Mesa 4:
El laboratorio en la patología endocrinopediátrica*

Eduardo Chaler, Horacio Domené, Liliana Muñoz, Gabriela Ruibal (en representación del Panel de Expertos).

*Segundo Consenso Argentino sobre patologías endocrinológicas. Buenos Aires, 10 al 12 de agosto de 2007.
Endocrinología pediátrica

Coordinador: Dr. Hugo L. Fideleff

Panel de expertos:
Cristina Bazán, Tucumán
Alicia Belgorosky, Buenos Aires
Ignacio Bergadá, Buenos Aires
Hugo Boquete, Buenos Aires
Oscar Brunetto, Buenos Aires
Hamilton Cassinelli, Buenos Aires
Eduardo Chaler, Buenos Aires
Horacio Domené, Buenos Aires
Hugo Fideleff, Buenos Aires
Héctor Jasper, Buenos Aires
Alicia Martínez, Buenos Aires
Aldo Miglietta, Rosario
Mirta Miras, Córdoba
Liliana Muñoz, Córdoba
Beatriz Oliveri, Buenos Aires
Marco A. Rivarola, Buenos Aires
Gabriela Ruibal, Buenos Aires

Posibilidades y dificultades en el diagnóstico de la deficiencia de GH

Las alteraciones del eje GH-IGFs-IGFBPs pueden ocurrir a diferentes niveles:
Hipotalámico: factores de transcripción e hipotéticamente de GH-RH
Hipofisario: factores de transcripción (SOX, HESX, PROP-1, TPIT, POU1-F1, LHX3 y LHX4), receptor de GH-RH, cluster del gen de GH (deficiencia de GH y GH bioinactiva)
Órganos blancos:
Insensibilidad primaria: receptor de GH, defectos en la transmición de señal como STAT-5b
Insensibilidad secundaria: malnutrición, insuficiencia hepática, enfermedad crónica y anticuerpos anti-GH
Defectos en IGF-I: deficiencia de IGF-I e IGF-I bioinactivo
Transporte, metabolismo y depuración: deficiencia de ALS e hipotéticamente alteraciones de las IGFBPs
Resistencia al IGF-I: receptor de IGF tipo 1 e hipoteticamente defectos en la señalización

Este consenso se abocará específicamente al diagnóstico de la deficiencia de GH (aislada o múltiple).
El diagnóstico de la deficiencia de GH (GHD) en la infancia es un proceso multifactorial que requiere una evaluación clínica y auxológica, combinada con pruebas bioquímicas del eje GH-IGF-I y evaluación radiológica ⁽¹⁾.

Evaluación bioquímica:
Consideraciones metodológicas
Ensayos de GH
Los diferentes inmunoensayos disponibles en nuestro medio utilizan diferentes estándares de referencia para la calibración. Tradicionalmente se ha utilizado el IRP 80/505 de origen hipofisario que está constituido por diferentes formas moleculares de la GH (22 kDa, 20 kDa, etc). Recientemente se han propuesto dos nuevos estándares de GH humana recombinante de 22 kDa: el WHO 88/624 ⁽¹⁾ y el WHO 98/574 ⁽²⁾ como los estándares a utilizarse en todos los ensayos.
Como ha demostrado Anckaert y col ⁽³⁾ la inmunopotencia de los estándares de GH recombinante varia considerablemente con el ensayo utilizado representando al menos la mitad de la variabilidad interlaboratorios. No obstante la necesidad de armonizar los estándares, los fabricantes de reactivos no han adoptado aún los nuevos materiales de referencia. Algunas publicaciones de endocrinología (Clinical Endocrinology, GH and IGF Research, and European Journal of Endocrinology) a partir de septiembre de 2007 publicarán solamente aquellos estudios que utilicen como unidad de masa de GH el IS 98/574. Sin embargo internacionalmente se sigue utilizando el estándar WHO 80/505. Además de los estándares los resultados son ampliamente dependientes de la especificidad de los anticuerpos utilizados para las diferentes formas moleculares de GH, la interferencia con la GHBP y la matriz utilizada. Un trabajo realizado por Chaler y col ⁽⁴⁾ en nuestro país demostró la variabilidad de los valores estimulados de GH con el uso de diferentes inmunoensayos comerciales, enfatizando la necesidad de la estandarización de los ensayos utilizados mediante la participación en programas externos de control de calidad ⁽⁵⁾.

Pruebas de estimulación de GH
Como la producción de GH es dependiente de hormonas tiroideas y corticoides, en el caso de deficiencias concomitantes de estos sectores, estas deficiencias deben ser adecuadamente sustituidas previo al estudio del eje GH-IGFs.
En la evaluación de la secreción de GH se han propuesto diferentes estímulos: hipoglucemia-insulínica, infusión de arginina, administración oral de clonidina, L-dopa, etc. El principal problema con el uso de estas pruebas reside en que existe información limitada de valores de referencia en niños normales. Además existe controversia sobre los recaudos éticos de realizar estas pruebas en niños normales. El trabajo realizado por Marín y col ⁽⁶⁾ aporta información sobre la variabilidad de respuesta de GH en niños normales sometidos a tres pruebas de estimulación: una prueba de arginina seguida por una prueba de hipoglucemia insulínica y una prueba de ejercicio en cinta. Se halló una evidente dependencia de los niveles estimulados máximos de GH en relación con el desarrollo puberal. El límite inferior de los intervalos de confianza del 95% aumentó progresivamente de 1.9 μg/L en prepubertad a 9.3 μg/L en el estadio V de la pubertad. Por lo tanto resulta evidente que no puede utilizarse un solo límite de corte para toda edad y desarrollo puberal.

Pretratamiento con esteroides sexuales
El pretratamineto con etinil-estradiol (40 μg/m² por dos días) en un número pequeño de niños prepuberales permitió incrementar la respuesta de GH máxima superando todos los sujetos el límite de corte de 7 μg/L ⁽⁶⁾. En un estudio doble-ciego y controlado con placebo Martínez y col ⁽⁷⁾ han demostrado mejor sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de GHD con el pretratamiento durante tres días con estradiol micronizado a la dosis de 1-2 mg/día en la prueba de arginina-clonidina (de 73 a 87% en la sensibilidad; de 95 a 98% en la especificidad y de 90 a 95% en la eficiencia diagnóstica). Resultados similares fueron descriptos utilizando estradiol trasdérmico en la prueba de clonidina ⁽⁸⁾.

Ensayos de IGF-I e IGFBP-3
Los valores de referencia de IGF-I e IGFBP-3 deben establecerse por edad y por sexo en niños normales. Valores de IGF-I e IGFBP-3 inferiores a - 2.0 SDS son fuertemente sugerentes de una anormalidad en el eje GH-IGF cuando han sido excluidas otras causas de bajos niveles de IGF-I. Sin embargo, existen dos dificultades para el uso de estos marcadores en el diagnóstico de GHD: 1) Un porcentaje variable de niños con GHD presentan valores normales de IGF-I e IGFBP-3 y 2) un porcentaje variable de niños bajos no deficitarios de GH presentan niveles bajos de IGF-I e IGFBP-3 ⁽⁹⁾.
Cuando se han comparado niveles de IGF-I e IGFBP-3 se han encontrado diferentes especificidades y sensibilidades en el diagnóstico de GHD. Un aporte ha sido el estudio de Boquete y col ⁽¹⁰⁾ en el que se expresaron los niveles de IGF-I e IGFBP-3 en unidades de desvió estándar (SDS) en comparación con una población de niños normales y utilizando análisis ROC (receiver operating characterisitic) para determinar el mejor valor de corte que permitiera máximas sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de GHD. Se alcanzaron máximos niveles de eficiencia diagnóstica utilizando un nivel de corte < -1.65 SDS para IGF-I (sensibilidad 68%, especificidad 97% y eficiencia diagnóstica de 81%) y de <- 1.80 SDS para IGFBP-3 (sensibilidad 90%, especificidad 60% y eficiencia diagnóstica de 78%). Similares niveles de eficiencia diagnóstica utilizando la medición de IGF-I e IGFBP-3 ha sido descripta por Martínez y col ⁽⁷⁾: 75% para IGF-I y 91% para IGFBP- 3. Niveles superiores de sensibilidad y especificidad han sido reportados por Silva y col (96 y 93 % para IGF-I, 100 y 87% para IGFBP-3 y 100 y 100% para IGF-I+IGFBP-3) ⁽¹¹⁾. Sin embargo en este trabajo solo se comparan los niveles de estos factores de crecimiento en niños normales y en GHD severa y no en niños con talla baja idiopática. Un reciente estudio de Federico y col. resumen diferentes estudios que emplean la determinación de IGF-I en el diagnóstico de la deficiencia aislada de GH en la infancia ⁽¹²⁾, mostrando que la sensibilidad de IGF-I varía entre el 34 y 90% (la mayoría >70%) y la especificidad entre el 32 y 100% (la mayoría >70%) para la IGFBP-3.

Otras pruebas del eje GH-IGFs
Diferentes parámetros para la evaluación del eje GH-IGFs han sido propuestos. Entre ellos merecen mencionarse GH urinaria, IGF-II, IGFBP-2, ALS, secreción espontánea de GH (de 12 o 24 horas), prueba de generación de IGF-I (eventualmente con la medición concomitante de IGFBP-3 y ALS) y el empleo de secretagogos de GH. Estas determinaciones pueden resultar de utilidad en situaciones particulares para poner de manifiesto alteraciones específicas del eje.

Recomendaciones prácticas
El diagnóstico de deficiencia de GH es generalmente auxológico (con excepción de la deficiencia de GH adquirida) y requiere confirmación bioquímica. La confirmación debe realizarse con dos pruebas farmacológicas de estimulación. Las dos más utilizadas en nuestro medio son infusión de arginina (0.5 g/kg de peso durante 30 minutos, dosis máxima 25 g) y clonidina (100 ug/m²). Estas pruebas pueden realizarse en días separados o en forma secuencial.
Aunque no existe un acuerdo generalizado sobre la necesidad del pre-tratamiento con esteroides sexuales, merece resaltarse que la Comisión Nacional Asesora para el Tratamiento con Hormona de Crecimiento del Ministerio de Salud Publica de la Nación por Resolución 120 del año 1992, recomiendan el pre-tratamiento con esteroides sexuales (estrógenos o testosterona inyectable 100 mg por vía intramuscular 7 días antes de la prueba) a partir de los 8 años de edad ósea. El hallazgo de menores niveles de respuesta de GH en el grupo etario comprendido entre los 4 y 8 años ha generado controversia sobre la necesidad de extender el empleo del pre-tratamiento a esta población ⁽⁶⁾.
Para establecer un nivel de corte para el diagnóstico de la GHD cada Laboratorio debe establecer su propio límite de acuerdo al inmunoensayo utilizado en la determinación de GH. Este limite se aproxima a 10 ng/ml para los inmunoensayos que miden todas las formas moleculares de GH (RIA policlonales desarrollados, Biosource) y alrededor de 4-5 ng/ml para aquellos que solo miden la forma 22 kDa (Immunotech, DELFIA, DSL). Para aquellos ensayos que miden distintas proporciones de las diferentes formas moleculares, el nivel de corte está entre estos límites (QLIA IMMULITE, DPC RIA). Estos cortes están avalados por estudios recientes que utilizan criterios clínicos de respuesta al tratamiento de GH como validación del diagnostico bioquímico ⁽¹³⁾.
Debemos recordar que todo límite de corte es por definición arbitrario y necesariamente intenta balancear la sensibilidad y la especificidad. Además la deficiencia de GH pareciera ser un espectro continuo desde alteraciones mínimas hasta deficiencias severas.
Debe complementarse la información de las pruebas de estimulo de GH con las determinaciones de IGF-I e IGFBP-3. Es necesario enfatizar la necesidad de contar con valores de referencia estandarizados por edad, sexo y desarrollo puberal y preferentemente pertenecientes a la población en estudio. Es recomendable que además de los niveles absolutos de IGF-I e IGFBP-3, estos se informen en unidades de desvío estándar (SDS). En aquellos casos en que los niños en estudio presenten alteraciones cronológicas de la pubertad (pubertad retrasada o precoz), la expresión de los niveles de IGF-I e IGFBP-3 en SDS debería realizarse de acuerdo al desarrollo puberal del paciente. Como no se dispone de un estándar internacional de referencia para la calibración de los calibradores de los inmunoensayos, existe una gran variabilidad entre los resultados de los diferentes inmunoensayos ^(14,15). Debe recordarse que la capacidad de discriminación de los niveles de IGF-I es menos informativa en niños hasta 3-4 años.
Los niveles de IGFBP-3 son menos dependientes de la edad y en general presentan niveles fácilmente medibles, aún en niños de corta edad. Debe resaltarse la alta especificidad de la medición de IGFBP- 3, con una menor sensibilidad en comparación con IGF-I. A diferencia de IGF-I no se han descrito grandes variaciones entre los diferentes inmunoensayos de IGFBP-3.

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Posibilidades y dificultades en el diagnóstico de hiperplasia suprarrenal congénita

Evaluación en el recién nacido
En todo recién nacido con genitales ambiguos, o con un valor de 17-α-hidroxiprogesterona (17OHP) elevado en los programas de pesquisa, un endocrinólogo pediatra debe descartar el diagnóstico de HSC por deficiencia de la enzima 21-hidroxilasa ⁽¹⁾. La medición de 17OHP en muestra de suero o plasma puede requerir más de una determinación en recién nacidos prematuros que presentan valores más elevados.
La pesquisa neonatal para HSC por deficiencia de la enzima 21-hidroxilasa se debe realizar idealmente a las 48-72 hs de vida en una muestra de sangre sobre papel de filtro por métodos sensibles y específicos. Cada laboratorio de pesquisa debe establecer sus niveles de corte relacionados con la edad gestacional y el peso de nacimiento ⁽²⁾.
La factibilidad de cada programa de pesquisa está basada en la evaluación de falsos positivos (especificidad) y falsos negativos (sensibilidad) ⁽³⁾. Existe un compromiso entre estos dos parámetros y el nivel de corte debe establecerse en el nivel más bajo que asegure una adecuada sensibilidad sin pérdida importante de la especificidad. Esto puede alcanzarse fijando un valor de corte no demasiado elevado y sometiendo a todos los niños con valores superiores al nivel de corte a una segunda determinación de 17OHP en una muestra de suero o plasma. En niños no afectados los niveles de 17OHP usualmente disminuyen con la edad, mientras que en niños con HSC aumentan ⁽³⁾. En los primeros meses de vida, y especialmente en el primer mes, se debe incrementar la especificidad de la determinación de 17OHP por extracción con solventes orgánicos de la muestra previo a la determinación ⁽³⁾, comparándose los niveles encontrados con valores obtenidos en niños normales de la misma edad. Es importante señalar que los valores post extracción en este periodo de la vida pueden representar una fracción tan pequeña como el 10% de la determinación no extractiva. La caracterización molecular del gen CYP21 permite el diagnostico etiológico, permitiendo el consejo genético a la familia y eventualmente la caracterización de portadores heterocigotos, formas no-clásicas y aún pacientes con deficiencia de la 11-β-hidroxilasa, presentando todos ellos valores persistentemente elevados de 17OHP.

Diagnóstico de la forma no clásica de HSC
Aunque los niveles aumentados de 17OHP pueden sugerir el diagnóstico de la forma no clásica de HSC por deficiencia de la enzima 21-hidroxilasa, la prueba de estimulación con ACTH sintético constituye el método de elección para caracterizar esta alteración ⁽⁴⁾. Los nomogramas establecidos por Maria New y colaboradores hace más de 20 años utilizando los niveles basales y estimulados con ACTH, permiten la identificación de pacientes con deficiencia clásica de 21-hidroxilasa, de pacientes con la forma no-clásica y, en muchos casos, de pacientes heterocigotos para mutaciones en el gen CYP21. Sin embargo, con la disponibilidad de la genotipificación de mutaciones en el gen CYP21, se han encontrado en algunos pacientes portadores para mutaciones en este gen (un solo alelo mutado) respuestas de 17OHP en prueba de ACTH en el rango de pacientes con la forma no clásica homocigotos o heterocigotos compuestos para mutaciones en el gen CYP21 (2 alelos mutados) ⁽⁵⁾.
Los niveles de corte de la respuesta normal de 17OHP al estimulo con ACTH son dependientes del inmunoensayo utilizado para su medición. En un estudio colaborativo realizado por la SAEM en varios Hospitales de nuestro país se determinaron los niveles de respuesta de 17OHP en niñas y adolescentes normales utilizando dos radioinmunesayos de uso frecuente en nuestro medio, estableciéndose niveles de corte de 17OHP a los 60 minutos de la administración endovenosa de 0.25 mg de ACTH sintético de 7.0 ng/ml para el RIA-DPC y de 6.0 ng/ml para el RIA-DSL ⁽⁶⁾. Sin embargo al no disponerse de pruebas similares en pacientes con HSC estos niveles de corte deben tomarse como provisorios. Diferentes estudios han determinado un límite de corte de la respuesta de 17OHP a los 60 min entre 10 y 20 ng/ml. En niñas postmenárquicas se sugiere realizar la prueba de ACTH en fase folicular temprana (hasta el dia 5 del ciclo) y entre las 8:00 y 9:00 hs.

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Posibilidades y dificultades en el diagnóstico de la pubertad precoz

Se define como pubertad precoz al inicio de caracteres sexuales secundarios (telarca y vello pubiano en la mujer y aumento del tamaño testicular en el varón) antes de la edad de los 8 años en la mujer y de los 9 años en el varón.
El diagnóstico de la pubertad precoz central o dependiente de gonadotrofinas se realizaba clásicamente por las determinaciones de los niveles estimulados con Gn-RH de LH y FSH medidos por RIA, con respuesta máxima de LH > 10 UI/L ⁽¹⁾. Con la introducción de inmunoensayos automatizados con detección fluorométrica se ha incrementado notablemente la sensibilidad de detección de los niveles séricos de LH y FSH permitiendo en muchos casos el diagnóstico de pubertad precoz central con las determinaciones basales de ambas gonadotrofinas. Utilizando ensayo IFMA-DELFIA para medir niveles séricos de LH pudo establecerse el diagnóstico de pubertad precoz central en el 71% de los varones y el 63% de las mujeres solamente con determinaciones basales ⁽²⁾. Para los restantes casos resultó necesario realizar la prueba de Gn-RH. Utilizando una metodología similar se ha encontrado que el mejor parámetro diagnóstico de la pubertad precoz central lo constituye el cociente entre el nivel estimulado máximo de LH y el nivel estimulado máximo de FSH. Un nivel de corte >0.30 permitió identificar el 94% de las pacientes con pubertad precoz y diferenciarlos de pacientes con telarca precoz ⁽³⁾. Es importante señalar que la validez de este cociente está limitada a valores de LH y FSH superiores a 4 UI/L. Los niveles de corte de los basales de LH se han establecido en 0.6 UI/L para IFMA en ambos sexos y la respuesta máxima de LH 9.6 UI/L en varones y 6.9 UI/L en niñas. La baja sensibilidad de los métodos de estradiol hace su determinación poco útil en el diagnostico de la pubertad precoz central. Los niveles basales de esteroides sexuales resultan de mayor utilidad en varones. Una concentración plasmática de testosterona matinal superior a 0.30-0.50 ng/ml sugiere activación puberal ⁽⁴⁾. El urocitograma resulta de gran valor para determinar en forma no invasiva el nivel de estrogenización, sin embargo no permite realizar el diagnóstico de pubertad precoz ⁽³⁾.

Referencias de la sección 1:

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