ARTÍCULOS ORIGINALES

Rol del xantano en la formación de biopelículas durante la vida epifítica de Xanthomonas citri subsp. citri y su relación con el desarrollo del cancro.

Luciano A. Rigano*, Florencia Siciliano**, Ramón Enrique**, Lorena N. Sendín***, María P. Filippone***, Pablo S. Torres*, Julia Qüesta**, J. Maxwell Dow****, Atilio P. Castagnaro***, Adrián A. Vojnov* y María R. Marano**

*Fundación Pablo Cassará, Centro de Ciencia y Tecnología “Dr. César Milstein”, Buenos Aires, R. Argentina. marano@ibr-conicet.gov.ar
** Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-Conicet), Área Virología, Departamento Microbiología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario.
*** Sección Biotecnología, EEAOC-Conicet, Instituto de Tecnología Agroindustrial del Noroeste Argentino (Itanoa).
**** Biomerit Research Centre, Department of Microbiology, National University of Ireland , Cork , Ireland .

---

Resumen

La mayoría de las bacterias fitopatógenas viven de forma epifítica sobre las plantas antes de la colonización y sobreviven en la superficie del tejido del hospedante, mediante la formación de biopelículas. La capacidad para producir exopolisacáridos es crítica para la formación de las mismas en diversas bacterias. En este trabajo, se estudió la formación de biopelículas de X. citri subsp. citri, bacteria responsable de la cancrosis de los cítricos, y su relación con la supervivencia epifítica y el desarrollo del cancro sobre hojas de plantas de limonero. Mediante tinción con cristal violeta y análisis de microscopía confocal de barrido láser, se observó que X. citri subsp. citri forma estructuras de biopelículas sobre hojas de limonero. En contraste, una cepa mutante defectiva en la biosíntesis del exopolisacárido xantano, denominada X. citri subsp. citri gumB, fue incapaz de formar dichas estructuras y su supervivencia epifítica y capacidad de desarrollar la enfermedad en la planta se vieron comprometidas. Estos resultados sugieren que la formación de biopelículas tiene una importancia clave en la fase epifítica de X. citri subsp. citri antes y durante el desarrollo del cancro.

Palabras clave: Citrus limon; Exopolisacáridos; Cancrosis; Microscopía confocal de barrido láser; Gen gumB.

Abstract
Role of xanthan in biofilm formation during Xanthomonas citri subsp. citri epiphytic life and its relationship to canker development

Almost all phytopathogenic bacteria have an epiphytic life before invading the host plant. These bacteria survive on the surface of the host tissue through biofilm formation. The ability to produce exopolysaccharides is critical for biofilm formation in several phytopathogenic bacteria. In this work, biofilm formation by Xanthomonas citri subsp. citri (bacterium responsible for citrus canker disease), and its relationship to epiphytic survival and canker development on lemon leaves were studied. Through crystal violet staining and confocal laser scanning microscopy analysis, it was observed that X. citri subsp. citri forms biofilm structures on lemon leaves. Furthermore, a X. citri subsp. citri gumB mutant strain, defective in production of exopolysaccharide xanthan, did not form a structured biofilm and showed reduced growth and survival on leaf surfaces, and reduced disease symptoms. These results suggest that biofilm formation has an important role in X. citri subsp. citri epiphytic survival prior to canker development.

Key words: Citrus limon; Exopolysaccharides; Citrus canker; Confocal laser scanning microscopy; GumB gene.

---

Introducción

La formación de biopelículas es fundamental en el ciclo de vida de muchos microorganismos. Las bacterias forman biopelículas cuando perciben una superficie, se adhieren a ella y, a continuación, elaboran señales químicas para coordinar la diferenciación y formación de estructuras, incluyendo la de una cubierta polisacárida protectora (Scott and Manning, 2003). Si bien la composición de la biopelícula es variable según el sistema de que se trate, en general su componente mayoritario es el agua, que puede representar hasta un 97% del contenido total. Además de agua y de las células bacterianas, la matriz de la biopelícula es un complejo formado principalmente por exopolisacáridos (EPS), proteínas,
lípidos y ácidos nucléicos (Branda et al., 2005; Southey- Pillig et al., 2005; Steinberger and Holden, 2005; Sutherland, 2001).
Se demostró que las biopelículas protegen a las bacterias del estrés ambiental, de los mecanismos de defensa del hospedero y de los compuestos antimicrobianos (Branda et al., 2005; Camilli and Bassler, 2006; Parsek and Fuqua, 2004), por lo que no es sorprendente que estén correlacionadas con la virulencia en numerosas bacterias (Fujishige et al., 2006; Laue et al., 2006). Se ha encontrado una asociación entre la formación de biopelículas y la virulencia para una variedad de infecciones bacterianas crónicas en humanos (Parsek and Singh, 2003). Sin embargo, hay pocos estudios sobre el rol de la formación de biopelículas en el desarrollo de enfermedades bacterianas en plantas (Crossman and Dow, 2004; Koutsoudis et al., 2006). La mayoría de las bacterias fitopatógenas viven de forma epifítica sobre las plantas antes de la colonización y el progreso de la enfermedad está directamente relacionado con el tamaño de la población epifítica del patógeno, la que a su vez depende de su capacidad para producir biopelículas (Hirano and Upper, 1983).
En la constitución de las biopelículas, se pueden diferenciar tres etapas: la primera es la de adhesión a la superficie, que se produce generalmente mediante apéndices bacterianos como los flagelos. Una vez que la adhesión es irreversible, comienza la segunda etapa, la etapa de crecimiento: las bacterias se dividen formando una microcolonia. Durante esta etapa, se produce la síntesis de exopolisacáridos que forman la matriz de la biopelícula, la que progresivamente toma una conformación tridimensional. Cuando la biopelícula ha alcanzado la madurez se produce la tercera etapa, en la que algunas células se liberan de la matriz para colonizar nuevas superficies.
La capacidad para producir EPS es crítica para la formación de biopelículas en diversas bacterias fitopatógenas. La composición de los EPS varía según la bacteria y las condiciones ambientales en las que estas se encuentren. Las bacterias del género Xanthomonas producen el xantano, un EPS constituido por unidades repetitivas de pentasacáridos con la estructura manosa-(β- 1,4)- ácido glucurónico-(β-1,2)-manosa-(α-1,3)-celobiosa (Jansson et al., 1975).
X. citri subsp. citri, responsable de la cancrosis de los cítricos, produce lesiones corchosas típicas denominadas“cancros” (Brunings and Gabriel, 2003), que constituyen la principal fuente de propagación de la enfermedad (Cubero and Graham, 2004). En este trabajo, se investigó la formación de biopelículas por parte de X. citri subsp. citri y su posible rol en la supervivencia epifítica y desarrollo del cancro. Se demostró que X. citri subsp. citri forma estructuras de biopelículas sobre las hojas de los cítricos.
En contraste, una cepa mutante defectiva en la biosíntesis de xantano fue incapaz de formar estructuras de biopelículas y se vio comprometida en su supervivencia epifítica y en su capacidad de desarrollar síntomas en plantas, por lo que se infiere que la formación de biopelículas sería importante en la fase epifítica de la enfermedad.

Materiales y métodos
Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

Se aisló la cepa salvaje de X. citri subsp. citri de hojas de limonero con síntomas típicos de cancrosis, en el laboratorio de la Sección Fitopatología de la Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC).
Las cepas se cultivaron a 28°C en medio nutritivo PYM: peptona 5 g/l, extracto de levadura 3 g/l y extracto de malta 3 g/l (Siciliano et al., 2006). Para los análisis de formación de biopelículas, se criaron las bacterias en medio mínimo, que contenía glucosa (1% p/v) como fuente de carbono (Sherwood, 1970). Se midió el crecimiento bacteriano con un espectrofotómetro Spectronic 20GEnesys (Termo Electron Corporation, Boston), a 600 nm. Los antibióticos kanamicina y gentamicina se utilizaron en concentraciones de 50 μg/ml y 10 μg/ml, respectivamente.

Obtención de una mutante de X. citri subsp. citri deficiente en la síntesis de xantano
Las técnicas moleculares utilizadas en este estudio se basaron en los protocolos descriptos previamente (Sambrook et al., 1989). El ADN genómico de la cepa de X. citri subsp. citri se extrajo de acuerdo a Chen and Kuo (1993). Se amplificó un fragmento de 1457 pb a partir de la región que codifica los genes gumB y gumC (involucrados en la síntesis de xantano), usando el par de cebadores AGTTACGTGTTGGCGATCTTGGC (sentido) y AATGGCGTGCGGTCTCTTTC (antisentido), diseñados a partir de las secuencias de X. citri subsp. citri disponibles en GenBank (AE008923) (da Silva et al., 2002). Cada reacción de PCR, de 50 μl, estuvo compuesta por: 0,2 μM de cada cebador; tampón de PCR 1x; 1,5 mM de MgCl₂; 0,2 mM de dNTPs; 75 ng de ADN y 1 U de Taq ADN polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo con un termociclador Mastercycler (Eppendorf, Hamburg, Alemania), usando las siguientes condiciones (35 ciclos): 95°C por 60 s, 63°C por 30 s y 72°C por 90 s. Todas las reacciones comenzaron con un paso de desnaturalización inicial de 95°C por 10 min y un único ciclo de extensión final de 72°C por 10 min. Los productos de PCR fueron observados mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (Sambrook et al., 1989). Las bandas correspondientes fueron purificadas a partir de gel, usando el “kit” de extracción de Qiaex II (Qiagen, Valencia, CA, USA), y fueron posteriormente clonadas en un vector pGEM-Teasy (Promega, Madison, WI, USA), para producir el plásmido pLR-XB. El fragmento gumB-C contiene un sitio de corte para la enzima de restricción BamHI. El fragmento de 2 kb que contiene el casete Kmr (Ω) de pAZ (Ω) (amablemente proporcionado por la Dra. Ángeles Zorreguieta, de la Fundación Instituto Leloir, Buenos Aires, R. Argentina) fue insertado en el sitio de corte de gumB, BamHI, generando una copia interrumpida del gen gumB.
Estas construcciones fueron digeridas con NotI y subclonadas en un vector suicida, pJQ200KS (Muller et al., 1993). El plásmido pSac-EPS generado fue introducido mediante electroporación en la cepa salvaje de Xanthomonas citri subsp. citri, siguiendo el protocolo descripto en Guilhabert et al. (2001). Las bacterias transformadas se seleccionaron en medio nutritivo PYM solidificado con 1,5% (p/v) de agar, 50 μg/ml de kanamicina y 5% de sacarosa (Muller et al., 1993). La disrupción del locus gumB en la cepa mutante gumB::Kmr fue confirmado por PCR y Southern blot (dato no mostrado).

Evaluación de la producción de xantano
Para evaluar la producción de xantano, las cepas de Xanthomonas citri subsp. citri (salvaje y mutante) fueron cultivadas en medio PYM suplementado con 2% de Dglucosa a 28°C por 24 h, con agitación. Se precipitó el EPS con etanol a partir del sobrenadante del cultivo, secándose y pesándose tal como se describe en Vojnov et al. (1998).

Material vegetal y ensayos de patogenicidad
Se utilizaron plantas de limón (Citrus limon (L.) Burm. f. cv. Eureka) de un año de edad, injertadas y mantenidas en invernadero bajo condiciones de temperatura y humedad controladas.
Para los ensayos de patogenicidad, se inocularon tres hojas de cada planta y tres plantas para cada cepa de Xanthomonas. Las inoculaciones se realizaron con suspensiones bacterianas de Xanthomonas citri subsp. citri salvaje, Xanthomonas citri subsp. citri mutante y Xanthomonas citri subsp. citri mutante complementada con el plásmido pIZD15-261, que contiene la secuencia completa del gen interrumpido en la mutante. La concentración bacteriana utilizada fue de 10⁷ unidades formadoras de colonias (UFC)/ml en MgCl₂ 10mM y los métodos de inoculación fueron: infiltración por presión, aspersión y herida más aspersión. Las plantas inoculadas se conservaron en cámaras de crecimiento durante 30 días, a 28°C , con humedad alta (>80% HR) y 16 h de luz de 150 μE/sm² a 200 μE/sm².
La evolución de los síntomas de la enfermedad fue monitoreada fenotípicamente en tres ensayos biológicos independientes y mediante curvas de crecimiento bacteriano.

Cuantificación de poblaciones bacterianas en plantas
Para la cuantificación de las poblaciones bacterianas, de cada planta se tomaron tres discos de 1 cm² de superficie de hojas inoculadas, como describen Siciliano et al. (2006). Los discos fueron sumergidos en 500 μl de MgCl₂ 10mM, recuperándose las células bacterianas mediante maceración del tejido con un pequeño pilón plástico y agitación durante 5 min. Se realizaron diluciones seriales de la suspensión, sembrándose 100 μl de cada dilución en placas de Petri que contenían PYM agar y luego se incubó a 28°C .
Después de 48 h, se realizó el recuento de las UFC. La cuantificación se realizó una vez por semana. Cada experimento se realizó por triplicado.
Para la determinación de la supervivencia epifítica, se aislaron las poblaciones bacterianas de acuerdo al método descripto por Morris et al. (1998). Las bacterias epifíticas fueron determinadas como se describió anteriormente, con la diferencia que los discos de hojas no se maceraron y solo fueron agitados suavemente durante 2 min a temperatura ambiente, para liberar solo las bacterias de la superficie de las hojas y no las bacterias del interior del apoplasto celular. La determinación se realizó diariamente durante siete días. Se utilizaron tres plantas para cada determinación y cada experimento se realizó por triplicado.

Estudios de adherencia bacteriana mediante tinción con cristal violeta
Para estudiar la adhesión bacteriana a las hojas de limonero, se cortaron discos de hojas sanas y se colocaron en placas de Petri, con la cara adaxial hacia abajo. Los discos fueron inoculados con cada una de las suspensiones de Xanthomonas citri subsp. citri (salvaje y mutante) a una concentración de 1x10⁶ ufc/ml, siendo luego incubadas a 28ºC durante 1, 3, 15 y 24 h. La adhesión bacteriana fue revelada mediante tinción con cristal violeta, de la siguiente manera: una vez transcurrido el tiempo establecido, los discos de hojas se lavaron tres veces con H₂O destilada estéril y se calentaron a 60ºC por 20 min, para permitir que el colorante se fijara a las bacterias. Posteriormente, las hojas se incubaron en una solución de cristal violeta 30% (p/v), a temperatura ambiente durante 45 min. Los discos se lavaron tres veces con H₂O destilada estéril, para remover el exceso de colorante. Se analizó macroscópicamente el colorante adherido a las células bacterianas, que a su vez estaban unidas a la superficie de la hoja. La intensidad del color azul es directamente proporcional al número de bacterias adheridas.

Dinámica del desarrollo de la biopelícula
Para analizar la dinámica de la biopelícula, se usó un microscopio confocal invertido de barrido láser (CLSM:“inverted confocal laser scanning microscope”). Ambas cepas (Xanthomonas citri subsp. citri salvaje y mutante) fueron transformadas con el plásmido pMP2444, que codifica una proteína fluorescente verde (GFP) (Stuurman et al., 2000). Las hojas de limonero fueron inoculadas por aspersión con la suspensión bacteriana de la cepa salvaje de X. citri subsp. citri, marcada con GFP, y con la cepa mutante gumB::Kmr. Las plantas fueron incubadas hasta que se formaron cancros en las mismas condiciones descriptas anteriormente. Para las observaciones, se cortaron áreas de hojas de 1 cm² y se montaron sobre el lado adaxial en un portaobjetos de vidrio.

Resultados y discusión

Una cepa mutante de X. citri subsp. citri en el gen gumB es deficiente en la producción de xantano
Para investigar el rol del xantano en la formación de biopelículas, fue necesario crear una cepa mutante de X. citri subsp. citri deficiente en la producción del polisacárido.
Esta se generó mediante mutagénesis de intercambio alélico, reemplazando el gen gumB funcional, necesario para la producción de xantano (Vojnov et al., 1998) con un casete de resistencia a kanamicina (Kmr) (Ω), a través de recombinación homóloga.
Los cultivos de ambas cepas (mutante y salvaje) mostraron la misma cinética de crecimiento en medio PYM suplementado con 1% de glucosa (Figura 1 A), por lo que la mutante no manifestó pérdida de viabilidad. Con la purificación y cuantificación de los polisacáridos extracelulares del cultivo, se determinó que ambas bacterias sintetizan el xantano y lo liberan al medio como un polisacárido soluble. Sin embargo, se observaron grandes diferencias en la producción de EPS entre las cepas de X. citri subsp. citri salvaje (8,2 g/l) y la mutante gumB (0,15 g/l) (Figura 1 B). La complementación de la mutante gumB con el plásmido recombinante pIZD15-261, portador del grupo completo de genes gum de X. campestris pv. campestris (Vojnov et al., 1998, 2002), restauró la producción de xantano al mismo nivel que X. citri subsp. citri salvaje (9,1 g/l).

Figura 1. A ) Cinética de crecimiento de cultivos líquidos de la bacteria Xanthomonas citri subsp. citri salvaje y la mutante gumB. B) Xantano obtenido a partir de los sobrenadantes de cultivo de la cepa salvaje y mutante gumB luego de la precipitación con etanol. La cantidad de EPS producido por las cepas de Xanthomonas se expresa como g de xantano seco por litro de cultivo. El plásmido recombinante pIZD15-261, utilizado para complementar a la mutante de Xcc gumB, posee el “cluster” completo de genes gum de X. campestri pv. campestri 8004.

El xantano es necesario para la adhesión de X. citri subsp. citri a la superficie de la hoja de limonero
La adhesión bacteriana a superficies bióticas fue evaluada por tinción con cristal violeta sobre discos de hojas sanas de limón durante 24 h. El número de bacterias adheridas en las hojas inoculadas con la cepa mutante X. citri subsp. citri gumB fue significativamente menor con respecto a las hojas inoculadas con X. citri subsp. citri salvaje a partir de las 15 h de incubación (Figura 2). No se observaron diferencias significativas en la adhesión bacteriana entre X. citri subsp. citri salvaje y la mutante gumB complementada por el plásmido pIZD15-261 (datos no mostrados).

Figura 2. Adhesión bacteriana en hojas de limonero. La adhesión bacteriana y la formación de biopelículas en la cara abaxial de hojas de limonero fueron analizadas mediante tinción con cristal violeta luego de 1, 3, 15 y 24 h de incubación. Las células bacterianas adheridas a la superficie de la hoja se evaluaron macroscópicamente por la intensidad del color azul.

Biopelícula y supervivencia epifítica en la interacción limonero-X. citri subsp. citri
El desarrollo de la enfermedad puede depender del grado de adhesión de la bacteria a la superficie de las hojas y de su capacidad para formar biopelículas. Estaúltima se evaluó mediante monitoreo por CLSM durante 25 días. Para este ensayo, se utilizó una cepa de X. citri subsp. citri portadora del gen GFP. A las 24 h después de la inoculación, se detectó fluorescencia sobre la superficie de las hojas y, a los seis días posteriores a la inoculación (d.p.i.), se distinguieron microcolonias y estructuras complejas, constituidas por capas múltiples de células en contacto unas con otras, predominantemente a través de interacciones laterales. Las células de la bacteria se adhirieron de forma horizontal y vertical, distribuidas al azar sobre las hojas de limonero (Figura 3 A). En contraste, las mutantes deficientes en xantano crecieron como células aisladas y no formaron microcolonias sobre las hojas durante todo el experimento, demostrando entonces que el xantano afecta la formación de agregados.
Para evaluar la influencia de la biopelícula sobre la supervivencia epifítica de la bacteria en las hojas, se realizó el conteo de células durante 10 d.p.i. A las 24 h de la inoculación, se observó que el crecimiento de la cepa mutante gumB disminuyó aproximadamente 100 veces con respecto al de la salvaje y a los 7 d.p.i., la diferencia en el tamaño de ambas poblaciones bacterianas fue de los tresórdenes de magnitud (Figura 3 B).

Figura 3. Desarrollo de biopelículas y crecimiento epifítico de Xcc sobre la hoja de limonero. A) Imágenes obtenidas mediante microscopía confocal invertida de barrido láser de hojas inoculadas con Xcc salvaje y mutante gumB por aspersión. XY, ZX y ZY son proyecciones de las imágenes de los ejes XY, ZX y ZY, respectivamente. Barra de escala: 20 μm. B) Crecimiento in vivo de la población epifítica de Xcc salvaje y mutante gumB en hojas de limonero. La población bacteriana fue cuantificada por maceración de discos de las hojas inoculadas en una solución 10 mM de MgCl₂ y plaqueo de diluciones seriadas. Los valores se expresan como la media ± desviación estándar.

El cancro de la hoja del limonero requiere de la formación de biopelículas para su desarrollo
Mediante la inoculación de hojas de limonero con suspensiones bacterianas, se observó que la capacidad de la mutante gumB para desarrollar síntomas de cancrosis se vio severamente comprometida (Figura 4A). Las plantas tratadas con MgCl₂ no mostraron síntomas y la mutante gumB portadora del grupo de genes gum entero, clonado en pIZD15-261, recuperó su fenotipo salvaje (datos no mostrados). El número de bacterias recuperadas de las hojas inoculadas no mostró diferencias significativas entre ambas cepas hasta los 14 d.p.i., punto en que la población de la mutante gumB comenzó a declinar hasta los 35 d.p.i., momento en que no se recuperó ninguna bacteria. En contraste, el crecimiento de la cepa salvaje fue de ochoórdenes de magnitud a las cinco semanas después de la inoculación (Figura 4B).

Figura 4. A ) Cara abaxial de hojas de limonero inoculadas con Xcc salvaje y la bacteria mutante gumB. Las suspensiones bacterianas fueron preparadas en una solución de 10 mM de MgCl₂ e inoculadas utilizando tres métodos diferentes de inoculación: aspersión, herida seguida de aspersión e infiltración. B) Crecimiento in vivo de las cepas de Xcc en hojas de limonero. Los valores se expresan como la media ± desviación estándar.

Para evaluar si la bacteria presentaba estructura de biofilm en el desarrollo del cancro, se monitorearon hojas de limonero inoculadas, mediante aspersión, con la cepa salvaje y la mutante gumB marcadas con GFP. Mediante CLSM, se observó que en las hojas inoculadas con la cepa salvaje (Figura 5), se habían formado agregados bacterianos con una estructura tridimensional y amplios espacios de agua, típicos de las estructuras de biopelículas. Estos agregados no se observaron con la bacteria mutante gumB, lo que sugiere que el EPS contribuye a la estructura interna de los cancros.

Figura 5. Fluorescencia emitida por Xcc salvaje-GFP en el interior de un cancro desarrollado sobre una hoja de limonero. La imagen fue capturada mediante microscopía
confocal invertida de barrido láser y muestra la distribución de la bacteria dentro del cancro. Las flechas indican canales de agua. Barra de escala: 200 μm.

DISCUSIÓN
En muchas bacterias, la síntesis de EPS se encuentra regulada por un complejo sistema de control. En Xanthomonas campestris pv. campestris, una de las bacterias más estudiadas del género, la biosíntesis del xantano está controlada por un grupo de 12 genes (gumB a -M) (Vojnov et al., 1998, 2002). Los genes funcionales gumB y gumC son necesarios para la producción del xantano extracelular maduro a partir de los intermediarios pentasacáridos (Vojnov et al., 1998). La comparación de los genomas de X. citri subsp. citri (cepa 306) (da Silva et al., 2002) y X. campestris pv. campestris (cepa 8004) (Qian et al., 2005) reveló que en ambas bacterias, el grupo de genes gum mantiene su tamaño y orden, indicando esto que X. citri subsp. citri también puede ser capaz de producir xantano. La proteína GumB de X. citri subsp. citri (GenBank accession number: YP_242744) comparte el 92% de la identidad aminoacídica con la proteína GumB de X. campestris pv. campestris (GenBank accession number: YP_242744). Previamente, se demostró que la mutación del gen gumB en X. campestris pv. campestris tiene un efecto polar sobre la expresión de gumB y gumC y que la producción de xantano a partir de una unidad repetitiva de pentasacáridos requiere los productos de ambos genes (Vojnov et al., 1998).
Nuestros resultados indican que el xantano de X. citri subsp. citri juega un rol importante en la formación de biopelículas y en la supervivencia de la bacteria sobre la hoja. Se reconocieron los tres estados de desarrollo de la biopelícula: i) adhesión bacteriana, ii) formación de agregados y iii) formación de la biopelícula en el interior de las hojas colonizadas. Se demostró que el xantano es esencial para todo el proceso de formación de biopelículas, que presentan estructuras complejas en las que las bacterias se encuentran empaquetadas en arreglos hexagonales, separados por canales de agua (Figuras 2, 3 y 5). Se observaron fenotipos similares en la bacteria del suelo Rhizobium leguminosarum (Russo et al., 2006).
La presencia de biopelículas está correlacionada con la patogenicidad de X. citri subsp. citri, la que fue severamente atenuada por la disrupción de un único gen involucrado en la biosíntesis de EPS, gumB (Figura 4).
Existen referencias previas a la reducción de la virulencia de varias cepas de Xanthomonas mutantes que muestran deficiencias en la producción de xantano (Chou et al., 1997; Kemp et al., 2004; Yun et al., 2006).
La colonización bacteriana también es necesaria para la expresión de genes asociados a la virulencia que inducen defensa vegetal (Marco et al., 2005). El rol del xantano, tanto en la virulencia del patógeno como en la defensa del hospedante, puede explicar por qué se observaron poblaciones bacterianas epifíticas más pequeñas en la cepa mutante inoculada, en comparación con las poblaciones desarrolladas por la cepa salvaje (Figura 3 B). Sin embargo, no deben descartarse otras funciones del xantano en el desarrollo de la enfermedad.
Por ejemplo, se demostró que el EPS es capaz de intervenir en la supresión de las respuestas de defensa vegetal; así, se observó que el xantano induce la susceptibilidad a Xanthomonas campestris pv. campestri en Nicotiana benthamiana y Arabidopsis thaliana, ya que suprime la deposición de calosa en la célula vegetal, mecanismo que constituye una forma basal de defensa de las plantas frente a las colonizaciones bacterianas (Yun et al., 2006).

Conclusiones

Para avanzar en el conocimiento de la dinámica de las interacciones X. citri subsp. citri-hospedero en el desarrollo de la enfermedad de la cancrosis de los cítricos, se analizó la estructura de la biopelícula producida por X. citri subsp. citri. Estudios adicionales sobre la regulación espacial y temporal de la producción de xantano durante la evolución de la enfermedad, al igual que estudios para entender otros mecanismos regulatorios de la expresión de genes involucrados en la formación de biopelículas, podrían mejorar nuestro conocimiento sobre la adaptación de las bacterias a la vida parasítica dentro de las plantas.
Tales conocimientos podrían proveer una base racional para el desarrollo de métodos de protección de los cultivos basados en la interferencia en procesos claves de la fase epifítica y en el desarrollo de la enfermedad.

Agradecimientos.
Este trabajo fue subsidiado por la Agencia de Promoción Científica y Tecnológica (PICT-02 no. 08-10740; PAV-137) y el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (Conicet, PIP6441). M. R. Marano, A. A. Vojnov y A. P. Castagnaro son miembros del Conicet. L. N. Sendín, L. Rigano y P. Torres fueron becarios de esta institución durante la realización de este trabajo. Se agradece a A. Zorreguieta por proveer el pAZ (Ω) y colaborar con la microscopía confocal.

Bibliografía citada

1. Branda, S. S.; S. Vik; L. Friedman and R. Kolter. 2005. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13: 20-26.         [ Links ]
2. Brunings, A. M. and D. W. Gabriel. 2003. Xanthomonas citri: breaking the surface. Mol. Plant Pathol. 4: 141- 157.         [ Links ]
3. Camilli, A. and B. L. Bassler. 2006. Bacterial smallmolecule signaling pathways. Science 311: 1113-1116.         [ Links ]
4. Chen, W. P. and T. T. Kuo. 1993. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Res. 21: 2260.         [ Links ]
5. Chou, F. L.; H. C. Chou; Y. S. Lin; B. Y. Yang; N. T. Lin; S. F. Weng and Y. H. Tseng. 1997. The Xanthomonas campestris gumD gene required for synthesis of xanthan gum is involved in normal pigmentation and virulence in causing black rot. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233 (1): 265-269.         [ Links ]
6. Crossman, L. and J. M. Dow. 2004. Biofilm formation and dispersal in Xanthomonas campestris. Microbes Infect. 6: 623-629.         [ Links ]
7. Cubero, J. and J. H. Graham. 2004. The leucineresponsive regulatory protein (lrp) gene for characterization of the relationship among Xanthomonas species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54 (2): 429-437.         [ Links ]
8. Da Silva, A. C.; J. A. Ferro; F. C. Reinach; C. S. Farah; L. R. Furlan; R. B. Quaggio; C. B. Monteiro-Vitorello; M. A. Van Sluys; N. F. Almeida; L. M. C. Alves; A. M. do Amara; M. C. Bertolini; L. E. A. Camargo; G. Camarotte; F. Cannavan; J. Cardozo; F. Chambergo; L. P. Ciapina; R. M. B. Cicarelli; L. L. Coutinho; J. R. Cursino-Santos; H. El- Dorry; J. B. Faria; A. J. S. Ferreira; R. C. C. Ferreira; M. I. T. Ferro; E. F. Formighieri; M. C. Franco; C. C. Greggio; A. Gruber; A. M. Katsuyama; L. T. Kishi; R. P. Leite; E. G. M. Lemos; M. V. F. Lemos; E. C. Locali; M. A. Machado; A. M. B. N. Madeira; N. M. Martinez- Rossi; E. C. Martins; J. Meidanis; C. F. M. Menck; C. Y. Miyaki; D. H. Moon; L. M. Moreira; M. T. M. Novo; V. K. Okura; M. C. Oliveira; V. R. Oliveira; H. A. Pereira; A. Rossi; J. A. D. Sena; C. Silva; R. F. de Souza; L. A F. Spinola; M. A. Takita; R. E. Tamura; E. C. Teixeira; R. I. D. Tezza; M. Trindade dos Santos; D. Truffi; S. M. Tsai; F. F. White; J. C. Setubal and J. P. Kitajima. 2002. Comparison of the genomes of two Xanthomonas pathogens with differing host specificities. Nature 417 (6887): 459-463.         [ Links ]
9.Fujishige, N. A.; N. N. Kapadia; P. L. De Hoff and A. M. Hirsch. 2006. Investigations of Rhizobium biofilm formation. FEMS (Fed. Eur. Microbiol. Soc.) Microbiol. Ecol. 56 (2): 195-206.         [ Links ]
10. Guilhabert, M. R.; L. M. Hoffman; D. A. Mills and B. C. Kirkpatrick. 2001. Transposon mutagenesis of Xylella fastidiosa by electroporation of Tn5 synaptic complexes. Mol. Plant-Microbe Interact. 14 (6): 701- 706.         [ Links ]
11. Hirano, S. S. and C. D. Upper. 1983. Ecology and epidemiology of foliar bacterial plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 21: 243-269.         [ Links ]
12. Jansson, P. E.; L. Kenne and B. Lindberg. 1975. Structure of extracellular polysaccharide from Xanthomonas campestris. Carbohydr. Res. 45: 275- 282.         [ Links ]
13. Kemp, B. P.; J. Horne; A. Bryant and R. M. Cooper. 2004. Xanthomonas citri pv. manihotis gumD gene is essential for EPS production and pathogenicity and
enhances epiphytic survival on cassava (Manihot esculente). Physiol. Mol. Plant Pathol. 64: 209-218.         [ Links ]
14. Koutsoudis, M. D.; D. Tsaltas; T. D. Minogue and S. B. von Bodman. 2006. Quorum-sensing regulation governs bacterial adhesion, biofilm development, and host colonization in Pantoea stewartii subspecies stewartii. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (15): 5983- 5988.         [ Links ]
15. Laue, H.; A. Schenk; H. Li; L. Lambertsen; T. R. Neu; S. Molin and M. S. Ullrich. 2006. Contribution of alginate and levan production to biofilm formation by Pseudomonas syringae. Microbiology 152: 2909- 2918.         [ Links ]
16. Marco, M. L.; J. Legac and S. E. Lindow. 2005. Pseudomonas syringae genes induced during colonization of leaf surfaces. Environ. Microbiol. 7 (9): 1379-1391.         [ Links ]
17. Morris, C. E.; J. M. Monier and M. A. Jacques. 1998. A technique to quantify the population size and composition of the biofilm component in communities of bacteria in the phyllosphere. Appl. Environ. Microbiol. 64 (12): 4789-4795.         [ Links ]
18. Muller, P.; M. Keller; W. M. Weng; J. Quandt; W. Arnold and A. Puhler. 1993. Genetic analysis of the Rhizobium meliloti exoYFQ operon: ExoY is homologous to sugar transferases and ExoQ represents a transmembrane protein. Mol. Plant- Microbe Interact. 6 (1): 55-65.         [ Links ]
19. Parsek, M. R. and C. Fuqua. 2004. Biofilms 2003: emerging themes and challenges in studies of surface-associated microbial life. J. Bacteriol. 186 (14): 4427-4440.         [ Links ]
20. Parsek, M. R. and P. K. Singh. 2003. Bacterial biofilms: an emerging link to disease pathogenesis. Annu. Rev. Microbiol. 57: 677-701.         [ Links ]
21. Qian, W.; Y. Jia; S. X. Ren; Y. Q. He; J. X. Feng; L. F. Lu; Q. Sun; G. Ying; D. J. Tang; H. Tang; W. Wu; P. Hao; L. Wang; B. L. Jiang; S. Zeng; W. Y. Gu; G. Lu; L. Rong; Y. Tian; Z. Yao; G. Fu; B. Chen; R. Fang; B. Qiang; Z. Chen; G. P. Zhao; J. L. Tang and C. He. 2005. Comparative and functional genomic analyses of the pathogenicity of phytopathogen Xanthomonas campestris pv. campestris. Genome Res. 15 (6): 757- 767.         [ Links ]
22. Russo, D. M.; A. Williams; A. Edwards; D. M. Posadas; C. Finnie; M. Dankert; J. A. Downie and A. Zorreguieta. 2006. Proteins exported via the PrsDPrsE
type I secretion system and the acidic exopolysaccharide are involved in biofilm formation by Rhizobium leguminosarum. J. Bacteriol. 188 (12): 4474-4486.         [ Links ]
23. Sambrook, J.; E. F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2.ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.         [ Links ]
24. Scott, C. and S. C. Manning. 2003. Basics of biofilm in clinical otolaryngology. Ear Nose Throat J. 82 (suppl.): 18-206.         [ Links ]
25. Sherwood, M. 1970. Improved synthetic medium for the growth of Rhizobium. J. Appl. Bacteriol. 33 (4): 708- 713.         [ Links ]
26. Siciliano, F.; P. Torres; L. Sendín; C. Bermejo; P. Filippone; G. Vellicce; J. Ramallo; A. Castagnaro; A. Vojnov and M. R. Marano. 2006. Analysis of the molecular basis of Xanthomonas citri subsp. citri pathogenesis in Citrus limon. Electron. J. Biotechnol. 9 (3): 200-204.         [ Links ]
27. Southey-Pillig, C. J.; D. G. Davies and K. Sauer. 2005. Characterization of temporal protein production in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 187 (23): 8114-8126.         [ Links ]
28. Steinberger, R. E. and P. A. Holden. 2005. Extracellular DNA in single and multiple-species unsaturated biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71 (9): 5404-5410.         [ Links ]
29. Stuurman, N.; C. Pacios Bras; H. R. Schlaman; A. H. Wijfjes; G. Bloemberg and H. P. Spaink. 2000. Use of green fluorescent protein color variants expressed on stable broad-host-range vectors to visualize rhizobia interacting with plants. Mol. Plant-Microbe Interact. 13 (11): 1163-1169.         [ Links ]
30. Sutherland, I. 2001. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework. Microbiology 147 (1): 3-9.         [ Links ]
31. Vojnov, A. A.; D. E. Bassi; M. J. Daniels and M. A. Dankert. 2002. Biosynthesis of a substituted cellulose from a mutant strain of Xanthomonas campestris. Carbohydr. Res. 337 (4): 315-326.         [ Links ]
32. Vojnov, A. A.; A. Zorreguieta; J. M. Dow; M. J. Daniels and M. A. Dankert. 1998. Evidence for a role for the gumB and gumC gene products in the formation of
xanthan from its pentasaccharide repeating unit by Xanthomonas campestris. Microbiology 144 (6): 1487- 1493.
33. Yun, M. H.; P. S. Torres; M. El Oirdi; L. A. Rigano; R. Gonzalez-Lamothe; M. R. Marano; A. P. Castagnaro; M. A. Dankert; K. Bouaraby and A. A. Vojnov. 2006. Xanthan induces plant susceptibility by suppressing callose deposition. Plant Physiol. 141 (1): 178-187.         [ Links ]