MICOLOGÍA

Micorrizas arbusculares y endófitos septados oscuros en Gentianaceae nativas de la Argentina

 

Leonardo A. Salvarredi¹, Esteban M. Crespo², Eugencia Menoyo¹, Eva M. Filippa³, Gloria E. Barboza³ y Mónica A. Lugo¹

¹ IMIBIO-CONICET, FQByF-UNSL
² Diversidad-Vegetal I, FQByF-UNSL
³ IMBIV-CONICET-UNC y FCQ-UNC
E-mail: lugo@unsl.edu.ar

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Resumen: Se estudió la colonización de raíces por simbiontes fúngicos en cinco especies de Gentianaceae nativas distribuidas en distintos ambientes de la Argentina, cuatro pertenecientes a Gentianella y una a Gentiana. Se observaron estructuras micorrícicas arbusculares pertenecientes al tipo Paris (hifas y circunvoluciones intracelulares) y endófitos septados oscuros (SO) (hifas y microesclerocios). Tres de las especies estudiadas se asociaron a micorrizas arbusculares (MA) y SO, una sólo a SO y otra sólo a MA. La colonización radical por SO (hifas y microesclerocios) y la colonización hifal MA difirieron con el hospedante. Este es el primer reporte de colonización por MA y SO en Gentianella helianthemoides, G. magellanica, G. parviflora y Gentiana prostrata. Se discute la influencia del hospedante y del ambiente en la colonización por MA y SO.

Palabras clave: Endófitos radicales; Preferencia del hospedante; Gentiana; Gentianella; Patrón de colonización Paris.

Summary: Arbuscular mycorrhizas and dark septates endophytes in native Gentianaceae from Argentina. The roots of five native species of Gentianaceae distributed in different environments of Argentina, four belonging to Gentianella and one to Gentiana, were studied for fungal symbionts colonization. Arbuscular mycorrhizal structures belonging to Paris type (intracellular hyphae and coils) and dark septates endophytes (DS) (hyphae microesclerotia) were observed. Three of the species studied were associated to both arbuscular mycorrhizas (AM) and DS, only one to DS and the other only to AM. Root colonization by DS (hyphae and microesclerotia) and AM hyphal colonization were host dependent. This is the first report of AM and DS colonization for Gentianella helianthemoides, G. magellanica, G. parviflora and Gentiana prostrata. Host and environmental influence on AM and DS colonization is discussed.

Key words: Root endophytes; Host preference; Gentiana; Gentianella; Paris colonization pattern.

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INTRODUCCIÓN

Gentianaceae es una familia con ca. 87 géneros, que incluye 6 tribus y ca. 1700 especies (Struwe et al., 2002). De distribución cosmopolita, habita en regiones templadas y subtropicales, aunque está ausente en la Antártida. Son plantas de hábito generalmente herbáceo y muy pocas leñosas; presentan distintas estrategias metabólicas, siendo la gran mayoría de las especies autotróficas y solamente 30 son aclorófilas y micoheterotróficas (Smith & Read, 2008). En Argentina se han registrado 10 géneros y 42 especies de Gentianaceae. En particular, Gentianella Moench y Gentiana L. están representados por 29 y una especie, respectivamente (Filippa & Barboza, 2006, 2008). Las especies incluidas en Gentianella están distribuidas a lo largo de la Cordillera de los Andes, sobre suelos pedregosos y en pastizales de "vegas" altas, hasta 4500 m, dentro de las provincias biogeográficas Altoandina, Puneña y Prepuneña. En las Yungas se las encuentra bajo la protección de bosques de Alnus sp., en las provincias biogeográficas Patagónica, Subantártica e Insular son comunes en vegas y turberas, mientras que en las provincias Chaqueña y del Monte se encuentran en serranías que superan los 1000 m. Gentianella magellanica y G. multicaulis son las especies de distribución geográfica más extensa, llegando la primera hasta Tierra del Fuego e Islas Malvinas (Filippa& Barboza, 2006, 2008). En el caso de Gentiana, la única especie sudamericana es G. prostrata, que habita a lo largo de la zona cordillerana en vegas, mallines y turberas, desde Venezuela hasta Tierra del Fuego, entre los 1800 a 4500 m (Fabris, 1983; Filippa & Barboza, 2008).
Cabe destacar que las entidades de Gentianaceae se caracterizan por la presencia mayoritaria de secoiridoides y xantonas, por lo que son empleadas en etnomedicina como antihepatotóxicas y como tónicos digestivos y, además, en la industria alimenticia son utilizadas en la preparación de aperitivos (Jensen & Schripsema, 2002). En nuestro país, se registran distintas especies nativas de Centaurium Hill emend. Adans., Gentiana y Gentianella empleadas con la misma finalidad (Filippa & Barboza, 2006; Barboza et al., 2009), habiéndose comprobado además, actividad antimicrobiana y antiinflamatoria en Gentianella multicaulis (sub nom. G. achalensis (Gilg) Ho & Liu) (Nadinic et al., 1997, 2002).
La mayoría de las plantas terrestres presentan asociaciones micorrícicas arbusculares (MA), siendo éste el tipo más común de asociación en ecosistemas naturales (Smith & Read, 2008). Los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HMA) son representantes de Glomeromycota (Schübler et al., 2001), en su mayoría biótrofos que colonizan por medio del micelio intrarradical la corteza de la raíz y desarrollan, además, micelio extrarradical que beneficia a la planta en la absorción de nutrientes minerales (principalmente fosfatos) y agua del suelo. El micelio intrarradical puede presentar dos patrones de colonización extremos, caracterizados por la distribución diferencial de estructuras micorrícicas dentro del hospedante: el tipo Arum, donde se observa la presencia de hifas intercelulares y arbúsculos; y el tipo Paris, caracterizado por la colonización intracelular de hifas que forman circunvoluciones típicas y arbusculadas y una distribución intercelular escasa o nula de hifas en la corteza (Smith & Read, 2008). Entre ambos patrones de colonización se observa un continuo de tipos intermedios que varía en función de las especies involucradas (planta-hongo), las características del suelo y las condiciones nutricionales de la especie vegetal (Dickson, 2004).
Por otra parte, las raíces de las plantas pueden ser colonizadas por un grupo diverso de hongos, denominados endófitos septados oscuros (SO), cuyo nivel de asociación puede variar desde patogénico hasta mutualista (Jumpponen, 2001), condición, esta última, que resulta en un incremento en la biomasa del hospedante y una mayor captación de nutrientes como P y N (Jumpponen et al., 1998). La colonización por SO sigue un patrón común en la mayoría de las plantas; inicialmente, las hifas toman contacto con la superficie radical y forman una red micelial, tanto en la superficie como en el interior de la raíz. Las hifas pueden ingresar a la raíz a través de pelos radicales, células epidérmicas, células del meristema apical o por medio de las heridas generadas a partir de las zonas de emergencia de raíces laterales. Una vez en el interior de la raíz, las hifas invaden las células epidérmicas y corticales, en donde pueden observarse grupos de hifas melanizadas, compactas y con paredes engrosadas, llamadas microesclerocios. Estas estructuras han sido consideradas como estructuras de resistencia frente a condiciones adversas (Peterson et al., 2004).
A nivel mundial, es escaso el registro de Gentianaceae asociadas simultáneamente a ambos endófitos de raíz (HMA y SO), así como también la sola asociación con MA (Harley & Harley, 1987; Wang & Qiu, 2006). En todos los casos, la asociación que se establece corresponde morfológicamente al tipo Paris (Smith & Read, 2008). Cabe mencionar que en referencia al total de especies representantes de las distintas estrategias nutricionales en Gentianaceae, una mayor proporción de los estudios sobre las asociación con MA se han enfocado en especies micoheterótrofas (Imhof, 1999; Bidartondo et al., 2002; Franke, 2002; Franke et al., 2006; Wang & Qiu, 2006). En contraste, es escaso el estudio de las interacciones MA y Gentianaceae autototróficas, representadas por más de 1000 especies (Jacquelinet-Jeanmougin & Gianinazzi-Pearson, 1983; McGee, 1985; Jacquelinet-Jeanmougin et al., 1987; Wang & Qiu, 2006; Sy´korová et al., 2007). En nuestro país, sólo se ha registrado la presencia de asociación MA y SO en una especie nativa (Menoyo et al., 2007).
Los objetivos del presente trabajo fueron: a) estudiar la colonización radical por HMA y SO en representantes nativos de interés medicinal de Gentiana y Gentianella, que habitan distintos ambientes de la Argentina; b) aportar datos básicos sobre las interacciones micorrícicas potencialmente útiles en la generación de cultivos para el aprovechamiento industrial de estas especies.

MATERIALES Y MÉTODOS

Áreas de estudio y especies estudiadas

Se recolectaron seis individuos de Gentianella multicaulis (Gillies ex Griseb.) Fabris y cinco de G. parviflora (Griseb.) T. N. Ho en Córdoba, Dpto. San Alberto, Pampa de Achala, ca. 2100 m (Filippa et al. 72 y Filippa et al. 73, respectivamente); nueve individuos de G. magellanica (Gaudich.) Fabris ex D. M. Moore en Neuquén, Dpto. Picunches, ca. 1870 m (Barboza et al. 1222); seis individuos de G. helianthemoides (Gilg) Fabris en Salta, Dpto. Chicoana, Quebrada de La Sirena (Barboza et al. 709); y dos individuos de Gentiana prostrata Haenke en Jujuy, Dpto. Humahuaca, Mina Aguilar, ca. 3650 m (Negritto et al. 195). Los sitios de recolección para cada especie se eligieron de acuerdo a la abundancia de individuos, los que se recolectaron al azar en el período de floración-fructificación (entre febrero y abril). Los materiales de referencia fueron depositados en el herbario CORD.

Detección y cuantificación de endófitos (HMA y SO) de raíz

Las raíces de cada uno de los individuos recolectados fueron separadas y lavadas con agua corriente, eligiéndose luego las más delgadas (no lignificadas), las que se clarificaron y tiñeron siguiendo la metodología de Phillips y Hayman (1970). Finalmente, se montaron en alcohol polivinílico de acuerdo a Omar et al. (1979); por cada individuo se realizó un preparado microscópico.
Las raíces fueron observadas a 400x en un microscopio Olympus BH-2, cuantificándose al menos 100 intersecciones por preparado. Las micrografías se obtuvieron con una cámara digital Sony DSC-H9.
El porcentaje de colonización MA se determinó usando el método de las intersecciones de McGonigle et al. (1990) cuantificándose arbúsculos, vesículas e hifas de HMA; además, para la cuantificación de SO se siguió a Lugo et al. (2009), registrándose el porcentaje de hifas (%SO) y microesclerocios (%MESO).

Tipo de colonización MA y SO

Para la caracterización morfo-anatómica de la colonización radical MA se consideró la localización de las hifas (intracelular o intercelular), la presencia de arbúsculos, vesículas y circunvoluciones típicas y arbusculadas (Smith & Read, 2008).
En cuanto a la colonización por SO, se consideró la distribución del micelio pigmentado y la morfología de los microesclerocios según lo descripto por Barrow (2003), Barrow & Aaltonen (2001) y Jumpponen & Trappe (1998).

Análisis estadístico

Las variables porcentaje de colonización por hifas de HMA y SO se analizó considerando la especie hospedante mediante ANAVA no paramétrico (Kruskal Wallis) y test a posteriori de comparaciones múltiples. La variable %MESO fue analizada con el test no paramétrico de Mann Whitney, considerando como factor a la especie hospedante. Además, en cada hospedante se analizó la relación entre las variables porcentaje de colonización por hifas de HMA y SO mediante correlaciones de Spearman, excepto en G. prostrata donde se recolectaron solamente dos ejemplares. Todos los análisis se efectuaron con a = 0.05, utilizando el programa Infostat versión Beta 2001.

RESULTADOS

Cuantificación de la colonización radical

La colonización MA y por SO varió entre las distintas especies de Gentianaceae, observándose una diferencia significativa en relación al hospedante (H=17,98214, p= 0,00039 y H=17,73941, p=0,00095, respectivamente) (Fig. 1). Gentianella multicaulis presentó los mayores niveles de colonización por ambos endófitos, determinándose la presencia de vesículas y arbúsculos (Tabla 1), mientras que en G. magellanica se observaron vesículas y circunvoluciones (Fig. 2 B). Gentianella multicaulis, G. magellanica y Gentiana prostrata estuvieron simultáneamente colonizadas por hifas de HMA y de SO (Tabla 1), sin observarse una correlación significativa en la colonización por ambos endófitos (G. magellanica r=-0,1167 y p=0,74 y en G. multicaulis r=-0,3143 p=0,48). Gentianella parviflora presentó exclusivamente colonización por SO, mientras que en G. helianthemoides se detectaron los niveles más bajos de colonización por HMA, sin observarse colonización por SO (Tabla 1). Por otro lado, en G. multicaulis y Gentiana prostrata, se determinó la presencia de microesclerocios sin detectarse diferencias significativas entre los hospedantes (W=3; p=0,07).

Fig. 1. Porcentaje de colonización por hifas de HMA y SO para las Gentianaceae estudiadas. Los datos son medias y errores estándares; se usaron letras diferentes para indicar diferencias significativas (p<0,05).

Fig. 2. Patrones de colonización de HMA y SO. A-B-C: Gentianella magellanica. A, colonización tipo Paris con circunvoluciones arbusculadas en células radicales contiguas; B, vesícula intercelular; C, co-ocurrencia de hifas de HMA y microesclerocios de SO. D, G. multicaulis, hifas intercelulares y microesclerocio laxo de SO; Abreviaturas: (ca) circunvoluciones arbusculadas, (hi) hifa intracelular, (hs) hifa de SO, (me) microesclerocio, (vi) vesícula intercelular. Barras: A=12mm, B=6,5mm, C y D= 5mm.

Tabla 1. Porcentaje de colonización MA (hifas, vesículas y arbúsculos) y SO (hifas y microesclerocios -MESO-), en los distintos hospedantes. Los datos representan la media ± error estándar.

Tipo de colonización por HMA y SO

En todos los casos donde se determinó la presencia de HMA la colonización fue exclusivamente intracelular, observándose hifas y circunvoluciones típicas y arbusculadas (Fig. 2 A).
La colonización por SO presentó hifas intercelulares pigmentadas en los tejidos corticales de la raíz y se cuantificó en G. multicaulis, G. magellanica, G. parviflora y Gentiana prostrata (Tabla 1); también se observaron microesclerocios en G. magellanica, G. multicaulis y Gentiana prostrata, cuantificándose en estos dos últimos taxones. Cabe mencionar que la morfología de los microesclerocios difirió entre G.magellanica (Fig. 2 C) y G. multicaulis (Fig. 2 D).

DISCUSIÓN

En este trabajo se cita por primera vez la co-ocurrencia de MA y SO en Gentianella magellanica y Gentiana prostrata, así como la presencia de MA en G. helianthemoides y de SO en G. parviflora. Además, se cuantificó la colonización de ambos endófitos de raíz en todas las especies estudiadas.
La presencia de hifas intracelulares y circunvoluciones típicas y arbusculadas, permitieron determinar el tipo de colonización Paris (Smith & Read, 2008) en todas las especies analizadas, coincidiendo con lo registrado para otras Gentianaceae exóticas (Jacquelinet-Jeanmougin & Gianinazzi-Pearson, 1983; McGee, 1985; Jacquelinet-Jeanmougin et al., 1987; Smith & Read, 2008) y en la especie nativa G. multicaulis (Menoyo et al., 2007)
En distintas familias de hospedantes, no existe especificidad hospedante-HMA en sentido estricto (Helgason et al. 2002; Vandenkoornhuyse et al., 2002; Scheublin et al., 2004). En Gentianaceae autotróficas, mediante herramientas moleculares se ha registrado una preferencia diferencial hospedante-HMA (Sy´korová et al., 2007), mientras que en especies micoheterótrofas se ha observado especificidad por el simbionte fúngico (Bidartondo et al., 2002). En este trabajo, las variaciones observadas en el porcentaje de colonización MA y SO podrían asociarse a la influencia de la especie hospedante sobre la colonización por HMA y SO. Sin embargo, se debe considerar que la mayoría de las especies estudiadas fueron recolectadas en distintos hábitat, por lo que la colonización MA podría estar influenciada por factores ambientales tales como la disponibilidad de nutrientes, luz y temperatura (Sanders & Fitter, 1992; Smith & Read, 2008). Cabe mencionar que G. multicaulis y G. parviflora fueron recolectadas simultáneamente en el mismo sitio, observándose, respectivamente, presencia y ausencia de colonización micorrícica y una diferencia significativa en la colonización por
SO. Por lo tanto, en este caso, la influencia del hospedante sobre la colonización por HMA y SO sería mayor que la de los factores ambientales. Asimismo, el elevado nivel de colonización MA determinado en G. multicaulis coincide con lo reportado por Menoyo et al. (2007). Estas observaciones permitirían reforzar la hipótesis de un efecto del hospedante sobre la colonización MA y por SO, la que podría ser confirmada en futuros estudios con condiciones controladas para los distintos hospedantes.
Por otra parte, en contraste con la ubicuidad de los SO, el conocimiento de su interacción con MA es escaso; sin embargo, el estudio de estas interacciones ha adquirido en la actualidad una renovada atención (Urcelay et al., 2005; Li & Guan, 2007). En el presente trabajo, si bien la correlación negativa entre la colonización por HMA y SO no fue significativa, la co-ocurrencia de ambos endófitos en tres especies analizadas plantea interrogantes para futuros estudios acerca del significado ecológico de esta doble asociación en Gentianaceae. Asimismo, estos conocimientos podrían considerarse en el desarrollo de prácticas agronómicas efectivas en el aumento de la productividad de estos hospedantes con miras a su cultivo.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo de investigación se realizó en el marco del proyecto PROIPRO 2-0302, financiado por la FQByF (UNSL) y contó también con aportes de la Secretaría de Ciencia y Tecnología (UNC), Ministerio de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Córdoba y CONICET. Los autores agradecen a la Lic. en Cs. Biológicas M. Polanco por la tinción de las muestras.

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Recibido el 26 de marzo de 2010
Aceptado el 28 de mayo de 2010