Análisis de la producción y frecuencia de microsporas no reducidas en diploides de Turnera sidoides (Turneraceae)

 

Andrea F. Panseri¹, J. Guillermo Seijo^1,2 y Viviana G. Solís Neffa^1,3*

¹Instituto de Botánica del Nordeste (UNNE-CONICET), Sargento Cabral 2131. 3400 Corrientes (Argentina).
²Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura (UNNE).
³Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE).
*Autor para correspondencia, viviana@agr.unne.edu.ar

 

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Resumen: Turnera sidoides es un complejo poliploide (x= 7) de hierbas rizomatosas, perennes y distilas, que incluye cinco subespecies. Debido a la alta frecuencia de poliploides en el complejo, los estudios que se llevan a cabo actualmente están orientados a la comprensión de los mecanismos involucrados en el origen y establecimiento de los mismos a fin de proveer evidencias sobre los patrones evolutivos que operan en T. sidoides. En este trabajo se investiga la producción y frecuencia de microsporas no reducidas en plantas diploides provenientes de nueve poblaciones naturales pertenecientes a cuatro subespecies de T. sidoides, mediante el análisis del rango de variación del tamaño del polen y de la constitución de las esporadas. Los resultados obtenidos mostraron que casi todas las poblaciones estudiadas producen microsporas 2x y 4x, tanto en las flores brevistilas como en las longistilas. Asimismo, el análisis realizado aportó evidencias que sustentan la poliploidización sexual como uno de los mecanismos involucrados en el origen de los poliploides dentro del complejo. Se discute, además, el papel del polen no reducido en el establecimiento y la persistencia de los poliploides formados de novo en las poblaciones diploides de la especie.

Palabras clave: Turnera sidoides; Autopoliploidía; Gametos no reducidos.

Summary: Analysis of the production and frequency of unreduced microspores in diploids of Turnera sidoides (Turneraceae). Turnera sidoides is a polyploid complex (x= 7) of dystilous perennial rhizomatous herbs that includes five subspecies. Owing to the high frequency of polyploids within the complex, ongoing studies in T. sidoides are focused on the understanding of the mechanisms involved in the origin and the establishment of polyploids in order to provide evidences of the evolutionary patterns in T. sidoides. In this report we investigate the occurrence and frequency of unreduced microspores in diploid plants from nine natural populations of four subspecies of T. sidoides by analyzing the range of variation of pollen volume and the constitution of the sporads. The results obtained showed that almost all the populations studied produced 2x and 4x microspores, both in short and long-styled floral morphs. Furthermore, the analysis performed provided evidences that support the hypothesis of sexual polyploidization as one of the mechanisms involved in the origin of polyploids within this species complex. The role of unreduced pollen in the establishment and persistence of newly formed polyploids within diploid populations of T. sidoides is also discussed.

Key words: Turnera sidoides; Aautopolyploidy; Unreduced gametes.

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Introducción

Turnera sidoides L. es un complejo de hierbas rizomatosas perennes, que se distribuye desde el sur de Bolivia, Paraguay y Brasil, hasta Uruguay y Argentina, donde alcanza los 39º S. Es una especie alógama, debido a que es distila y autoincompatible, en particular a nivel diploide. Crece en poblaciones discretas, constituidas por decenas hasta centenas de individuos, que pueden estar separadas por pocos o cientos de kilómetros (Arbo, 1985; Solís Neffa, 2000). En el tratamiento taxonómico más reciente, Arbo (1985) reconoció cinco subespecies que se diferencian principalmente en el grado de incisión de la lámina foliar, en el indumento de los especimenes y en el grado de desarrollo de la heterostilia.
Los estudios citogenéticos han demostrado la ocurrencia de diferentes niveles de ploidía en todas las subespecies, con un número básico de x= 7 (Fernández, 1987; Solís Neffa & Fernández, 2001; Solís Neffa & Seijo, 2003; Solís Neffa et al., 2004). Se han observado citotipos diploide (2n= 2x= 14), tetraploide (2n= 4x= 28) y hexaploide (2n= 6x= 42) en las subespecies carnea (Cambess.) Arbo, holosericea (Urb.) Arbo, pinnatifida (Juss. ex Poir.) Arbo e integrifolia (Griseb.) Arbo. En esta última subespecie también se ha citado el citotipo octoploide (2n= 8x= 56). Turnera sidoides subsp. sidoides es principalmente tetraploide, aunque se han encontrado individuos aneuploides probables segregantes de un pentaploide (Fernández, 1987). Considerando al complejo en general, los diploides de las distintas subespecies presentan áreas reducidas, los tetraploides son los que presentan la mayor distribución, mientras que las poblaciones con niveles de ploidía más altos son raras y disyuntas (Solís Neffa & Fernández, 2001; Solís Neffa et al., 2004). Los análisis cariotípicos en conjunto con los datos meióticos y biosistemáticos preliminares sugieren que este complejo se ha originado por diferentes eventos de autopoliploidía (Fernández, 1987; Solís Neffa, 2000; Solís Neffa & Fernández, 2002). Debido a la alta frecuencia de poliploides en el complejo, actualmente los estudios que se llevan a cabo están orientados a la comprensión de los mecanismos involucrados en el origen y establecimiento de los mismos a fin de proveer evidencias sobre los patrones evolutivos que operan en T. sidoides.
El origen de poliploides en las plantas con flores puede ocurrir por duplicación cromosómica somática o por poliploidización sexual. Esta última consiste en la fusión de gametos no reducidos (2x y 4x) y es considerada el principal mecanismo involucrado en el origen de los poliploides (Karpechenko, 1927; Darlington, 1937, 1965; Harlan & De Wet, 1975; De Wet, 1980; Bretagnolle & Thompson, 1995). Asimismo, se ha propuesto que la producción de gametos no reducidos favorecería el establecimiento de los poliploides en las poblaciones diploides (Fowler & Levin, 1984; Levin, 1983; Van Dijk et al., 1992).
En un programa de cruzamientos diseñado para evaluar las relaciones genómicas y la filogenia en Turnera, se obtuvieron algunos híbridos interespecíficos que presentaban un nivel de ploidía inesperado considerando el número cromosómico de los parentales utilizados. A partir de estos resultados se sugirió que uno de los progenitores habría contribuido con un gameto no reducido y se propuso que este tipo de gametos podría haber participado en el origen de los poliploides del género (Fernández & Arbo, 1990, 2000a,b; Fernández & Solís Neffa, 2004). Una evidencia adicional a esta hipótesis se obtuvo a partir del análisis del polen en T. sidoides, en el cual se observaron granos gigantes que fueron interpretados como no reducidos (Solís Neffa, 2000). Sin embargo, aún no se conoce la frecuencia con que se produce este tipo de microsporas en las poblaciones diploides, ni tampoco cual sería la importancia de la poliploidización sexual en el surgimiento de poliploides en el complejo.
Por tal motivo, en este trabajo se investiga la ocurrencia de microsporas no reducidas y se determina su frecuencia en diploides de cuatro subespecies de T. sidoides, a fin de contribuir a la comprensión del mecanismo de origen de los poliploides en este complejo.

Material y Método

Se analizaron individuos provenientes de nueve poblaciones diploides de T. sidoides coleccionados en diferentes localidades del área de distribución (Tabla 1). Los herbarios donde fueron depositados los ejemplares testigo se citan en la Tabla 1. Los números cromosómicos de los individuos analizados fueron determinados previamente en mitosis o meiosis (Fernández, 1987; Solís Neffa & Fernández, 2001; Solís Neffa & Seijo, inédito).

Tabla 1. Información sobre el material de Turnera sidoides analizado.

Las plantas fueron coleccionadas en poblaciones naturales y transportadas a Corrientes (Argentina), donde se mantienen cultivadas en un invernáculo del Instituto de Botánica del Nordeste. El muestreo en el campo se realizó tratando de incluir tanto flores brevistilas (B) como longistilas (L). Sin embargo, debido a que esta especie presenta cortos períodos de floración y a que las flores son efímeras (Solís Neffa, 2000), las plantas fueron frecuentemente coleccionadas en estado vegetativo, por lo cual en la mayoría de las poblaciones cultivadas que se analizaron sólo se disponía de un único tipo floral (Tabla 2).

Tabla 2. Variación del volumen del polen y porcentaje de polen gigante. B: flor brevistila y L: flor longistila.

La detección de microsporas no reducidas y la estimación de su frecuencia fueron realizadas mediante el análisis de la distribución del volumen del polen y la constitución de las esporadas. Para minimizar la variación atribuible al ambiente, las muestras fueron obtenidas de plantas cultivadas en condiciones homogéneas de invernáculo durante al menos un año, de acuerdo con las sugerencias de Clausen (1962) y Mazer & Hultgård (1993).
Las muestras de polen fueron coloreadas con carmín:glicerina (1:1). Se midieron en promedio 150 granos por flor, tratando de incluir distintas flores e individuos por población de acuerdo con la O'Rourke, 1991), donde p es la distancia entre el disponibilidad de material. Solamente fueron medidos ángulo apertural y el punto medio del lado opuesto. los granos viables (coloreados) que presentaban Para cada población se calculó la media, el desvío morfología normal. El volumen de los granos de polen estándar, el rango de variación y la distribución del fue estimado según la fórmula 1/6πp³ (Buchmann & volumen del polen. En las poblaciones en las que se contaba con ambos tipos florales, las medidas fueron estimadas independientemente para las flores B y L, debido a que previamente se comprobó que el volumen del polen varía con los tipos florales (Solís Neffa, 2000). Los granos de polen que mostraron un volumen 1.6 veces mayor que la media de cada población y tipo floral fueron considerados gigantes (no reducidos) de acuerdo con los criterios propuestos por diferentes autores (Darlington, 1965; Orjeda et al., 1990; Ramsey & Schemske, 1998).
A fin de confirmar la producción de gametos no reducidos, se analizó la constitución de las esporadas en botones florales jóvenes fijados en etanol absoluto:ácido láctico (5:1) (Fernández, 1973) durante 12 h a 4° C, conservados en etanol 70 % a 4° C y coloreados con carmín:glicerina (1:1). Se registró el número de tétradas, tríadas, díadas, monadas y otros tipos de esporadas. En base a la frecuencia observada de cada uno de estos tipos de esporadas se calcularon las frecuencias esperadas de polen x, 2x y 4x, considerando que las tétradas forman cuatro gametos x, las díadas dos gametos 2x, las tríadas dos gametos x y uno 2x, mientras que las mónadas originan gametos 4x.

Resultados

Los resultados obtenidos mostraron que la mayoría de las poblaciones de T. sidoides analizadas producen microsporas 2x y 4x, tanto en las flores brevistilas como en las longistilas (Tablas 2 y 3, Fig. 1 y 2).

Tabla 3. Constitución de las esporadas y porcentajes de polen x, 2x y 4x esperados. B: flor brevistila y L: flor longistila.

Fig. 1. Variación del tamaño del polen en Turnera sidoides. A-C: S₁₈₈. A y B: Polen reducido de flores brevistila (A) y longistila (B). C: Polen no reducido (flor brevistila). D: S₁₈₇, Polen reducido y no reducido (flor longistila). Las flechas señalan polen no reducido. Barra: 20µm.

Fig. 2. Esporadas de Turnera sidoides. A: Tétrada. B: Tríada. C: Díada. D: Mónada. Barra: 20µm.

Dentro de las poblaciones, se observó un claro dimorfismo en el volumen del polen entre los tipos florales, presentando las flores brevistilas granos más grandes que las longistilas (Tabla 2, Fig. 1 A y B). En las flores brevistilas la media varió entre 40,27 y 96,97 x 10³ μm³, mientras que en flores longistilas varió entre 20,78 y 39,76 x 10³ μm³ (Tabla 2). La distribución del volumen de los granos de polen fue unimodal en algunas poblaciones, pero en otras fue bimodal. La frecuencia de granos gigantes varió entre poblaciones, tipos florales de una misma población (Fig. 1 C y D, Tablas 2 y 3) y aún entre individuos de un mismo tipo floral.
El análisis de las esporadas (Tabla 3) demostró que la mayoría de las poblaciones producen, además de tétradas normales (Fig. 2 A), tríadas (Fig. 2 B), díadas (Fig. 2 C), mónadas (Fig. 2 D) y políadas en ambos tipos florales. Todas las configuraciones anormales mencionadas, excepto las políadas, forman microsporas no reducidas. El número de microsporas no reducidas esperadas para cada población y tipo floral se presentan en la Tabla 3.

Discusión

El análisis realizado documenta la producción de microsporas no reducidas en plantas diploides de cuatro subespecies de T. sidoides y sustenta la hipótesis de que la poliploidización sexual sería uno de los mecanismos involucrados en el origen de los poliploides de este complejo.
Los resultados obtenidos aportaron diferentes evidencias que sugieren que los granos de polen gigantes observados en T. sidoides son no reducidos. Primero, el volumen de los mismos en relación con la media de cada población se encuentra en el rango propuesto por diversos autores como típico de gametos no reducidos (Darlington, 1965; Orjeda et al., 1990; Ramsey & Schemske, 1998). Segundo, la distribución bimodal del volumen del polen, como la observada en algunas plantas de este trabajo, constituye uno de los criterios más usados para seleccionar plantas con alta producción de gametos no reducidos (Orjeda et al., 1990; Ramsey & Schemske, 1998). Tercero, el análisis de las esporadas mostró la presencia de tríadas y díadas, lo que constituye una prueba de que esas plantas producen granos 2x. Asimismo, la ocurrencia de mónadas evidencia la formación de polen 4x.
En relación con el origen de los poliploides, se ha sugerido que los mismos pueden surgir por tres mecanismos diferentes: 1) por poliploidización sexual en poblaciones diploides, 2) por un híbrido intermediario productor de gametos 2x, y 3) por hibridación seguida de duplicación somática (Harlan & De Wet, 1975). La presencia de polen no reducido en plantas diploides no híbridas de las cuatro subespecies de T. sidoides con citotipo diploide sustenta la hipótesis de que la formación de poliploides en el complejo podría ocurrir mediante poliploidización sexual (Solís Neffa, 2000) y concuerda con la proposición que sostiene que este mecanismo es uno de los más importantes en el origen de autopoliploides en plantas (Harlan & de Wet, 1975).
La poliploidización sexual puede ocurrir de forma unilateral o bilateral, las que implican diferentes etapas en el origen de los poliploides en las poblaciones naturales diploides (Harlan & de Wet, 1975; Bretagnolle & Thompson, 1995; Ramsey & Schemske, 1998). La primera contempla la formación de un poliploide impar por fusión de un gameto reducido con uno no reducido. Estos poliploides podrían actuar como puente intermediario para el origen de poliploides pares si producen gametos balanceados no reducidos, y éstos a su vez se fusionan con gametos no reducidos de otros individuos diploides o triploides. El segundo mecanismo, en cambio, contempla la formación de un poliploide par por fusión de una micróspora y una megáspora no reducidas en un solo paso, sin la formación de un poliploide impar intermediario.
Teniendo en cuenta que T. sidoides es distila y alógama, siendo los cruzamientos legítimos aquellos entre flores longistilas x flores brevistilas o los recíprocos (Solís Neffa, 2000), los gametos no reducidos deberían producirse en los dos tipos florales y en ambas líneas germinales para que ocurra la poliploidización sexual bilateral. Nuestros resultados demuestran que tanto polen 2x como 4x son producidos por ambos tipos florales, cumpliendo con una de las premisas necesarias para que este mecanismo pueda ocurrir. Por otra parte, el hecho que en T. sidoides todos los poliploides hasta ahora analizados tienen números de complementos cromosómicos pares (excepto un probable pentaploide inferido a partir de sus segregantes) (Fernández, 1987; Solís Neffa & Fernández, 2001; Solís Neffa & Seijo, 2003; Solís Neffa et al., 2004) sustenta la hipótesis de que la poliploidización sexual bilateral sería uno de los mecanismos involucrados en el origen de los poliploides del complejo. El análisis de la progenie de cruzamientos dirigidos en curso permitirá demostrar si también se producen megásporas no reducidas.
La producción de polen no reducido en poblaciones de T. sidoides también podría contribuir al establecimiento y persistencia de los neopoliploides formados en las poblaciones diploides. Se ha propuesto que las oportunidades de establecimiento de los poliploides originados por poliploidización sexual aumentan en la medida que se incrementa la probabilidad de cruzamiento con diploides cercanos productores de gametos no reducidos (Thompson & Lumaret, 1992). En especies alógamas, esta probabilidad es mayor cuando las poblaciones son pequeñas, las plantas son perennes y tienen la capacidad de multiplicarse vegetativamente. Además, como la producción de gametos no reducidos es un carácter heredable (Bretagnolle & Thompson, 1995), esta probabilidad es aún mayor si la especie tiene bajo potencial de dispersión de polen y semillas. Turnera sidoides reúne las condiciones descriptas ya que es una hierba perenne, rizomatosa, crece generalmente en poblaciones discretas de pocos individuos, y a pesar de que es una especie entomófila y el polen puede ser transportado a cierta distancia, las semillas son dispersadas por gravedad o mirmecocoria, tendiendo a concentrar los individuos en áreas localizadas próximas a la planta madre (Solís Neffa, 2000). Por lo tanto, los descendientes de los individuos productores de gametos 2x tenderán a permanecer próximos, aumentando la probabilidad de que dos gametos 2x se fusionen para originar un poliploide.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por subsidios otorgados por la Agencia Nacional de Promoción Científica, Tecnológica y de Innovación (ANPCyT-FONCyT, PICT 01-14674), el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, CONICET (PIP 5998) y la Secretaría General de Ciencia y Técnica -Universidad Nacional del Nordeste (SECyT-UNNE, PI-013/04). Las colecciones fueron financiadas parcialmente por la Myndel Botanica Foundation.

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Recibido el 6 de Septiembre de 2007
Aceptado el 11 de Marzo de 2008.