CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES - INGENIERÍAS Y TECNOLOGÍA: INVESTIGACIÓN

Características espacio-temporales del desarrollo embrionario preimplantacional de Myocastor coypus (coipo)*

Spatio-temporal characteristics of the preimplantational embryonic development in Mycastor coypus (coypu)*

Antonio E. Felipe**

*) Este artículo se deriva de la Tesis del autor para el grado de Maestría en Metodología de la Investigación Científica y Técnica (Facultad de Cs. Económicas, Universidad Nacional de Entre Ríos). Para su desarrollo se trabajó durante tres años. Recibido en octubre 2005; segunda versión en febrero 2006; aceptado en junio 2006.
**) Médico Veterinario, Profesor en Ciencias Naurales, Jefe de Trabajos Prácticos de Histología, Embriología y Teratología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires UNCPBA, Tandil, R. Argentina. Email: aefelipe@vet.unicen.edu.ar

Resumen

El objetivo de este trabajo fue caracterizar el desarrollo preimplantacional del coipo (Myocastor coypus). Se realizó el seguimiento colpocitológico y apareamiento dirigido de 33 hembras. La división en estadíos se efectuó considerando atributos morfológicos. El número medio de embriones por hembra fue de 6.3 ± 2.03 (rango de 1 a 11). En el día 1 poscoito (p.c.), predominaron ovocitos y en el día 2 p.c. las cigotas. El período de segmentación abarcó desde el día 3 al día 6 p.c. Las mórulas se recolectaron desde el día 6 al día 9 p.c., en tanto que los estadíos de blastocisto se recolectaron en los días 8 y 9 p.c. Por el lavaje de oviductos, se recolectaron embriones en los estadíos de cigota hasta mórulas con menos de 30 células y por lavaje de hemiúteros se obtuvieron desde mórulas hasta blastocistos en crecimiento. El desarrollo preimplantacional abarcó 10 días.

Palabras clave: Desarrollo preimplantacional; Coipo; Myocastor coypus

Abstract

Myocastor coypus (coypu) is a rodent world-wide used as a skin species. The purpose of the present study was to determine the morphology of the preimplantation embryonic development in Myocastor coypus (coypu). Thirty-three virgin and sexually mature females allotted in 6 family nuclei and 1 male were utilised. The mating program implied the daily colpocytological examination by using standardised routine techniques. Samples for the colpocytological followup were collected from all the animals between 11 and 11:30 hours a.m. The observation of vaginal smears was done directly within 5 minutes of sampling.
The controlled mating methodology was used. After the oestrus was established by colpocytology, the female was immediately moved to the male's pen. The embryonic age was determined in days post-coitus (d.p.c.), establishing as day 0 the day when spermatozoa were identified in the vaginal smear. Oocytes and embryos were obtained by flushing from day 0 to 10 post-coitus (p.c.). On day 1 p.c., oocytes predominated whereas on day 2 p.c. zygote were predominant. The cleavage period was from day 3 to day 6 p.c. Morulae were collected from day 6 to 9 p.c., whereas blastocysts were collected in days 8 and 9. From oviduct flushing, embryos in zygote and up to morula with less than 30 cells stage were recovered. Embryos in morula with 30 or more cells and up to blastocyst in growth stage were collected from the flushing of hemiuteri.

Key words: Preimplantational development; Coypu; Myocastor coypus

I. Introducción

Myocastor coypus (coipo) es un animal poliéstrico anual, con ciclos estrales caracterizados por su gran variabilidad (Wilson y Dewees,1965; Newson, 1966). Ludica y Alberio (1995) establecieron un rango de 12 a 49 días, con una media de 28,9 ± 12,6 días y un estro de 2 a 5 días. El coipo, como otros histricomorfos, presenta una gestación prolongada (Weir, 1974), con un promedio de 132 días (Actis y cols., 1989) y un rango de 127 a 138 días (Weir, 1974).
Al presente, es escasa la información sistematizada sobre la biología del desarrollo del coipo, existiendo algunas referencias generales en el marco de otros roedores histricomorfos (Roberts y Perry, 1974). La aplicación y el éxito de las tecnologías reproductivas y, en especial, de las embriotecnologías, requiere de conocimientos sobre el desarrollo preimplantacional (Montes y cols., 1983; Seidel, 1991) y sobre las características del ciclo reproductivo de la especie (Willmut y cols., 1985; Heyman, 1988; Mapletoft, 1995).
El momento ideal para la obtención de embriones ha sido estudiado en diversas especies para las cuales se cuenta con conocimientos básicos de su desarrollo preimplantacional (Snell, 1969; Craft y cols., 1982; Ahuja y cols., 1985; Psychoyos y Martel, 1985; Heyman, 1988; Plachot y cols., 1988).
Hasta este momento, no existe información sistematizada sobre la biología del desarrollo del coipo, a excepción de referencias generales en el marco de otros roedores histricomorfos (Roberts y Perry, 1974).
Por consiguiente, resulta necesaria la realización de estudios que contribuyan a la ampliación de los conocimientos sobre aspectos relacionados con la fisiología reproductiva y con la embriología de Myocastor coypus. Parte de este amplio campo de estudios lo ocupa el conocimiento de las etapas iniciales de su desarrollo. Por lo tanto, este trabajo se orientó a establecer la cronología del desarrollo embrionario preimplantacional del coipo desde el momento de la liberación del óvulo y la fecundación, hasta el momento estimado de los comienzos del proceso de implantación (adhesión).

II. Materiales y Métodos

II.1. Animales
Se emplearon 33 hembras vírgenes y sexualmente maduras, agrupadas en 6 núcleos familiares y 1 macho, destinados a zafra. Las hembras presentaron un peso de 4,6 ± 0,6 kg., con una edad de 8,7± 1,1 meses. La edad del macho fue de 8 meses y su peso de 5,8 kg. Todos los núcleos familiares se constituyeron con ejemplares de una misma mutación genéticamente pura de Myocastor coypus (mutación Groenlandia) a fin de evitar variaciones debidas a la fecundidad diferencial (Bura 1992a y 1992b). La utilización de un mismo reproductor, con aptitud reproductiva probada, permitió controlar variaciones debidas al empleo de machos diferentes. Los animales se alojaron en corrales semitechados disponiendo cada uno de 2 m2 de superficie. A los animales se les suministraron 300 g/día de alimento balanceado específico y agua ad-libitum con bebederos tipo niple.

II.2. Programa de apareamiento
El programa de apareamiento implicó el seguimiento colpocitológico diario, mediante el empleo de técnicas de rutina estandarizadas. La toma de muestras para el seguimiento colpocitológico se efectivizó para todos los animales entre las 11hs. y las 11:30 hs. am. Se utilizaron pipetas Pasteur plásticas descartables de 3 ml, una por cada animal, a fin de evitar la contaminación de las mismas y errores de diagnóstico. La observación de los frotis vaginales se realizó en fresco dentro de los 5 minutos de extraída la muestra y luego de su coloración con Hematoxilina de Harris (Merck) y colorante Shorr (solución standard, Biopur).
Se aplicó la metodología del apareamiento dirigido, para lo cual, una vez determinado el estro por colpocitología, se procedió de inmediato al traslado de la hembra al corral del macho. La edad embrionaria se estableció en días poscoito (d.p.c.), designándose como día cero el día en que se observaron espermatozoides en las muestras vaginales (Hendricks, 1971; Selwood, 1980).

II.3. Conteo de folículos preovulatorios, sitios de ovulación y/o cuerpos lúteos
Efectuado el abordaje de la cavidad abdominal, se realizó el análisis macroscópico de los ovarios para la identificación, el conteo y el registro del número de folículos preovulatorios, sitios de ovulación y/o de cuerpos lúteos. Las observaciones se realizaron con lupa estereoscópica.

II.4. Recolección y búsqueda de ovocitos y embriones
Los lavajes para la recolección de ovocitos y embriones se realizaron, en el día 0, entre 1 y 2 hs. p.c., y desde el día 1 al día 10 p.c., en intervalos de 24 hs. La técnica de extracción de oviductos y úteros se diseñó acorde a los protocolos de Barros y Yanagimachi (1972) para hamster. Extraído el aparato reproductor, se procedió a la sectorización de oviductos y útero en seis pares de segmentos: infundíbulo, ampolla, istmo cefálico, istmo medio, istmo caudal y hemiútero. Los segmentos se colocaron en cápsulas de Petri cuadriculadas de 35 mm de diámetro con solución fisiológica a 37ºC. El lavaje de los segmentos se realizó bajo microscopio estereoscópico. Para efectivizar el mismo se perfundió en la luz de cada segmento solución fisiológica a 37ºC, utilizando agujas de punta roma con diámetro externo reducido adosadas a jeringas de 1 ml.
La búsqueda de embriones en el líquido de lavaje se realizó en cápsulas cuadriculadas bajo microscopio estereoscópico, con una magnificación óptica de 10x primero y 25x después, cuadro por cuadro tres veces por lavaje, a fin de garantizar una completa observación de la superficie de la placa (Palma, 1993). Los ovocitos y embriones obtenidos se estudiaron en fresco por métodos no invasivos (Roux y cols., 1995).
Se registró el lugar de recolección en el tracto reproductor. En base a ello se clasificaron los embriones como:

1- Tubáricos: embriones recolectados por lavaje del segmento oviductal, incluyendo éste 5 mm del extremo craneal del útero (área de la unión útero-tubárica). A los especímenes obtenidos a partir de practicar la subdivisión del oviducto se los clasificó según su origen como: de la ampolla; del istmo cefálico; del istmo medio o del istmo caudal.
2- Uterinos: embriones recolectados por lavaje de cada hemiútero.

En ambos casos se subdividió a los especímenes como provenientes del lado derecho o del izquierdo.
Se estimó como tiempo de implantación al día postcoito en que, realizados los lavajes en animales con apareamiento exitoso y presencia de cuerpos lúteos bien desarrollados, no se efectivizó recolección de embriones.

II.5. Clasificación de los especímenes
La división en estadíos y subestadíos se efectivizó considerando atributos morfológicos, según trabajos de Gardner y Lane (1993) y Gilbert (1994), adoptándose la siguiente clasificación: ovocitos, cigotas, embriones en segmentación (2, 3, 4, 5-7 y 8-9 células), mórulas tempranas (con menos de 30 células o con 30 o más células), mórulas compactadas, blastocistos con zona pelúcida (tempranos, medios y expandidos) y blastocistos sin zona pelúcida (protruídos y en crecimiento).
Los signos morfológicos utilizados para diferenciar ovocitos de cigotas se basaron en los aplicados por Bedford (1982) y Bavister (1989). Se asumió como fin del desarrollo embrionario, al momento en que los embriones fueron colocados en el líquido de lavaje. Considerando los criterios de Buttler y Biggers (1989) y Palma (1993), se descartaron embriones con características de anormalidad.

III. Resultados

El análisis macroscópico de la morfología ovárica permitió determinar para los días 0 y 1 p.c., la presencia de folículos terciarios preovulatorios, con forma de protrusiones semiesféricas traslúcidas. Desde el día 1 p.c. se observaron sitios de ovulación y/o cuerpos lúteos en diferentes estadíos de desarrollo. Hasta el día 10 p.c. dichas estructuras consistieron en unárea central, sobresaliente y oscura y un área periférica más clara. La coloración rojiza del área central se presentó más intensa del día 4 al 10 p.c. Un puntillado anular (o un halo rojizo) periférico a la zona central tendió a desaparecer a medida que aumentaba el diámetro de la misma.
Entre los días 1 y 6 p.c. se distinguieron en un mismo ovario, diferentes estadíos evolutivos de cuerpos lúteos, coincidiendo esto con los distintos estadíos de desarrollo embrionarios recolectados. El número de embriones recolectados y las estructuras observadas en los ovarios en las hembras utilizadas se presentan en las Tablas 1 y 2. El número medio de sitios de ovulación/cuerpos lúteos por hembra fue de 5,7 ± 2,1.

Se recolectaron 17 ovocitos y 153 embriones, de los cuales el 98,8% fueron considerados normales. El número medio de embriones por hembra fue de 6.3 ± 2.03 con un rango de 1 a 11. El número medio de embriones recolectados del lado derecho del tracto reproductor fue de 3.0 ± 1.5, no mostrando diferencias significativas (P>0.05) con el recolectado del lado izquierdo (3.2 ± 1.6).
Los resultados del lavaje del tracto reproductor mostraron que en la mayoría de los casos, para un mismo animal, se recolectaron embriones en diferentes estadios de desarrollo, pero próximos entre sí (Tabla 2). En un sólo caso (hembra 9/1111/3) se presentaron estadíos que se consideraron distantes, siendo un extremo mórulas no compactadas y el otro blastocistos expandidos. En el resto de los casos (96,3%), efectuándose un análisis cualitativo por hembra de los estadíos de desarrollo recolectados de cada lado del tracto reproductor, no se observó una disparidad considerable. Así fue que los embriones se encontraban en una misma etapa y diferentes subestadíos muy próximos entre sí o en distintas etapas pero en estadíos final de una e inicial de la inmediata siguiente. Por otra parte, las variaciones encontradas en una misma hembra en cuanto al estadio de desarrollo sólo en el caso de la hembra 9/1111/ 3, superaron las dos divisiones de clivaje totales. En un 40,8 % de los casos los embriones se encontraban en el mismo estadio, en igual porcentaje dentro de una división de segmentación y en el 18,4 % de los casos la diferencia fue de dos divisiones.
La variación en los estadíos embrionarios observados para una misma hembra, se verificó también para un mismo tiempo poscoito (Fig. 1).

La mayor variación en los estadíos se determinó a los 3 d.p.c., correspondiéndose con tres divisiones de segmentación completas. En los restantes días, las diferencias fueron establecidas en dos divisiones de segmentación. Para los 3 y 4 d.p.c., el predominio correspondió a los embriones de 2 células (primera segmentación completa), disminuyendo la frecuencia tanto de especímenes unicelulares como de embriones con la segunda y tercer división de segmentación completadas (Tabla 3). A los 5 d.p.c., predominaron embriones en tercera división y a los 6 y 7 d.p.c., en la cuarta división (Tabla 3 y Fig.1).

En la Tabla 4 se presentan los resultados de la recolección de embriones en diferentes estadíos y subestadíos en función del lugar de recolección. En las distintas porciones del oviducto se recolectaron embriones en los estadíos de cigota hasta mórulas de menos de 30 células y de los hemiúteros se obtuvieron mórulas de 30 o más células hasta blastocistos en crecimiento. Se observó que si bien para algunos sectores se recolectaron embriones en distintos estadios de desarrollo, cada sector tuvo predominio de un determinado estadío.

A los 10 d.p.c. no se efectivizó la recolección de embriones (Fig. 1), considerándose al mismo como probable tiempo de implantación ya que las hembras tuvieron apareamiento exitoso y presencia de cuerpos lúteos bien desarrollados.

IV. Discusión

El número de sitios de ovulación/cuerpos lúteos es asumido en la investigación del estado reproductivo de muchos mamíferos como un indicador del número de ovocitos y/o embriones potenciales (Jackson, 1989). El mismo es utilizado en numerosos mamíferos por cuanto proporciona una estimación muy exacta del número de óvulos desprendidos pero sólo aproximado del número de embriones, tendiendo a obtenerse sobreestimaciones (Kirkpatrick, 1980). Si bien el conteo de sitios de ovulación/cuerpos lúteos ha sido utilizado en otros histricomorfos como indicador de la cantidad posible de embriones o fetos (Llanos y Crespo, 1952; Weir, 1971 y 1974; Crespo, 1981; Jackson, 1989), en el caso del coipo, podría conducir a una subestimación del número de embriones potenciales o, al menos, no sería un indicador confiable de los mismos.
El desarrollo embrionario preimplantacional estimado para Myocastor coypus abarcó 10 días desde el momento del apareamiento hasta el tiempo asumido en que se produciría la adhesión. Esto indica un período prolongado de permanencia en el oviducto (6 días) de los embriones del coipo e implicaría una implantación más tardía que en otros histricomorfos (Hunter y cols., 1969; Roberts y Perry, 1974), a excepción de la vizcacha (Weir, 1971).
El comienzo del proceso de segmentación no ha sido definido con seguridad más que para unas pocas especies. En la rata, el ratón y el hamster se inicia de 15 a 17 hs. p.c., y en el gerbil a las 22 a 24 hs. p.c. (Bavister, 1989). Betteridge (1977) señala que en los rumiantes, el tiempo de inicio de la segmentación sería a las 20-24 hs. En el caso de un histricomorfo como el cobayo, Hunter y cols. (1969), establecen los comienzos de la segmentación en torno a las 24 hs. p.c. Sobre la base de las características temporales mencionadas para otros miembros del Orden de los roedores, el proceso de segmentación en el coipo sería relativamente lento, por iniciarse en las 72 hs. p.c.
La obtención de mórulas tempranas con menos de 30 células en el coipo se efectuó entre los días 6 y 8 p.c.. En el cobayo dichos estadíos se recolectaron al día 4 p.c. (Hunter y cols., 1969). Yang y Foote (1987) describieron estadíos de mórula temprana en conejo los días 2 y 3 p.c.. En ratón las mórulas se observaron a las 90 hs.p.c. (Ducibella y Anderson, 1975). Según Betteridge (1977), las mórulas tempranas se recolectan entre los días 2 y 4 en yegua, oveja y cabra; los días 3 y 4 en cerda y 3 y 5 en vaca.
Si bien en cuanto al momento de pasaje al útero los embriones del coipo lo hacen más tardíamente que los roedores de laboratorio, ingresan en un estadio de desarrollo similar al de ellos (Boling y Blandau, 1971; Harper, 1982; Burki, 1986) y al de otros grupos de mamíferos (Bousquet y cols., 1987). El ingreso al útero fue estimado para el coipo a los 7 d.p.c. (168 hs.p.c.), siendo los estadíos más numerosos los correspondientes a mórulas tempranas. El pasaje del oviducto al útero en otras especies se da con embriones en segmentación avanzada o en estadio de mórula. Así, en la rata, los embriones ingresantes presentaron de 8 a 16 células, alrededor de las 100 hs p.c.; en ratón el ingreso se da en el estadio de mórula, a las 72 hs. p.c., con 16 a 32 células (Harper, 1982; Burki, 1986); en el conejo también ingresan como mórulas a las 60 hs. p.c. (Boling y Blandau, 1971). Dos histricomorfos para los cuales se ha registrado el ingreso al útero son el cobayo y la vizcacha. El primero alcanza las 8 células en oviducto e ingresa al útero con 8 o más células el día 3 p.c. (Hunter y cols., 1969). Los embriones de vizcacha ingresan al útero el día 6 p.c. en el estadio de 4 células (Weir, 1971). Entre los animales domésticos, en la yegua los embriones entran al útero en el día 5 o 6 de gestación, cuando han alcanzado el estadio de mórula avanzada o blastocisto temprano y están rodeados por la zona pelúcida (Bousquet y cols., 1987); en vaca, el ingreso se produce a las 72 hs, con 8 a 16 células y en la oveja, a las 70 hs con 8 a 16 células (Betteridge, 1977).
En cuanto al estadío de blastocisto, en el coipo, fueron obtenidos entre los días 8 y 9 p.c. La mayoría de los histricomorfos presentan el estadio de blastocisto más tempranamente que el coipo. Según Roberts y Perry (1974), en casiragua y degu, los blastocistos están presentes en el útero a los 4,5 días p.c., en el cuis al día 5,5 y en la chinchilla a los 3,5 días. En el cobayo, Hunter y cols. (1969) notificaron la presencia de blastocistos tempranos a los 5 días p.c. La excepción la constituye la vizcacha, donde no fueron encontrados hasta el día 18 p.c. El coipo muestra un desarrollo relativamente tardío del blastocisto si se lo compara con otros roedores de laboratorio y animales domésticos. Así, el tiempo al cual el blastocisto comienza a ser reconocible en el ratón y el criceto es alrededor del día 4 y en la rata, el hamster y el jerbo el día 5 p.c. (Bavister, 1989; Checiu y Checiu, 1996). En el conejo, se ha informado la presencia de blastocistos tempranos entre las 74-78 hs.p.c. (Yang y Foote, 1987) hasta las 96 hs.p.c. (Bedford, 1982). En ovinos, el blastocisto se desarrolla alrededor del día 6 p.c. (Cocero y cols., 1996); entre los días 4 y 5 p.c. en cerda (día 6,5 según Rivera y cols., 1996); entre los días 5 y 6 p.c. en yegua, oveja y cabra; y entre los días 6 y 7 p.c. en vaca (Betteridge, 1977).
Con respecto a la variación observada en los estadíos de desarrollo para una hembra y entre hembras para un mismo tiempo poscoito, es bien sabido que la edad del espécimen en desarrollo no puede determinarse con certeza aun cuando las relaciones temporales entre el inicio del estro, la ovulación y el momento de cópula exitosa puedan ser establecidos con cierta exactitud. Esto se debe a que frecuentemente existen amplias variaciones en los estadíos tempranos de desarrollo (Hunter y cols., 1969; Selwood y Smith, 1990). Por ejemplo, en un histricomorfo como el cobayo se observó que, durante el día 6 p.c., se pueden encontrar embriones en todos los estadíos de desarrollo desde el blastocisto libre a en avanzado estado de implantación (Blandau, 1949; Hunter y cols., 1969). No obstante, aunque existen amplias variaciones en la tasa de desarrollo, especialmente en los estadíos más tempranos, el examen de una amplia cantidad de material generalmente revela la condición promedio de desarrollo en cualquier tiempo durante la gestación.
La irregularidad de estadíos recolectados de una misma hembra en un mismo día y entre diferentes hembras para el mismo día podría ser atribuible a un proceso de ovulación múltiple prolongado y, en consecuencia, los ovocitos liberados no son fecundados todos al mismo tiempo. También podría suceder que el desarrollo de los embriones, de ser fertilizados en el mismo momento, no sea sincrónico (Gilbert, 1994).
No obstante, a pesar de la variación observada, la tabla del desarrollo del Myocastor coypus presentó un patrón similar a otras especies de mamíferos en cuanto al lugar de recolección y estadio de desarrollo con el que ingresa al útero, lo cual favorece el desarrollo de estudios comparativos y puede posibilitar la aplicación de embriotecnologías.

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