Transformación genética de Acidovorax avenae subsp. avenae, agente causal de la estría roja en caña de azúcar ¹

Romina P. Bertani*, Natalia Mielnichuk**, M. Francisca Perera***, Victoria González*, Adrian A. Vojnov**, María I. Cuenya* y Atilio P. Castagnaro***

¹ Trabajo financiado por Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC) y Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET).

* Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC), Las Talitas, Tucumán, R. Argentina, T4101XAC.

** Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein (Fundación Cassará - CONICET), Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina, C1440FFX.

 

*** Instituto de Tecnología Agroindustrial del Noroeste Argentino (ITANOA), Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC) - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Las Talitas, Tucumán, R. Argentina, T4101XAC.

 

RESUMEN

La estría roja, cuyo agente causal es Acidovorax avenae subsp. avenae, es una de las principales enfermedades que afecta a la caña de azúcar en Tucumán. Hasta el momento poco se conoce sobre la colonización de la bacteria en la caña de azúcar y su movimiento durante la infección, por lo que el objetivo de este trabajo fue desarrollar herramientas para monitorear la bacteria durante el ciclo infectivo. Se evaluaron tres protocolos de transformación: químico, electroporación y conjugación, utilizando plásmidos con diferentes genes de proteínas fluorescentes y marcadores de selección. Las cepas de A. avenae subsp. avenae fueron evaluadas según la adquisición de resistencia a antibiótico y expresión de señal fluorescente. Además, se confirmó la identidad de los transformantes por PCR especie-específica. En este trabajo se obtuvieron bacterias con señal fluorescente estable únicamente por conjugación. Con el plásmido Aa::pHC60-gfp se obtuvo la mayor expresión de la proteína verde fluorescente gfp. Los ensayos in vitro mostraron que no hay diferencias entre el crecimiento de la cepa silvestre y transformada en medio líquido. Tanto las plantas infectadas con A. avenae subsp. avenae como con Aa::pHC60-gfp presentaron valores de incidencia y severidad similares 15 días después de la inoculación. Este es el primer estudio de expresión de un gen heterólogo en A. avenae subsp. avenae y representa una herramienta valiosa para el estudio de su biología y el proceso de colonización de caña de azúcar.

Palabras Claves : gfp, conjugación, ciclo de vida.

ABSTRACT

Genetic transformation of Acidovorax avenae subsp. avenae, the causal agent of Red stripe in sugarcane

Red stripe (causal agent Acidovorax avenae subsp. avenae) is one of the main diseases that affect the sugarcane crop in Tucumán. At the moment, the information on sugarcane colonization and movement of A. avenae subsp. avenae during infections is limited, so the aim of this study was to develop tools to monitor the bacteria during the disease cycle. Three transformation methods were tested: chemical, electroporation and conjugation using plasmids containing different fluorescent proteins and selective gen markers. Mutant A. avenae subsp. avenae strains were evaluated for antibiotic resistance and expression of fluorescence signals. In addition, their identity was confirmed by PCR specie-specific. In this study, only transformation by conjugation presented stable fluorescent expression in the bacterium. The Aa::pHC60-gfp showed the highest expression of the green fluorescent protein gfp. In vitro assays showed not difference between the growth of wild type strain and the mutant one in liquid media. Plants inoculated either with A. avenae subsp. avenae or Aa::pHC60-gfp presented comparable incidence and severity 15 days after inoculation. This is the first report of an A. avenae subsp. avenae mutant strain expressing a heterologous gene and represents a valuable tool to study the biology of the bacterium and its colonization in sugarcane.

Key words: gfp, conjugation, disease cycle.

INTRODUCCION

La estría roja, causada por Acidovorax avenae subsp. avenae (Schaad et al., 2008), es una enfermedad bacteriana que afecta al cultivo de caña de azúcar y puede reducir significativamente el azúcar teórico recuperable cuando los valores de incidencia superan el 25% (Johnson et al., 2016).

En los últimos años se observó un incremento en la incidencia de estría roja en Tucumán, Argentina (Fontana et al., 2019), lo que reviste especial importancia si se considera que esta provincia contribuye con el 70% de la producción total de azúcar de la Argentina (Centro Azucarero Argentino, 2018; USDA, 2017). Sin embargo, hasta el momento se desconoce el proceso de colonización de la caña durante la infección por A. avenae subsp. avenae. Es por ello que se propone como objetivo de este trabajo obtener una cepa de A. avenae subsp. avenae fluorescente mediante transformación genética, como herramienta para ser utilizada en el análisis del ciclo de infección. .

MATERIALES Y MÉTODOS

Se probaron tres métodos de transformación: química, electroporación y conjugación. En la Tabla 1 se resumen los plásmidos utilizados. Se incluyó la proteína fluorescente mCherry como un control de trasformación, a pesar de no ser útil para seguir a la bacteria dentro de la planta debido a que presenta la misma fluorescencia que la clorofila.

Tabla 1.Características de los plásmidos empleados en este estudio.

La transformación química y la preparación de células electrocompetentes se realizaron de acuerdo a Sambrook et al. (1989). Las electroporaciones fueron llevadas a cabo a 25 ¼F, 200 © 1800 V (cubas de 0,1 y 0,2 cm), 2500V (cuba de 0,2 cm) y a tiempo constante de cinco minutos. Para la conjugación, las cepas de A. avenae subsp.avenae y Escherichia coli S17-1 crecieron en medio líquido en una proporción 5:1 (A. avenae subsp. avenae: E. coli) (Bahar et al., 2009) o crecieron en medio sólido y luego fueron colectadas y mezcladas.

Luego de la transformación, la bacteria se plaqueó en medio agar nutritivo con los antibióticos selectivos. Las células que resultaron resistentes se evaluaron para confirmar su fluorescencia en microscopio de fluorescencia y su identidad mediante PCR con los cebadores Oaf1/Oar1 (Song et al., 2001).

Para comparar las curvas de crecimiento de la cepa silvestre y las transformadas, las células mutantes se incubaron en medio caldo nutritivo a 37ºC, con agitación constante a 200 rpm por 36 h. Se midió la DO₆₀₀ a intervalos regulares de tiempo.

Se realizaron ensayos de inoculación en condiciones controladas en plantas de caña de azúcar mediante asperjado de la suspensión bacteriana de A. avenae subsp.avenae sin transformar y transformada con Aa::pHC60-gfp. Se observaron los síntomas 15 días después de la inoculación y se evaluó incidencia (nº plantas enfermas/ nº total de plantas x 100) y severidad, empleando la escala de 1 <0.5 % área foliar afectada (AFA) a 9 (más del 50% AFA) de acuerdo a la International Society of Sugarcane Technologists (ISSCT) (Hutchinson and Daniels, 1971).

RESULTADOS

Solo se obtuvieron células fluorescentes cuan-do el método de transformación fue por conjugación y las bacterias se mezclaron directamente de sus placas en medio sólido (2x105 transconjugantes/mL). Las células mostraron fluorescencia cuando fueron transformadas con los plásmidos pHC60-gfp y pFC1-gfp; sin embargo, solo Aa::pHC60-gfp expresó GFP en forma estable y con buena intensidad (Figura 1a).

Los ensayos in vitro mostraron que no hay diferencias en el crecimiento en medio líquido de la cepa silvestre y el mutante Aa::pHC60-gfp (datos no mostrados). Además, los valores de incidencia y severidad a los 15 días, luego de inocular las plantas con la cepa marcada con GFP y la cepa salvaje, fueron semejantes (datos no mostrados).

En cuanto a la transformación con la proteína mCherry empleada como control, el mutante Aa::pHC60-mCherry obtenido presentó una señal de fluorescencia estable (Figura 1b), pero la cantidad de células transformadas obtenidas fue menor que las obtenidas para Aa::pHC60-gfp.

Figura 1.Observación en microscopio óptico (100X) de la bacteria Acidovorax avenae subsp. avenae marcada con las proteínas a) GFP y b) mCherry.

CONCLUSIONES

Este es el primer trabajo donde una cepa de A. avenae subsp. avenae expresa un gen heterólogo, lo cual constituye una valiosa herramienta para estudiar la biología de la bacteria y su colonización en caña de azúcar.

BIBLIOGRAFÍA CITADA

1.Bahar, O.; T. Goffer and S. Burdman. 2009. Type IV pili are required for virulence, twitching motility and biofilm formation of Acidovorax avenae subsp. citrulli. Mol. Plant Microbe Interact. 22: 909-920.         [ Links ]

2.Centro Azucarero Argentino. 2018. Argentina, Zafra azucarera 2016. En línea. Disponible en http://www.centroazucarero.com.ar/oldsite/zafras/zafra2016.html. (consultado 8 marzo de 2018; verificado 14 junio de 2019).         [ Links ]

3.Chen, H. P. and G. C. Walker. 1998. Succinoglycan is required for initiation and elongation of infection threads during nodulation of alfalfa by Rhizobium melioti. J. Bacteriol. 180: 5183-5191.         [ Links ]

4.Fontana, P. D.; N. Tomasini; C. A. Fontana; V. Di Pauli; P. S. Cocconcelli; G. M. Vignolo and S. G. Salazar. 2019. MLST reveals a separate and novel clonal group for Acidovorax avenae strains causing red stripe in sugarcane from Argentina. Phytopathology doi.org/10.1094/PHYTO-08-18-0303-R.         [ Links ]

5.Hutchinson, P. B. and J. Daniels. 1971. A rating scale for sugarcane characteristics. En: Proc. ISSCT Congress, 14, New Orleans, USA, pp. 128-131.         [ Links ]

6.Johnson, R. M.; M. P. Grisham; K. Z. Warnke and J. R. Maggio. 2016. Relationship of soil properties and sugarcane yields to red stripe in Louisiana. Phyto-pathology 106: 737-744.         [ Links ]

7.Posadas, D. M.; V. Ruiz-Ranwez; H. R. Bonomi; F. A. Martín and A. Zorreguieta. 2012. BmaC, a novel auto-transporter of Brucella suis, is involved in bacterial adhesion to host cells. Cell. Microbiol. 14: 965-982.         [ Links ]

8.Ramírez, G. A.; N. Vozza; A. Zorreguieta and M. Tolmasky. 2010. Construction of the broad range cloning vector pHC60mCherry: plant microbe interaction applications. FASEB J. 24: Supplement 1.         [ Links ]

9.Russo, D. M.; A. Williams; A. Edwards; D. M. Posadas; C. Finnie; M. Dankert; J. A. Downie and A. Zorreguieta. 2006. Proteins exported via the PrsD-PrsE type I secretion system and the acidic exopolysaccharide are involved in biofilm formation by Rhizobium le-guminosarum. J. Bacteriol. 188:4474-4486.         [ Links ]

10.Sambrook, J.; E. F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.         [ Links ]

11.Schaad, N. W.; E. Postnikova; A. Sechler; L. E. Claflin; A. K. Vidaver; J. B. Jones; I. Agarkova; A. Ignatov; E. Dickstein and B. A. Ramundo. 2008. Reclassification of subspecies of Acidovorax avenae as A. avenae (Manns, 1905) emend., A. cattleyae (Pavarino, 1911) comb. nov., A. citrulli (Schaad et al., 1978) comb. nov., and proposal of A. oryzae sp. nov. Syst. Appl. Microbiol. 31: 434-446.         [ Links ]

12.Silva-Rocha, R.; E. Martínez-García; B. Calles; M. Chavarría; A. Arce-Rodríguez; A. de Las Heras; A. D. Páez-Espino; G. Durante-Rodríguez; J. Kim; P. I. Nikel; R. Platero and V. de Lorenzo. 2012. The Standard European Vector Architecture (SEVA): a coherent platform for analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acid Res. 41:D666-D675.         [ Links ]

13.Song, W. Y.; H. M. Kim and N. W. Schaad. 2001. PCR primers for detection and identification of plant pa-thogenic species, subspecies, and strains of Aci-dovorax. US Patent No. 09703807.         [ Links ]

14.USDA-United States Department of Agriculture Foreign Agricultural Service. 2017. Sugar: World Markets and Trade. En línea Disponible en http:// www.apps.fas.usda.gov/psdonline/circulars/Sugar.pdf (consultado 8 marzo de 2018; verificado 14 junio de 2019).         [ Links ]