÉTODOS
Ratas Wistar macho (200-250 g) se dividieron aleatoriamente en dos grupos: control (C) y diabetes mellitus (DM). La diabetes se indujo mediante una inyección intraperitoneal de estreptozotocina (STZ, 60 mg/kg) diluida en buffer citrato 100 mM pH 4.50. Los animales del grupo C recibieron una inyección intraperitoneal del vehículo (buffer citrato 100 mM pH 4.50). La glucemia se determinó 3 días después de la inyección de STZ y a lo largo del protocolo experimental, utilizando el glucómetro One Touch Ultra, Johnson & Johnson. Las ratas que a los 3 días posinyección de STZ presentaron una concentración de glucosa en sangre superior a 200 mg/ dl fueron consideradas diabéticas 9. El peso de los animales se determinó a lo largo del período de trabajo. A los 10 o 14 días posinyección de STZ, los animales se sacrificaron en atmósfera de CO2 y se les extrajo el corazón, a partir del cual se obtuvo, mediante centrifugación diferencial, la fracción mitocondrial 10.
Haciendo uso de un electrodo de Clark (Hansatech Oxygraph, Hansatech Instruments Ltd, Norfolk, Inglaterra), se determinó el consumo de O2 mitocondrial en presencia de sustratos del complejo I (malato más glutamato) o del complejo II (succinato), tanto en ausencia (estado 4 o respiración pasiva) como en presencia (estado 3 o respiración activa) de ADP 11. Se calculó el control respiratorio (CR) como la relación entre el consumo de O2 en estado 3/estado 4. Las actividades de los complejos respiratorios I-III (NADH-citocromo c reductasa), II-III (succinato-citocromo c reductasa) y IV (citocromo oxidasa) se determinaron a 550-540 nm mediante un espectrofotómetro de arreglo de diodos 12.
La velocidad de producción mitocondrial de peróxido de hidrógeno (H2O2) se determinó fluorométricamente a 365-450 nm utilizando el método escopoletina-peroxidasa de rábano (HRP), en presencia de sustratos del complejo I (malato más glutamato) 12,13. La producción de óxido nítrico (NO) mitocondrial se determinó a través de la oxidación de la oxihemoglobina a metahemoglobina mediante un espectrofotómetro de arreglo de diodos, a 577-591 nm 12,14,15. La actividad de la Mn-superóxido dismutasa (Mn-SOD) se determinó espectrofotométricamente a partir de la velocidad de reducción de ferricitocromo c a ferrocitocromo c por el anión superóxido (O2 -) utilizando el sistema xantina-xantina oxidasa 16. A partir de las medidas experimentales de H2O2, NO y Mn-SOD, se calcularon las concentraciones de O2 - y de NO en estado estacionario ([O2 -]ss y [NO]ss) en la matriz mitocondrial 8, y a partir de dichas concentraciones, se estimó la velocidad de producción de peroxinitrito (ONOO-). Las concentraciones mitocondriales de glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG) se determinaron mediante micro HPLC-MS/MS 17. La expresión de la enzima óxido nítrico sintasa mitocondrial (mtNOS) y del coactivador 1α del receptor activador γ de la proliferación peroxisomal (PGC-1α) se analizaron mediante western blot utilizando anticuerpos anti-NOS neuronal (H299: sc-8309, Santa Cruz Biotechnology) y anti-PGC-1α (K-15: sc-5816, Santa Cruz Biotechnology), respectivamente. Se utilizaron anticuerpos anti-VDAC-1 (D-16: sc-32063, Biotechnology) y anti-β-tubulina ([1E1-E8-H4] ab131205, Abcam) como controles de carga.
Análisis estadístico
Los resultados incluidos en tablas y figuras se expresaron como media ± ESM y representan repeticiones de 3 a 10 experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó utilizando el programa GraphPad Instat 4 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.). Se utilizó la prueba t de Student para analizar la significancia de las diferencias entre el grupo C y el grupo DM; y ANOVA-Dunnett para analizar la significancia de las diferencias respecto del grupo C o del grupo DM al inicio del tratamiento (día 0).
Consideraciones éticas
El protocolo experimental utilizado fue aprobado por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires (CICUAL; 00663658/15) y los procedimientos fueron realizados siguiendo las indicaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos.
RESULTADOS
La glucemia determinada al tercer día posinyección de STZ fue significativamente mayor en los animales diabéticos con respecto al grupo control y se mantuvo elevada durante todo el período experimental, sin encontrarse diferencias dentro del grupo DM a lo largo del tratamiento (Fig. 1A).
El peso del corazón de los animales inyectados con STZ a los 10 y 14 días fue 15% y 25% menor respecto del peso de los animales control, en concordancia con el menor incremento del peso corporal observado en las ratas diabéticas en comparación con el perfil de crecimiento normal (Fig. 1B). En consecuencia, no se evidenciaron diferencias en el índice cardíaco (peso corazón/peso corporal) porcentual entre los grupos (C: 0,340 ± 0,010; DM-10 días: 0,336 ± 0,004; DM-14 días: 0,339 ± 0,003), lo que indica la ausencia de hipertrofia a estos tiempos experimentales.
Con el fin de evaluar la función mitocondrial cardíaca se determinó el consumo de O2 en presencia de malato-glutamato o de succinato, así como las actividades de los complejos respiratorios I-III, II-III y IV (Tabla 1). No se observaron cambios en la respiración mitocondrial en estado 4 (pasiva), sostenida por malato-glutamato o por succinato, en el corazón de ratas diabéticas en comparación a los animales control, ni a los 10 ni a los 14 días posteriores a la inyección de STZ. Cuando las ratas se sacrificaron el día 10, el cual corresponde aproximadamente a 7 días de hiperglucemia, el consumo de O2 en estado 3 (respiración activa) sostenido por malato-glutamato (23%) así como su correspondiente control respiratorio (30%) fueron menores en el grupo diabético, en concordancia con la reducción de la actividad del complejo I-III (17%), siendo el complejo I el único complejo respiratorio modificado en este estadio. Por el contrario, cuando los animales fueron sacrificados a los 14 días posinyección de STZ, es decir, tras ∼11 días de hiperglucemia, tanto el consumo de O2 en estado 3 sostenido por malato-glutamato (21%) como la respiración en estado 3 sostenida por succinato (16%) y las actividades de los complejos respiratorios I-III (27%), II-III (24%) y IV (22%) fueron menores en el grupo diabético en relación con los valores detectados en el grupo control.
C (control) | DM (diabetes mellitus) | ||
---|---|---|---|
10 días | 14 días | ||
Consumo de O2 mitocondrial | |||
Malato-glutamato | |||
Estado 4 (ng-át. O/min.mg proteína) | 41 ± 3 | 45 ± 4 | 39 ± 3 |
Estado 3 (ng-át. O/min.mg proteína) | 353 ± 20 | 271 ± 24* | 280 ± 18* |
Control respiratorio | 8,6 | 6,0 | 7,2 |
Succinato | |||
Estado 4 (ng-át. O/min.mg proteína) | 122 ± 5 | 126 ± 11 | 106 ± 13 |
Estado 3 (ng-át. O/min.mg proteína) | 347 ± 21 | 299 ± 23 | 290 ± 30 |
Control respiratorio | 2,8 | 2,4 | 2,7 |
Complejos respiratorios | |||
I-III (nmol/min.mg proteína) | 376 ± 14 | 312 ± 18* | 274 ± 26*** |
II-III (nmol/min.mg proteína) | 184 ± 10 | 154 ± 16 | 140 ± 13* |
IV (1/min.mg proteína) | 72 ± 4 | 69 ± 5 | 56 ± 4* |
***p <0,005; *p <0,05 DM vs. C (test t de Student)
C: control
DM: diabetes mellitus
Debido a que ∼7 días de hiperglucemia llevaron a una incipiente disfunción mitocondrial, evidenciada tanto por la disminución del consumo de O2 en estado 3 sostenido por malato-glutamato como por la reducción de la actividad del complejo I-III, dicho período experimental fue considerado un estadio temprano de disfunción mitocondrial cardíaca. Por esta razón, el estudio de la generación de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno, del estado rédox y de la biogénesis mitocondrial se realizó en corazón de animales sacrificados 10 días posinyección de STZ.
En referencia al estado redox mitocondrial, éste se evaluó a través de la determinación de la concentración de glutatión mitocondrial y de la actividad de la Mn-SOD, principales antioxidantes no enzimático y enzimático, respectivamente, mitocondriales (Tabla 2). La concentración mitocondrial de glutatión total ([GSH + GSSG]) fue un 28% menor en los animales diabéticos en comparación con la determinada en ratas control, debido tanto a una disminución en la concentración de glutatión reducido ([GSH]) como en la concentración de glutatión oxidado ([GSSG]), no encontrándose diferencias en la relación [GSH]/ [GSSG]. La actividad de la enzima Mn-SOD también resultó ser 15% menor en las mitocondrias de corazón de los animales diabéticos sacrificados 10 días posinyección.
C | DM - 10 días | |
---|---|---|
[Glutatión] (pmol/mg proteína) | ||
[GSH] | 104 ± 5 | 76 ± 7 |
[GSSG] | 8 ± 1 | 5,5 ± 0,7 |
[GSH + GSSG] | 113 ± 6 | 81 ± 7* |
[GSH]/[GSSG] | 12 ± 1 | 14 ± 2 |
Mn-SOD | ||
Actividad (USOD/mg proteína) | 79 ± 5 | 67,5 ± 2,5* |
[Mn-SOD] (µM) | 11,2 ± 0,8 | 9,8 ± 0,4 |
*p<0,05 DM vs. C (test t de Student)
GSH glutation reducido
GSSG glutation oxidado
Mn-SOD Manganeso superóxido dismutasa
En cuanto a las velocidades de producción de especies reactivas del oxígeno, la generación de H2O2, en presencia de sustratos del complejo I fue significativamente mayor (117%) en las mitocondrias de corazón de los animales diabéticos luego de ∼7 días de hiperglucemia, en comparación con la determinada en el grupo control (Fig. 2A). Se evidenció también un aumento (30%) en la velocidad de generación mitocondrial de NO (Fig. 2B), en concordancia con un incremento del 29% en la expresión de NOS determinada en membranas mitocondriales (mtNOS) (Fig. 2C).
A partir de las medidas experimentales se estimaron las concentraciones en estado estacionario de O2 - -precursor estequiométrico del H2O2- y de NO en las mitocondrias de corazón de los animales diabéticos y controles. Se evidenció un incremento muy marcado (∼150%) en la [O2 -]ss (Fig. 2D) en el grupo diabético respecto del grupo control, acompañado de un aumento de ∼30% en la [NO]ss (Fig. 2E). A partir de las concentraciones en estado estacionario de dichas especies se estimó la velocidad de generación mitocondrial de ONOO- (Fig. 2F), la cual fue 3 veces superior en el corazón de los animales inyectados con STZ que en ratas control.
Por otro lado, se determinó la expresión del factor de transcripción PGC-1α, principal regulador de la biogénesis mitocondrial, en homogenato total de corazón de animales sacrificados 10 días posinyección de STZ, así como también se estimó la masa mitocondrial cardíaca a partir de la relación de la actividad de citocromo oxidasa (COX) determinada en la fracción mitocondrial y en el homogenato 18. No se encontraron diferencias entre los grupos experimentales, ni en la expresión de PGC-1α (Fig. 3) ni en la masa mitocondrial cardíaca (C: 24,6 ± 0,1 y DM: 24,1 ± 0,2 mg proteína mitocondrial/g tejido), lo que indica que luego de 7 días de hiperglucemia, no se ha desencadenado la síntesis de novo de mitocondrias, en contraste con lo observado cuando la hiperglucemia se sostiene por aproximadamente 25 días 8.
DISCUSIÓN
Los resultados muestran que ∼7 días de hiperglucemia sostenida son suficientes para evidenciar una incipiente disfunción mitocondrial cardíaca, con disminución del consumo de O2 en estado 3 y aumento de la producción de H2O2, ambos al utilizar malato-glutamato, en concordancia con la reducción de la actividad del complejo I, lo cual sugiere la presencia de modificaciones estructurales de las proteínas de dicho complejo en la primera fase de la disfunción cardíaca en ratas diabéticas. El aumento en la producción de H2O2 se acompañó de un incremento en la generación de ONOO-, este último a expensas del marcado aumento en la concentración de O2 - y del aumento en la generación de NO y de la expresión de la enzima responsable de su síntesis, la mtNOS. Cabe mencionar que el ONOO- es una especie altamente oxidante y nitrante, involucrada en la inhibición del complejo I a través de nitración de tirosinas y/o S-nitrosilación 12,19. Dado que no se evidenciaron cambios en la expresión del factor PGC-1α ni en la masa mitocondrial cardíaca, el NO mitocondrial parecería ser una especie química ubicada río arriba en las vías de señalización que llevan a la síntesis de nuevas mitocondrias, en respuesta a la hiperglucemia.
En conclusión, la disfunción del complejo I y el aumento en las velocidades de producción mitocondrial de H2O2, NO y ONOO- pueden considerarse señales prodrómicas subcelulares de la disfunción mitocondrial cardíaca que precede a la falla miocárdica en este modelo de DM tipo 1.