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INTRODUCCIÓN
El consumo excesivo de sal en la dieta es un factor de riesgo para el desarrollo de hipertensión arterial. En el riñón, la sobrecarga salina induce estrés oxidativo e inflamación, independientemente del valor de la presión arterial. Los estudios clínicos sugieren que la presión arterial no se incrementa por una dieta alta en sodio (Na+) en ausencia de cloruro (Cl-), 1,2,3 pues el bicarbonato de sodio no tiene el mismo efecto presor que el cloruro de sodio (NaCl) en personas hipertensas. 2,4) Evidencias recientes sugieren que el cloruro puede tener una injerencia más específica en la hipertensión arterial “sal sensible”, independiente del efecto hipertensógeno del sodio. 5,6,7,8,9
Nuestro grupo de trabajo ha demostrado la presencia de efectos proinflamatorios y profibróticos agudos y crónicos que una sobrecarga de NaCl provoca en el riñón. 10,11,12,13 Una dieta alta en NaCl induce activación del gen del angiotensinógeno, mayor síntesis de angiotensina II renal y aumento del estrés oxidativo que conducen al desarrollo de hipertensión. 14,15,16 Sin embargo, hasta el presente, no están descriptos ni esclarecidos los posibles efectos dañinos de una sobrecarga del Cl- en el riñón, y si sus efectos son independientes de la presencia del Na+.
Hipótesis
El anión cloruro, independientemente del catión sodio, también estaría involucrado en el estrés oxidativo del riñón y la elevación de la presión arterial. Estas alteraciones se verían atenuadas si el cloruro se reemplazara por otro anión (por ejemplo, el citrato) o si el sodio fuese reemplazado por otros cationes.
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales utilizados
Se utilizaron 32 ratas Wistar macho de 7 semanas de edad y peso corporal (PC) promedio de 155-165 g al comienzo de la dieta.
Dietas
Los animales se dividieron en un grupo control y tres grupos experimentales (n = 8/grupo), bebieron agua corriente ad libitum, y consumieron esas dietas 17 durante 3 semanas:
Determinación de la presión arterial sistólica
Se midió la PAS a tiempo 0 (basal), 1, 2 y 3 semanas por esfingomanometría en la cola de las ratas (Hatteras Instruments, Cary, NC, US), entre las 9 y 11 horas, previo entrenamiento de los animales durante 3 días consecutivos.
Determinación del consumo de alimento, ingesta calórica y consumo de bebida
Durante tres días consecutivos de la tercera semana, se calcularon los consumos de alimento (g) y agua (mL). Se calculó la ingesta calórica (kcal) como: 3,3 kcal/g*Ingesta de alimento (g).
Determinación de parámetros urinarios, plasmáticos y evaluación de la funcionalidad renal excretora
Al cabo de las 3 semanas de dieta, los animales se alojaron en jaulas metabólicas, durante dos días: uno de aclimatación y otro de recolección de orina de 24 horas para medir la diuresis, las concentraciones urinarias de Na+ y Cl- (mEq/L) y creatinina (mg/dL).
El día del sacrificio, luego de obtener el peso corporal final, y bajo anestesia con ketamina (60 mg/kg) y xilacina (2 mg/kg), se extrajo sangre del seno retroocular. Se determinaron las concentraciones plasmáticas de Na+, Cl-, creatinina, glucosa y urea, mediante un autoanalizador. La osmolaridad plasmática (mOsm/kg) se estimó como:
2*natremia (mEq/L) + 1/18*glucemia (mg/dL) + 1/6*uremia (mg/dL).
Se calculó la depuración (clearance) de creatinina según: ClCr = (creatininuria/creatininemia)*diuresis/tiempo/PC.
Para estudiar la función tubular se calcularon la carga filtrada (CF), la excreción urinaria (EU), la excreción fraccional (EF), la reabsorción tubular (RT) y la reabsorción fraccional (RF) de los diferentes iones, a partir de las siguientes fórmulas estándares:
CFNa = ClCr*natremia
RTNa = CFNa-EUNa
CFCl = ClCr*cloremia
RTCl = CFCl-EUCl
EUNa = diuresis*natruria
EFNa = (EUNa/CFNa)*100
EUCl = diuresis*cloruria
EFCl = (EUCl/CFCl)*100
La diuresis, ClCr, y CF, RT y EU se normalizaron por el PC de cada rata y se expresan en mL/día/kg, mL/min/kg o mEq/ día/kg, mientras que la EF y RF se expresan en porcentaje (%).
Sacrificio, extracción de riñones y procesamiento de muestras
Bajo anestesia, se extrajeron mediante laparatomía abdominal ambos riñones. Se disecó la corteza renal, que se homogenizó en Buffer Fosfato Salino (7,6 mM KH2PO4, 42,4 mM K2HPO4, 150 mM NaCl, pH: 7,4) y se centrifugó a 600 g durante 20 minutos a 4 °C. En los sobrenadantes se determinaron las especies reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS), y la actividad de las enzimas antioxidantes: superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPx). La expresión proteica de estas enzimas se determinó mediante Western Blot en homogenatos de corteza renal. El contenido proteico se midió por el método de Lowry. 18 Los animales fueron sacrificados por decapitación.
Determinación de TBARS
El ensayo se basa en un método previamente descripto por Fraga y col. 19 Los resultados se expresan en nmol de TBARS de equivalentes de malondialdehído (MDA)/mg proteína.
Determinación de actividades enzimáticas
La actividad de la SOD fue medida espectrofotométricamente siguiendo la formación del adenocromo. En ausencia de KCN (4 µM) se determinó la actividad total de SOD; en su presencia, la actividad de Mn-SOD (isoforma mitocondrial); y por diferencia, la actividad de Cu/Zn-SOD (isoforma citosólica). Los resultados se expresan en unidades arbitrarias (UA)/mg proteína. 20
La actividad de la CAT se determinó por espectrofotometría siguiendo el consumo de H2O2 a 240 nm. Los resultados se expresan como μmol H2O2/mg proteína/min. 21,22
La actividad de la GPx se midió por espectrofotometría siguiendo la oxidación enzimática de NADPH a 340 nm en presencia de 1 mm de glutatión (GSH), 1 mm NaN3, 0,15 mm NADPH y 0,25 unidades (U)/mL de glutatión reductasa. Los resultados se expresan en µmol NADPH oxidado/mg proteína/ min, que equivalen a µmol de glutatión oxidado (GSSG)/mg proteína/min). 23
Determinaciones por Western Blot
La metodología se describe en trabajos previos. 24 Los anticuerpos primarios se diluyeron 1:1000, y los secundarios, conjugados con peroxidasa de rabanito, 1:5000 en buffer fosfato salino (PBS). Como control de carga se utilizó β-actina para normalizar el contenido proteico.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± error estándar de la media (EEM). Se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) de dos vías y, el test de Tukey a posteriori, empleando el programa InfoStat, versión 2018. Los resultados con valor p < 0,05 se consideraron significativos.
Consideraciones éticas
El protocolo experimental utilizado fue aprobado por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires (CICUAL), por Res(D) N° 1881/2019, y los procedimientos fueron realizados siguiendo las indicaciones de la “Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio” perteneciente a la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de Norteamérica.
RESULTADOS
Peso corporal, ingesta de alimento, calorías y agua
Los tres grupos alimentados con dietas experimentales mostraron una diferencia de peso corporal final-inicial menor que los controles, acompañada de mayor ingesta de bebida al cabo de las tres semanas de tratamiento dietario (Tabla 1).
Tabla 1 Peso corporal, ingesta de comida, calorías y bebida
| Control | NaCl | Na | Cl | |
|---|---|---|---|---|
| Número de casos (n) | 8 | 8 | 8 | 8 |
| Peso corporal inicial (g) | 152 ± 4 | 151 ± 6 | 156 ± 10 | 175 ± 6 |
| Peso corporal final (g) | 293 ± 22 | 265 ± 21 | 247 ± 15 | 290 ± 13 |
| Diferencia de peso corporal (g) | 141 ± 7 | 114 ± 9* | 91 ± 15* | 115 ± 3* |
| Ingesta de comida estimada (g) | 27 ± 2 | 29 ± 3 | 35 ± 8 | 33 ± 3 |
| Ingesta calórica estimada (kcal) | 91 ± 7 | 95 ± 9 | 116 ± 26 | 110 ± 10 |
| Ingesta de bebida estimada (mL) | 21 ± 1 | 50 ±4* | 61 ± 9* | 31 ± 1* |
NaCl: dieta hipersódica e hiperclórica; Na: dieta hipersódica sin cloruro; Cl: dieta hiperclórica sin sodio. * p <0,05 con respecto al grupo control.
Evolución temporal de la presión arterial sistólica
Las ratas controles se mantuvieron normotensas durante las 3 semanas de dieta. La PAS aumentó en los tres grupos alimentados con dietas experimentales a partir de la segunda semana; las diferencias fueron significativas con respecto a los valores basales y del grupo control para las dietas NaCl y Cl.
Los valores de PAS más altos se alcanzaron a las 2 y 3 semanas en el grupo NaCl, mientras que los incrementos de la PAS en los grupos Cl y Na fueron menores que los alcanzados en el grupo NaCl. Tal como se puede observar en la Figura 1, la PAS en el grupo Na mostró una elevación menor que en los otros dos grupos experimentales, pero sin alcanzar diferencias significativas con respecto al grupo control (Figura 1).
Parámetros plasmáticos y urinarios
No se modificó la creatininemia, natremia, cloremia y osmolaridad plasmática (estimada a partir de la natremia, la glucemia y la uremia) en ninguno de los grupos. Con respecto al grupo control, la creatininuria disminuyó en los tres grupos, y la natruria aumentó en los grupos con dieta alta en sodio (NaCl y Na) y disminuyó en el grupo Cl. El índice natruria/cloruria, que evalúa la equimolaridad urinaria entre los dos iones, aumentó significativamente en el grupo Na, y alcanzó valores muy cercanos a la equimolaridad en el grupo Cl (Tabla 2).
Tabla 2 Parámetros plasmáticos y urinarios
| Control | NaCl | Na | Cl | |
|---|---|---|---|---|
| Creatininemia (mg/dL) | 0,56 ± 0,04 | 0,64 ± 0,04 | 0,62 ± 0,03 | 0,63 ± 0,04 |
| Natremia (mEq/L) | 151 ± 5 | 144 ± 2 | 147 ± 3 | 144 ± 2 |
| Cloremia (mEq/L) | 102 ± 2 | 100 ± 1 | 101 ± 3 | 99 ± 1 |
| Glucemia (mg/dL) | 138 ± 11 | 152 ± 15 | 153 ± 13 | 151 ± 14 |
| Uremia (mg/dL) | 27 ± 1 | 38 ± 4* | 49 ± 4*$ | 22 ± 2*$Δ |
| Osmolaridad plasmática estimada (mOsm/kg) | 319 ± 9 | 311 ± 4 | 321 ± 7 | 306 ± 5 |
| Creatininuria (mg/dL) | 316 ± 42 | 52 ± 17* | 22 ± 4* | 71 ± 24*Δ |
| Natriuria (mEq/L) | 117 ± 31 | 293 ± 41* | 360 ± 43* | 26 ± 11*$Δ |
| Cloruria (mEq/L) | 145 ± 37 | 345 ± 48* | 83 ± 8*$ | 29 ± 12*$Δ |
| Índice urinario Na+/Cl- | 0,77 ± 0,09 | 0,84 ± 0,05 | 4,30 ± 0,23*$ | 0,99 ± 0,26Δ |
NaCl: dieta hipersódica e hiperclórica; Na: dieta hipersódica sin cloruro; Cl: dieta hiperclórica sin sodio. * p < 0,05 vs Control; $ p < 0,05 vs NaCl; ∆ p < 0,05 vs Na.
Parámetros de funcionalidad renal excretora
La diuresis aumentó en los tres grupos con respecto al control, mientras que el ClCr disminuyó en los grupos NaCl y Na.
En los grupos NaCl y Na disminuyeron la CFNa, la RTNa, la RFNa, la CFCl, la RTCl y la RFCl y aumentaron la EUNa, la EFNa, la EUCl y la EFCl respecto al control.
En comparación con el grupo NaCl, en las ratas Na observamos aumento de la EUNa y disminución de la EUCl. Asimismo, en el grupo Na, la EFCl fue menor que la EFNa, mientras que la RFCl fue mayor que la RFNa.
El grupo Cl no mostró cambios significativos con respecto al grupo control, pero sí al compararlo con los otros dos grupos: respecto al grupo NaCl, tuvo mayor CFNa, RTNa, RFNa, CFCl, RTCl y RFCl, cambios que se acompañaron por una menor excreción urinaria y fraccional de ambos iones. Con respecto al grupo Na, el grupo Cl tuvo menor excreción urinaria y fraccional, y mayor reabsorción fraccional de ambos iones (Tabla 3).
Tabla 3 Parámetros de funcionalidad renal
| Control | NaCl | Na | Cl | |
|---|---|---|---|---|
| Diuresis (mL/día/kg) | 10 ± 2 | 78 ± 14* | 92 ± 15* | 51 ± 21*Δ |
| ClCr (mL/min/kg) | 3,55 ± 0,55 | 2,21 ± 0,29* | 2,41 ± 0,19* | 3,01 ± 0,53 |
| CFNa (mEq/día/kg) | 790 ± 141 | 461 ± 61* | 511 ± 39* | 634 ± 105$ |
| EUNa (mEq/día/kg) | 1,2 ± 0,3 | 22,9 ± 4,3* | 34,4 ± 6,2*$ | 1,1 ± 0,3 $Δ |
| EFNa (%) | 0,15±0,04 | 5,24±1,74* | 6,82± 0,97* | 0,15 ± 0,03$Δ |
| RTNa (mEq/día/kg) | 789 ± 141 | 440 ± 64* | 477 ± 38* | 633 ± 105$ |
| RFNa (%) | 99,85 ± 0,04 | 94,76 ± 1,74* | 93,18 ± 0,97* | 99,85 ± 0,03$Δ |
| CFCl (mEq/día/kg) | 532 ± 92 | 319 ± 40* | 349 ± 26* | 435 ± 74$ |
| EUCl (mEq/día/kg) | 1,4 ± 0,3 | 26,5 ± 5,1* | 7,8 ± 1,5*$ | 1,1 ± 0,3 $Δ |
| EFCl (%) | 0,27 ± 0,07 | 8,39 ± 2,70* | 2,23 ± 0,33*$@ | 0,24 ± 0,04$Δ |
| RTCl (mEq/día/kg) | 531 ± 92 | 295 ± 44* | 341 ± 26* | 434 ± 74$ |
| RFCl (%) | 99,73 ± 0,07 | 91,61 ± 2,70* | 97,77 ± 0,33*$@ | 99,76 ± 0,04$Δ |
NaCl: dieta hipersódica e hiperclórica; Na: dieta hipersódica sin cloruro; Cl: dieta hiperclórica sin sodio. ClCr: clearance de creatinina, CF: carga filtrada, EU: excreción urinaria, EF: excreción fraccional, RT: reabsorción tubular, RF: reabsorción fraccional. *p < 0,05 vs Control; $p < 0,05 vs NaCl; @p < 0,05 vs EFNa o RFNa; Δp < 0,05 vs Na.
Parámetros de estrés oxidativo en corteza renal
La producción de TBARS aumentó en la corteza renal en los grupos NaCl, Na y Cl respecto al grupo control.
No se modificaron la actividad y la expresión proteica de la isoforma mitocondrial y citosólica de la SOD y de la CAT. Mientras que la expresión proteica de la GPx no se modificó en ningún grupo, la actividad de esta enzima se incrementó en los grupos NaCl y Cl con respecto a los grupos control y Na (Figura 2).
Resumen de resultados
Tanto el exceso de una dieta alta en sodio como en cloruro se asocian a un mayor estado oxidativo evidenciado por un incremento en la peroxidación lipídica en la corteza renal, demostrado por un incremento en la producción de TBARS. Sin embargo, solo el exceso de cloruro, comparado con el grupo Na, se asocia a actividad mayor de la GPx y al desarrollo de hipertensión con mayor retención urinaria de ambos iones; sugiere un mayor estado prooxidante y de estrés oxidativo en el riñón en presencia de una sobrecarga de cloruro.
DISCUSIÓN
Peso corporal, ingesta de alimento, calorías y agua
La ingesta de Na+, Cl-, o ambos iones se asoció con menor ganancia de PC, respecto al grupo control, durante las tres semanas de dieta. Estos resultados son consistentes con lo reportado en la bibliografía, donde se demostró que una dieta hipersalina se asocia con disminución de la masa grasa total en los ratones que presentaron up regulation de genes involucrados en la lipólisis y down regulation de genes relacionados a la lipogénesis. 25 En nuestro trabajo observamos en el momento del sacrificio, una disminución en la grasa epididimal y perirrenal en las ratas que consumieron NaCl y Na respecto a los otros dos grupos experimentales (datos no incluidos). Estos hallazgos ocurrieron a pesar de que todas las dietas fueron isocalóricas entre sí. Los animales alimentados con dietas con sobrecarga de sales consumieron más agua que los controles. Esto puede ser causado por un incremento agudo inicial de la osmolaridad plasmática, que estimula el centro de la sed, con el objeto de compensar ese incremento. 26
Evolución temporal de la presión arterial sistólica
Hemos demostrado que ratas Sprague Dawley macho, sometidas a una dieta con sobrecarga de NaCl (8% P/P) aumentan la PAS al cabo de tres semanas de dieta, con valores que superan los definidos como hipertensión sistólica (140 mmHg). 27
Los resultados que se presentan sugieren que el aumento de la PAS está también relacionado con la sobrecarga de cloruros, pues el grupo Cl alcanzó valores tensionales mayores a 140 mmHg, superiores a los del grupo Na. El anión Cl- es un componente del NaCl que podría tener un rol más específico en la sal-sensibilidad y que podría ser, incluso, más determinante que el Na+. 28 Otros estudios efectuados en ratas Dahl “sal-sensibles” mostraron que a lo largo de varias semanas, la hipertensión se desarrolló en los animales consumidores de NaCl, pero no en los alimentados con NaHCO3 u otras sales de Na+.29,30,31
Por otra parte, la sobreingesta de sales de cloruro “no sódicas”, que es acompañada por una excreción urinaria de cloruro menor que la producida en presencia de Na+, podría estar relacionada con una acumulación selectiva de Cl- en el organismo, lo que conllevaría al desarrollo de hipertensión arterial “sal-sensible”. 32,33,34
Parámetros plasmáticos y urinarios
La ausencia de modificaciones en las concentraciones plasmáticas de sodio y cloruro y la osmolaridad son evidencias de la eficiencia biológica de los mecanismos fisiológicos para compensar una posible hipernatremia y/o hipercloremia y para conservar la osmolaridad plasmática.
Como era esperable, en el grupo NaCl aumentaron la natruria y la cloruria con respecto al grupo control; el índice urinario Na+/Cl- fue similar en ambos grupos. En el grupo Na es posible que aumente la secreción y la excreción de bicarbonato, resultado consistente con el incremento del índice urinario Na+/Cl- con respecto a los demás grupos que observamos; sugiere que el Cl- no es el principal contraión del Na+ excretado. La secreción de HCO3 - tiene por objeto compensar una alcalosis metabólica en los animales que recibieron citrato de Na+ y, como consecuencia de ello, la reabsorción de Cl- estaría incrementada y su excreción, disminuida, ya que el intercambiador Cl-/HCO3 -, independiente del catión Na+, presentaría una mayor expresión en las membranas apicales de las células de los túbulos contorneado distal, colector cortical y conector. 28 En cuanto al grupo Cl es llamativa la baja cloruria con respecto a las ratas control, lo que sugiere la hipótesis que para su excreción, es necesario que se elimine también el Na+ como contraión.
Estos resultados sugieren que el anión cloruro se estaría acumulando en algún compartimento, como la piel, ya que en el plasma sus niveles siguen siendo normales. 32,33,34
Parámetros de funcionalidad renal excretora
El incremento de la diuresis en los tres grupos experimentales, con respecto a los controles, concuerda con el incremento del consumo de bebida. Di Ciano y col. han reportado el aumento de la diuresis en ratas Wistar alimentadas con dieta salina. 35 Estos cambios se acompañaron con una menor fracción de filtración, hallazgo que condice con la disminución del ClCr y de la CFNa y CFCl que observamos en el grupo NaCl.
Una sobrecarga de cloruros lleva al aumento de la oferta de este anión y puede provocar vasoconstricción renal y disminuir el volumen de filtrado glomerular como consecuencia de la retroalimentación túbulo-glomerular ante un mayor transporte del Cl- a la mácula densa, que resulta en un incremento en la resistencia de la arteriola aferente renal, con reducción en el flujo plasmático renal y el VFG e incremento de la presión arterial sistémica. 36,37
La disminución del ClCr en el grupo NaCl puede explicar menor CFNa y CFCl, respecto a los controles. Era esperable que ambos grupos que recibieron sobrecargas isoomolares de Na+ presentaren el mismo perfil en cuanto a parámetros de excreción y retención iónica.
Pero ese perfil no se observó en el grupo Cl; demuestra que el reemplazo del ion Na+ por otros cationes provoca respuestas disímiles. En el grupo Cl, los iones Na+ y Cl- presentan perfiles de excreción y reabsorción muy similares entre sí, se observa una clara equimolaridad urinaria que refleja que el contraión que se elimina con el Cl- es el Na+.
Parámetros de estrés oxidativo en corteza renal
La sobrecarga de Na+, Cl- o ambos iones en la dieta, se asoció con un incremento en la peroxidación lipídica en la corteza renal, representado por el aumento en la producción de TBARS. El estado prooxidante en estas células se caracteriza por un incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno, situación ante la cual la SOD dismuta el anión superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno molecular con constante de velocidad alta (2,3.109 M-1s-1), mientras que la CAT convierte peróxido de hidrógeno en oxígeno molecular y agua.
Era esperable que el aumento de la producción de TBARS se acompañara del aumento de la actividad y/o expresión de SOD y CAT. Pero en nuestros modelos estos parámetros no se vieron afectados. Sin embargo, se registró aumento de la actividad de la GPx, que sugiere un efecto compensatorio a la ausencia de modificaciones de SOD y CAT. La regulación de su actividad está relacionada con modificaciones postraduccionales que tienen lugar en el sitio activo de la enzima y que ocurren independientemente de que varíe o no, su expresión. 38
CONCLUSIÓN
Estos resultados sugieren que el anión cloruro es corresponsable, junto con el sodio, para desencadenar daño oxidativo renal e incrementar la presión arterial; de ahí la importancia de tener en cuenta la reducción en la ingesta de ambos iones como medida de tratamiento no farmacológico de la hipertensión arterial, considerando que la mayoría de los productos dietéticos comerciales, sustitutos de la sal de mesa, son a base de cloruro de potasio.
Consideraciones éticas
El protocolo utilizado fue aprobado por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires (CICUAL), por Res(D) N° 1881/2019, y los procedimientos fueron realizados siguiendo las indicaciones de la “Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio” perteneciente a la Academia Nacional de los Estados Unidos de Norteamérica.
