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Revista argentina de endocrinología y metabolismo

On-line version ISSN 1851-3034

Rev. argent. endocrinol. metab. vol.45 no.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires Jan./Mar. 2008

 

El receptor de la hormona de crecimiento humana (hGH) y la proteína de transporte de alta afinidad de la hGH

Human Growth Hormone (GH) Receptor and the High Affinity GH-Binding Protein

Ballerini, María Gabriela*, Ropelato, María Gabriela**

Sección Laboratorio-División de Endocrinología - Hospital de Niños Dr. Ricardo Gutiérrez

* Bioquímica de planta del Gobierno de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires
** Jefa de la Sección Laboratorio-Miembro de la Carrera de Investigador del Consejo de Investigación en Salud del Gobierno de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Dirección Postal: Gallo 1360. Ciudad Autónoma Bs. As. -1425.

Correspondencia a tel/ fax: 4963-5931 / 4963 - 5930. y/o e-mails: mgballerini@cedie.org.ar / gropelato@cedie.org.ar

Resumen

La hormona de crecimiento humana (hGH) circula parcialmente unida a su proteína de transporte de alta afinidad (GHBP) la cual resulta del clivaje proteolítico del dominio extracelular del receptor de GH. Recientemente la enzima TACE se identificó como la metaloproteasa responsable del clivaje y liberación de GHBP a circulación. Aunque aún se desconoce la función específica de esta proteína de transporte, distintos trabajos en la literatura demuestran efectos que potencian y efectos inhibitorios sobre la acción de GH. Por otro lado, existen evidencias que demuestran una fuerte relación entre la GHBP y el nivel de receptor de GH en el hígado en situaciones fisiológicas y patológicas. Esto permitió proponer a la determinación de GHBP en suero como un marcador periférico de la abundancia del receptor de GH en los tejidos. La determinación de la concentración de GHBP sería de especial interés para evaluar pacientes con diagnóstico probable de insensibilidad a la acción de GH y orientar el posterior estudio de anormalidades en el gen del receptor de GH. En la presente revisión, también se abordan dificultades metodológicas relacionadas a la medición de GHBP sérica.

Palabras clave: hGH; RGH; Stat5b; TACE; GHBP.

Abstract

Human circulating growth hormone (GH) is partly bound to a high-affinity binding protein (GHBP) which is derived from proteolytical cleavage of the extracellular domain of the GH receptor. Recently, the metalloproteinase TACE has been identified as an important enzyme responsive for inducing GHBP shedding. Although the specific function of GHBP is not fully known, both enhancing and inhibitory roles of this binding protein on GH action have been proposed. Many reports have demonstrated a close relationship between GHBP and the liver GH receptor status in physiological conditions and diseases. Moreover, serum GHBP measurement has been proposed as an useful peripheral index of the GH receptor abundance. Related to the latter, circulating GHBP concentration would be of special interest for the evaluation of GH insensitivity due to GH receptor gene abnormalities. In addition, the present review also focus on methodological problems concerning serum GHBP measurement.

Key Words: hGH; GHR; Stat5b; TACE; GHBP.

Introducción

El receptor de la hGH (RGH) constituye un regulador crítico del crecimiento de la vida posnatal y del metabolismo. En humanos, el RGH está constituido por un dominio extracelular (DEC), un dominio transmembrana (DTM) y un dominio intracelular (DIC) asociado a moléculas con actividad tirosina quinasa (JAK2). En los últimos años, el clonado del RGH, su asociación a JAK2 y el descubrimiento de las moléculas activadoras de la transcripción (Stat) han sido hallazgos clave para el entendimiento del mecanismo de acción de la hGH. Por otro lado, recientemente fue identificada la enzima TACE que produce el clivaje proteolítico del ectodominio del RGH y genera la proteína de transporte de GH en circulación (GHBP). El síndrome de Laron es una enfermedad autosómica recesiva de penetrancia completa que ocurre por defectos moleculares en el RGH y que resulta en la resistencia a la acción de la GH. Pacientes con esta patología se caracterizan por presentar niveles elevados de GH, niveles del factor de crecimiento insulino símil (IGF-I) disminuidos o no detectables y falta de respuesta al test de generación de IGF-I. La mayoría de las mutaciones descriptas del RGH en el Síndrome de Laron afectan el DEC del receptor y generalmente, la ausencia o marcada disminución de los niveles de GHBP en suero hacen pensar este síndrome. Actualmente, se sabe que pacientes con concentraciones de GHBP dosables y sospecha de resistencia a la acción de GH podrían presentar mutaciones a nivel de los DIC y DTM, o bien en algunos de los componentes involucrados en el mecanismo de transducción de señal.
El presente informe constituye una actualización sobre el RGH y sus formas polimórficas más frecuentes, el mecanismo de acción de la hGH y la proteína de transporte GHBP. Además, propone la determinación de GHBP en suero como una herramienta útil en el estudio molecular posterior del RGH en pacientes con deficiencias no clásicas de GH y sospecha de resistencia a la GH.

Receptor de hormona de crecimiento humana

La hormona de crecimiento humana (hGH), al igual que la prolactina (PRL), son hormonas secretadas por la adenohipófisis, que se encuentran estructural y funcionalmente relacionadas con una gran variedad de factores de crecimiento, como las interleuquinas y citoquinas. Debido a la semejanza entre los receptores y mecanismos de transducción de señal de estas hormonas y factores, sus receptores fueron agrupados bajo la denominación común de: "Superfamilia de receptores de citoquinas". Estos receptores tienen la particularidad de estar anclados a la membrana celular, exponiendo un dominio extracelular de unión a su ligando específico. A su vez, existe un subgrupo de estos receptores, entre los que se encuentran el receptor de hormona de crecimiento (RGH), el receptor de eritropoyetina, el receptor de PRL, y otros, que, por su alta similitud estructural y funcional, se denominan:"Receptores Clase I de citoquinas" (1,2).
El gen de RGH humana está ubicado en el brazo corto del cromosoma 5 (región p13.1-p12) (3). La caracterización del RGH evidenció 9 exones codificantes, numerados del 2-10. El exón 2 codifica para el péptido señal, los exones 3-7 al dominio extracelular (DEC), el exón 8 al dominio transmembrana (DTM) y el 9-10 al dominio intracitoplasmático (DIC). En la actualidad se han descripto más de 50 mutaciones en el gen del RGH, constituyendo el DEC del mismo la región en las que se han comunicado la mayor parte de las alteraciones(4,5). La molécula de RGH está constituida por 638 aminoácidos, que incluye una secuencia de 18 residuos que comienzan en metionina y un corte de 14 residuos hidrofóbicos, que indican que se trata de un péptido de señal. La forma madura del RGH la componen 620 aminoácidos, con un peso molecular aproximado de 70 Kd previo al proceso de glicosilación. En su estructura se pueden diferenciar tres dominios: un DIC de 350 aminoácidos, una porción transmembrana y un DEC de unión a la hormona de crecimiento de 246 aminoácidos, este último idéntico a la proteína ligadora de hormona de crecimiento humana de alta afinidad (GHBP) circulante en el plasma(6,7). Existen al menos tres isoformas descriptas de la región codificante del DIC del RGH: la forma más abundante o completa del DIC (full-length=fl), una forma idéntica al anterior excepto por 26 pb que se pierden por splicing alternativo en el exón 9, generando una isoforma truncada del RGH (RGH-tr o RGH-(1-279)) que carece de un 97.5% del DIC, y finalmente una tercera isoforma que únicamente contiene 7 residuos del DIC, producto de la pérdida total del exón 9 (RGH-(1-277))(8-10). Estas dos últimas isoformas truncadas del RGH inhiben la función de la forma completa del mismo in vitro(8,9). En cuanto a la región codificante del mRNA del DEC del receptor, existen dos isoformas: una que retiene al exón 3 (fl) dando la forma completa del RGH o full-lenght, y una que lo carece (d3)(11). Respecto del mecanismo de generación de esta última, se cree que una deleción genómica de 2.7 pb que incluirían al exón 3 y no un splicing alternativo del mismo sería la forma más probable de generación de esta isoforma(12). De la heterogeneidad de ambas isoformas resultan los genotipos homocigota para el fl, homocigota para el d3 y heterocigota fl/d3 para el RGH. La frecuencia alélica estimada en la población es de 75% y 25% para los genotipos fl-RGH y d3- RGH, respectivamente(12,14). Se ha demostrado que los niños deficientes de GH, niños con síndrome de Turner y pequeños para su edad gestacional portadores de la variante d3 del RGH presentan una mejor respuesta al tratamiento con GH(15-17). Sin embargo, existen trabajos contradictorios al respecto(18-20) y mas aún, la capacidad diferencial de respuesta al tratamiento con GH en relación al genotipo del exón 3 no es clara debido a que ambas formas del DEC exponen iguales propiedades de afinidad por la GH(21). Por otro lado, existe escasa información acerca de la posible asociación del genotipo del exón 3 y parámetros bioquímicos relacionados al crecimiento en sujetos normales. Un estudio reciente de nuestro grupo de trabajo muestra que los niveles de GHBP fueron estadísticamente menores en niños normales portadores de 1 ó 2 copias del alelo que tiene la deleción del exón 3 del RGH comparados con los obtenidos en niños portadores de ambos alelos con la forma completa del receptor(22). Un impacto diferencial del genotipo sobre la acción proteolítica de la enzima que interviene en el clivaje proteolítico del RGH y liberación de GHBP al medio podría explicar este hallazgo(23).
Finalmente, otra característica de los receptores Clase I de Citoquinas es la presencia de sus dominios extracelulares en circulación. Estas formas solubles de DEC cumplen funciones agonistas o antagonistas. La forma soluble del DEC del RGH constituye la proteína ligadora de hormona de crecimiento humana de alta afinidad (GHBP). En conjunto, los niveles de GH, el recambio o turnover del RGH, la regulación posreceptor y los niveles de GHBP determinarán el efecto biológico final de la hormona de crecimiento humana(24,25).

Mecanismo de acción de la hormona de crecimiento humana

El receptor de la hormona de crecimiento humana está ampliamente distribuido en todo el organismo, aunque su expresión es particularmente importante en el hígado(26), donde la GH estimula genes relacionados al crecimiento lineal como el factor de crecimiento insulino-símil tipo-I (IGF-I), la proteína de transporte de IGF-I tipo 3 (IGFBP-3) y de la subunidad ácido lábil (ALS), favoreciendo la vida media del IGF-I en circulación por la formación del complejo ternario IGF-I/IGFBP-3/ALS. Además de sus acciones promotoras del crecimiento, la hormona de crecimiento ejerce funciones metabólicas, es hiperglucemiante, anabólica y lipolítica. También tiene otros efectos de regulación sobre la función cardíaca e inmune, agilidad mental y el proceso de envejecimiento(6).
La GH actúa uniéndose los receptores que se encuentran bajo la forma de homodímeros en la membrana de las células(27) (Figura 1). El hallazgo reciente de formación constitutiva de la forma dimérica del RGH en la membrana celular desafió el modelo históricamente conocido de la formación de dímeros de activación del RGH inducido por la unión de la GH(28). Los trabajos de Gent y colaboradores demostraron la existencia de dímeros inactivos del RGH en el retículo endoplásmico en ausencia del ligando específico (GH) y permitieron postular un nuevo mecanismo mediante el cual una única molécula GH generaría los dímeros de activación (2RGH:1GH)(27,29-30). El dominio extracelular del RGH está compuesto por un subdominio 1 N-terminal de unión a la GH y un subdominio 2 próximo a la membrana celular. Entre ambos subdominios existe una región denominada bisagra. Inicialmente, el dímero del RGH se formaría por la interacción de los subdominios 2 del DEC, proceso facilitado por proteínas chaperonas del retículo endoplásmico. Paso seguido los DTM interactuarían y sellarían ambos receptores bajo una estructura dimérica para finalmente ser transportados hacia la membrana como homodímeros(30).

Figura 1:
Modelo de mecanismo de activación del RGH. La GH se une a un dímero constitucionalmente formado del RGH en la membrana celular. En consecuencia los RGH rotan y permiten que las Jak2 unidas al dominio intracelular de los mismos se alineen apropiadamente y se transfosforilen mutuamente iniciando la cascada de transducción de señal intracelular.

La dimerización constitutiva del RGH determinó que un cambio conformacional de los RGH inducido por la unión de la GH sería el responsable del mecanismo de activación del proceso de transducción(28). El RGH, al igual que otros integrantes de la superfamilia de receptores Clase I de citoquinas, no presenta actividad tirosina-quinasa "per se" en su dominio intracelular, sino que se relaciona física y funcionalmente a moléculas no receptoras de la familia de las tirosina-quinasas Janus (JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2). En el caso particular del RGH, JAK2 se acopla a una secuencia rica en prolina del DIC del RGH (Box 1) cercana a la membrana celular. Debido a que Box 1 es la única región citoplasmática conservada entre todas los miembros de la familia de receptores de citoquinas que utilizan a JAK2 en su señal de transducción, el Box 1 es el sitio involucrado en la interacción receptor-JAK2. Mutaciones o deleciones en el Box 1 impiden la formación del complejo receptor-JAK2, y la posterior activación del receptor, luego de la unión de la GH al mismo(1,6). Además de su función en la activación de los mecanismos intracelulares de transducción de señal, las moléculas JAK2 potenciarían la estabilidad de la forma madura del RGH y tendrían un rol regulatorio en la proteólisis del DEC del receptor(31-32). La unión de la GH al dímero de RGH aproxima dos moléculas de JAK2 de manera suficiente para que se inicie la transfosforilación de las mismas. Las JAK2 activas fosforilan residuos tirosínicos críticos en la cascada de transducción de señal que se encuentran en el dominio citoplasmático del RGH, y fosforilan también sustratos directos de las moléculas JAK como los IRS-1 y -2(27,28). Finalmente, las fosfotirosinas distales del DIC del RGH reclutan a los transductores de señal y activadores de la transcripción (Stat) y otras proteínas por medio de interacciones con los dominios (SH)-2. Las Stats son otra familia de proteínas intracelulares, y en el caso particular de JAK2, fosforila a por los menos 4 integrantes de la familia de las Stats: Stat 1, 3, 5a y 5b, las cuales dimerizan y se traslocan al núcleo, uniéndose a secuencias específicas del ADN e inducen la transcripción de genes GH-dependientes específicos(33). Existen al menos 2 isoformas de moléculas Stat5: la Stat5a y la Stat5b. A pesar de la alta homología entre estas formas moleculares, estudios recientes les adjudican roles diferentes y altamente específicos de especie. La disrupción génica de las Stat5 produjo en ratones defectos en la expresión de genes relacionados al crecimiento lineal, lo que indica la importancia de las mismas en la acción de GH. En un modelo de ratón knockout de la isoforma Stat5b, se observó la pérdida del dimorfismo sexual característico del crecimiento de estos roedores y falta de expresión de genes hepáticos dependientes de GH. Interesantemente, ni la Stat5a ni otras moléculas Stats pudieron revertir los efectos negativos de la falta de Stat5b sobre el crecimiento lineal(34). El camino de JAK2/Stat5b/ IGF-I juega un rol crítico en la regulación del crecimiento posnatal, sin descartar que otros sistemas también estuvieran involucrados(35).
La regulación negativa del mecanismo de transducción de señal inducido por la GH está a cargo de unas moléculas codificadas por genes citoquina- inducibles, denominadas "supresoras de señal de transducción de receptores de citoquinas" o "Socs"(36). Las moléculas Socs pertenecen a una gran familia, aunque únicamente las Socs 1, Socs 2 y Socs 3 se transcriben inducidas por GH mediante un mecanismo que aún no ha sido del todo esclarecido, aunque se cree que las Stats estarían involucradas en el mismo. Es altamente probable que las Socs inhiban la señalización de GH y otros receptores relacionados inactivando la actividad quinasa de las JAKs. Sumado a la acción de las Socs, existe un mecanismo de activación y reclutamiento de una o más proteínas tirosina-fosfatasas que producirían la defosforilación de las JAKs y del RGH, conduciendo hacia su inactivación(6).
Finalmente, el RGH es constitutivamente internalizado vía estructuras recubiertas por clatrina, y transportado a través de endosomas hacia los lisosomas para su posterior degradación. Tanto la internalización como el transporte del RGH a lisosomas es dependiente de un sistema ubiquitina-proteosoma, para el cual se requiere la indemnidad del motivo de endocitosis ubiquitina-dependiente del RGH (UbE-motif, DSWVEFIELD). Interesantemente, el fenómeno de dimerización es indispensable para el proceso de degradación ubiquitina-dependiente, debido a que formas quiméricas, no dimerizables del RGH, fueron rápidamente internalizadas por endocitosis sin depender del mecanismo de degradación ejercido por el sistema ubiquitina(29,36).

Alteraciones del crecimiento relacionadas a mutaciones del RGH

Alteraciones del crecimiento relacionadas a mutaciones en el RGH producen el síndrome de insensibilidad a la acción de la GH, descrito por primera vez en 1966 por Laron y col.(37). A continuación se hará una breve referencia a algunas de las mutaciones recientemente identificadas que afectan la expresión, activavión o señalización del RGH.

Fallas en la expresión:
Una mutación puntual que activa un pseudoexón genera la inserción de 36 residuos en la región de dimerización del RGH. Esta forma elongada del RGH altera el proceso de transporte del receptor hacia la membrana quedando atrapado en el núcleo y expresándose en menor proporción en la membrana celular(38).

Fallas en la activación:
La sustitución de un residuo histidina por un aspartato en la posición 152 (D152H) localizada en la interfase de dos DEC del homodímero del RGH afectaría la correcta rotación y cambio conformacional que debe experimentar el RGH para la activación del proceso de transducción(39,40).

Fallas en la señalización:
Debido a una mutación en el exón 9 que afecta el sitio aceptor de splicing se genera una forma truncada del receptor que conserva únicamente 7 residuos del DIC. Como consecuencia, se pierde el UbE-motif necesario para el proceso de internalización del RGH, acumulándose estos receptores en la membrana y actuando como dominantes negativos frente a la forma completa del RGH. Esto permite entender el retardo severo del crecimiento en pacientes que portan esta mutación aún en heterocigosis(9). Recientemente fueron descriptas dos mutaciones que también afectan la señal de transducción y son producidas por un cambio en el marco de lectura y generación de un codón de stop prematuro(41,42). Estos receptores están truncados a partir del residuo 449 y 581, respectivamente, y en ambos casos sólo está afectada la posibilidad de activar Stat5, mientras que conservan la habilidad de activar JAK2, Stat3 o la vía de las MAP quinasas.

Defectos posreceptor:
El síndrome de insensibilidad a la acción de GH puede también tener su origen en alteraciones en algunos de los componentes intracelulares involucrados en su mecanismo de transducción de señal. La combinación de retardo del crecimiento e inmunodeficiencia hizo pensar en defectos genéticos compartidos por diferentes integrantes de la familia de citoquinas. Un ejemplo de ello son mutaciones que afectan la molécula de Stat5b(43-46). Recientemente en el Hospital de Niños Dr. Ricardo Gutiérrez se identificó una nueva mutación de la Stat5b en una paciente del sexo femenino, que asocia insensibilidad a la GH e inmunodeficiencia(46). Estos trabajos demuestran el rol crítico, especialmente de la molécula Stat5b, en la producción de IGF-I, el crecimiento posnatal y pone en evidencia el cross-talk que existe entre los diferentes receptores de la Familia de Receptores de Citoquinas.

GHBP: Homología con el dominio extracelular del receptor de hormona de crecimiento humana

Transcurrieron varias décadas desde que se tuvo la primera evidencia de la existencia de un componente en sangre capaz de interactuar con la GH hasta su posterior caracterización(47). Entre los años 1986 y 1987, finalmente se describió y caracterizó una proteína de baja capacidad y alta afinidad que específicamente unía alrededor del 50% de la GH circulante en el plasma humano: proteína ligadora de hormona de crecimiento humana de alta afinidad o GHBP(48-50). En el plasma humano también se describió otra proteína que une alrededor del 5-8% de la GH total circulante, especialmente la isoforma de 20 kd, de la cual se desconoce su regulación(49).
En humanos y conejos, la GHBP se genera por clivaje proteolítico del dominio extracelular del RGH permitiendo su liberación al medio vascular(51) (Figura 2). Recientemente fue descubierta una enzima anclada a la membrana celular involucrada en la proteólisis del RGH(52,53). Esta enzima forma parte de una superfamilia de enzimas conocidas como metzincinas, desintegrina y metaloproteinasas (ADAM) que intervienen en diferentes procesos de proteólisis. La ADAM-17, también conocida como TACE (enzima convertidora de TNF-α) es la enzima responsable del clivaje del DEC del RGH y liberación de GHBP a circulación. Aunque aún no han sido identificados los residuos específicos del clivaje ni su regulación, se sabe que sería necesaria la integridad de la región yuxtamembrana para el clivaje enzimático(54). Esta proteasa, se sintetiza como un precursor que incluye un prodominio, un dominio catalítico que contiene un sitio de unión al Zn, un dominio desintegrina, un dominio EGF/crambina rico en cisteínas, un dominio transmembrana (TM) y un dominio citoplasmático. Su prodominio contiene un sitio rico en cisteína que interactúa y neutraliza al átomo de Zn en el sitio catalítico, manteniendo a la enzima como zimógeno (inactiva) durante el tránsito por el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi. Al llegar a la membrana se elimina el prodominio quedando anclada a membrana en su forma activa(55). Esta metaloproteasa no es específica del RGH, sino que participa en el clivaje de otras proteínas de membrana. La enzima TACE, cliva al monómero de RGH en una región llamada "stem" generando la GHBP que difunde al espacio pericelular y de allí a circulación. El producto remanente en membrana, sufre una segunda proteólisis por acción de una γ-secretasa, originando un péptido intracelular del cual se desconoce su relevancia biológica (55). Como fue mencionado anteriormente, debido a la existencia de diferentes isoformas del RGH, la concentración de la GHBP en suero sería el producto final del clivaje proteolítico de las formas completas y truncadas del RGH, las cuales a su vez podrán corresponder a diferentes polimorfismos del exón 3 del DEC (fl-RGH o d3-RGH).

Figura 2:
Mecanismo de generación de GHBP: la acción proteolítica de la enzima de membrana TACE sobre el dominio extracelular del RGH permite la liberación de GHBP (shedding) al medio vascular. La GH en plasma se une a su proteína de transporte (GHBP) en una relación 1:1.

La activación de la TACE puede ser inducida farmacológicamente por la acción de ésteres de forbol que activan las vías dependientes de protein kinasa-C (PK-C) y por reactivos que son inactivantes de grupos sulfhidrilos(56). Sin embargo, aún no se conocen los mecanismos moleculares que regulan la proteólisis del RGH ni la regulación fisiológica de la enzima TACE. Por un lado se vio que el receptor en su forma dimérica era resistente a la acción proteolítica de la enzima TACE(56), mientras que la molécula de GH sería necesaria para la interacción de la TACE con el RGH(53). Recientemente, se demostró que JAK 2 influiría en el mecanismo de proteólisis del RGH(32). El estudio de la regulación de la enzima TACE podría proveer información adicional acerca del mecanismo que controla la expresión del RGH en membrana y la liberación de su dominio extracelular (GHBP) a circulación.

GHBP: fuentes titulares, distribución y regulación

Debido a problemas éticos y limitaciones prácticas, es muy escasa la información que se tiene respecto de la expresión del RGH en humanos, aunque se sabe que el hígado sería el órgano más enriquecido en este receptor y el que contribuiría en mayor grado a la GHBP circulante en plasma(57). También se encontró alta expresión de la enzima TACE en el hígado (58). Si bien, estudios en circulación venosa determinaron mayores niveles de GHBP en la vena hepática que en cualquier efluente de otro órgano, también se ha observado que otros tejidos como riñón, músculo, cerebro, corazón, tejido adiposo, etc.(59), contribuirían en menor proporción, a la GHBP total circulante. Dada la alta correlación encontrada entre los niveles de esta proteína de alta afinidad y la masa grasa(60), se postuló que el tejido adiposo podría ser una fuente importante de generación de GHBP, aunque actualmente se sabe que el mismo contribuye en un porcentaje ínfimo a los niveles séricos de esta proteína, y posiblemente serían factores producidos por el adipocito los que estarían regulando la expresión del RGH y /o la liberación de GHBP al medio(61).
En la literatura no existe evidencia clara de los mecanismos de regulación involucrados en la modulación de la GHBP sérica. En la Tabla 1 se muestran algunos factores que se asociaron a cambios en los niveles plasmáticos de la GHBP en el hombre.

Tabla 1: Factores fisiológicos, nutricionales y farmacológicos que se asocian a cambios en los niveles plasmáticos de la GHBP en el hombre.

A pesar de lo expuesto, es controvertida la información acerca de la acción de esteroides sexuales y la GH sobre los niveles de GHBP. Durante la etapa puberal no se han registrado diferencias significativas entre ambos sexos(22,74,76). Tampoco se observaron modificaciones significativas en los niveles de GHBP en suero durante el ciclo menstrual (77). Además, en pacientes con déficit total de aromatasa y síndrome de Turner se han reportado niveles normales o ligeramente elevados(78,79), aún tratándose de situaciones con niveles no detectables o muy bajos de estrógenos. Respecto de la acción de GH en pacientes con déficit de la misma, diversos trabajos muestran que los niveles de GHBP no variaron o normalizaron(80,81) en el transcurso del tratamiento sustitutivo de esta hormona.

GHBP: función

La función primaria y fundamental de la GHBP es la formación endógena de complejos 1:1 con la GH (complejos GH-GHBP) (Figura 2). En plasma, la GHBP une alrededor del 50% de la GH(82), salvo en los picos secretorios de esta hormona, donde se une hasta el 80%(83). En consecuencia, la GHBP atenúa las oscilaciones propias de la secreción episódica de GH, prolongando su vida media de 7 a 29 minutos, en parte también por la incapacidad del riñón de filtrar por el glomérulo el complejo GH/GHBP de alto peso molecular(84). En efecto, la formación de complejos estaría asegurando un reservorio de GH en circulación para los tejidos blanco. Estos efectos "in vivo" tienden a aumentar la biodisponibilidad y potenciar la acción de GH. Sin embargo, estudios "in vitro" han demostrado que la GHBP inhibe la unión de GH a su receptor en forma dosis dependiente posiblemente por competencia con el receptor y secuestro de GH.
Finalmente, los efectos positivos de la GHBP sobre la acción de GH observados a dosis fisiológicas servirían de alguna manera para neutralizar los efectos inhibitorios coexistentes(85).

Métodos para la cuantificación de GHBP en suero

Existen diferentes métodos para la determinación de GHBP en suero:
a) Métodos que miden la capacidad de unión de la GHBP a la GH: cromatografía y ensayos de inmunoprecipitación
b) Inmunoensayos: radioinmunoensayos y ensayos de ELISA (kit comercial)
c) Ensayos inmunofuncionales mediados por ligando: ELISA desarrollado y Fluoroinmunoensayos

Los métodos mas comúnmente utilizados para la cuantificación sérica de GHBP medían capacidad de unión y consistían en la incubación de la muestra de suero con GH marcada radiactivamente, y posterior separación de la fracción libre de la unida por cromatografía o mediante el uso de una suspensión de carbón-dextrán(48). Estas metodologías eran engorrosas y poco prácticas en el laboratorio clínico, presentaban el inconveniente de una difícil interpretación de los resultados debido a la interferencia de la GH endógena presente en el suero(48,86,87). Además, estos ensayos de unión miden el total de GHBP presente en la muestra y no permiten determinar con precisión la fracción unida en forma endógena de la GH a la GHBP (complejos GH/GHBP endógenos), ofreciendo estos métodos únicamente una estimación de la capacidad de la unión de la GHBP. Otro inconveniente residía en la utilización de material radiactivo (125I-GH) y el tiempo prolongado de procesamiento de la muestra con la posible disociación de los complejos GH/GHBP, afectando la precisión del resultado obtenido.
En 1990, Tar y col. utilizaron cromatografía líquida de alta presión para evaluar los niveles de GHBP en el plasma humano(86). Esta metodología permitía una rápida resolución (evitando la disociación de los complejos GH/GHBP) y resultaba más reproducible que la tradicional de filtración en gel.
Posteriormente, en un estudio realizado por Ho y col., se comparó el comportamiento de dos métodos en la determinación sérica de GHBP: cromatografía en gel versus un método de inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo monoclonal anti-RGH(88). Si bien, ambos métodos correlacionaron positiva y significativamente entre sí, los autores encontraron una tendencia del método de inmunoprecipitación a sobreestimar los niveles de GHBP respecto de la filtración en gel, hecho que explicaron por la posible disociación de los complejos GH/GHBP en el tiempo de procesamiento de la muestra por parte de este último.
También, se diseñaron inmunoensayos competitivos (RIA) para la determinación de GHBP inmunoreactiva en suero. Estos métodos determinan únicamente la concentración de la proteína en el suero y no permiten conocer la cantidad de GHBP total capaz de unir la GH (GHBP funcional). Además, resulta imposible relacionar la concentración de GHBP determinada en el suero por estos métodos y la sensibilidad de los tejidos a la acción de la GH(82).
En 1991, Lena Carlsson y col. diseñaron un método inmunofuncional de ELISA tipo sándwich para la determinación de la GHBP total y de los complejos GH/GHBP endógenos(89), que posteriormente fue modificado por Rajkovic y col.(90). La ventaja de esta nueva metodología reside en la posibilidad de determinar con mayor precisión la concentración de la GHBP total y de los complejos GH/GHBP endógenos presentes en el suero.
Posteriormente, se desarrolló un ensayo inmunofuncional con señal de detección fluorométrica que permite en forma específica y selectiva determinar tanto la GHBP total sérica como los complejos GH/GHBP endógenos con alta sensibilidad y especificidad(66,91). La misma incluyó la marcación del anticuerpo con especificidad anti-GHBP con quelato de Europio y puesta a punto del método. El inmunoensayo tiene por principio saturar el total de GHBP presente en el suero con GH agregada exógenamente, posibilitando la formación de complejos GH/GHBP que son capturados por el anticuerpo de captura con especificidad anti-GH inmovilizado a una superficie sólida (pocillo de microplaca). El complejo formado es luego reconocido por un segundo anticuerpo con especificidad anti-GHBP marcado con Europio. Finalmente, y posterior al agregado de una solución disociante e intensificadora de la señal de Europio, se mide la fluorescencia que resulta directamente proporcional a la concentración de GHBP de la muestra. Los complejos de formación endógena entre la GH y su proteína de transporte (GHBP) son cuantificados de igual forma pero sin el agregado de la solución saturante de GH (Figura 3).

Figura 3:
Esquema del método fluorométrico para la determinación de la concentración sérica de GHBP total inmunofuncional y complejos endógenos GH-GHBP. MAb a-GH: anticuerpo monoclonal con especificidad anti-hGH; MAb a-GHBP-Eu3+: anticuerpo monoclonal con especificidad anti-GHBP marcado con quelato de europio; ON: over night.

La utilización de metodologías inmunofuncionales mediadas por ligando permiten la determinación de GHBP total y de los complejos endógenos formados entre esta proteína de transporte y la GH, pudiendo contribuir al entendimiento de la dinámica del eje somatotrófico en situaciones aún no del todo esclarecidas.

Utilidad del la determinación sérica de GHBP

Debido a la alta homología que existe entre la GHBP sérica y el dominio extracelular del RGH, y la relación positiva de esta proteína con la sensibilidad a la GH, se ha propuesto que la determinación de GHBP en suero podría constituir una marcador periférico de la abundancia de RGH en los tejidos blanco y colaborar, junto a otros parámetros, en el estudio de pacientes con desórdenes del crecimiento( 8, 85).
Teniendo en cuenta que actualmente se cuenta con inmunoensayos funcionales mediados por ligando, es bueno que se considere la utilidad que podría constituir tanto la determinación sérica de GHBP total inmunofuncional como la determinación de complejos endógenos GH/GHBP:

- Utilidad de la determinación de GHBP total:

Los avances obtenidos en el diagnóstico de pacientes con insensibilidad a la acción de GH se debieron principalmente a la caracterización molecular de este síndrome(92,93). La abundancia del RGH en la superficie celular constituye un determinante importante de la sensibilidad celular a la acción de GH y salvo algunas excepciones, la concentración de GHBP total reflejaría la expresión del RGH en los tejidos(85). En este sentido permitiría identificar niños con diagnóstico probable de resistencia a la GH, y orientar el posterior estudio molecular.
Alteraciones en el gen del RGH (actualmente se han descrito más de 50 mutaciones del mismo) producen insensibilidad a la acción de GH (IGH)(94). El síndrome de Laron clásico (insensibilidad primaria a la GH), es una patología causada por mutaciones inactivantes del RGH, y dependiendo de la localización de la mutación, la GHBP puede o no ser detectable en suero. La mayoría de los pacientes con IGH, presentan valores de GHBP no detectables o muy disminuidos, mientras que en un porcentaje menor, están normales o aumentados(94):

• Mutaciones que afecten el dominio extracelular del RGH o aquellas que interfieran con la correcta síntesis del mismo (77% de los individuos Laron)(94,95), presentarán niveles no dosables de GHBP, también denominados "GHBP negativos", en el caso de pacientes homocigotas y heterocigotas compuestos(96). En pacientes con un alelo normal y el otro afectado, los niveles de GHBP podrían encontrase muy bajos, pudiendo explicar esta situación hasta un 5% de las bajas tallas idiopáticas(97).
• Las mutaciones en regiones de la molécula del RGH que afecten la dimerización y las señales de transducción intracelulares, darán lugar al fenotipo Laron con GHBP dosable o "GHBP positivos" (20-25% de los casos)(43-46, 94-95). Las mutaciones que afectan los sitios de splicing pueden generar la pérdida de los exones 8(98) ó 9(99) que codifican para el dominio intracitoplasmático. En el primer caso, se produce la ausencia del dominio intracelular del receptor y la generación de una molécula mutada del RGH virtualmente idéntica a la GHBP, mientras que la pérdida del exón 9 generaría una forma truncada del RGH, asociada a niveles de GHBP en suero entre 20-50 veces la concentración normal. Los individuos heterocigotos para esta última mutación presentan concentraciones de GHBP entre 2-10 veces superiores a la normal(85,94).

En 1997, Woods y col. realizaron un estudio intensivo de la relación fenotipo: genotipo en pacientes con síndrome de IGH(95). Los pacientes fueron estudiados clínica, bioquímica y genéticamente, y a su vez, fueron categorizados de acuerdo a la presencia o ausencia de GHBP en suero (GHBP positivos o GHBP negativos, respectivamente). Tanto los pacientes GHBP positivos o GHBP negativos presentaron déficit de talla, aunque en los pacientes con niveles de GHBP dosables, la altura parecía estar menos afectada que en los pacientes con niveles no detectables de esta proteína. Sin embargo, a pesar de la gran heterogeneidad fenotípica observada en la población estudiada, estos autores no pudieron encontrar una clara asociación entre el sitio o tipo de mutación del gen del RGH y la severidad de la enfermedad.
Por otro lado, partiendo de la premisa que algunos niños con baja talla idiopática (BTI) son considerados como deficientes no clásicos de hormona de crecimiento, ya que responden en forma favorable a las pruebas de estímulo de secreción de esta hormona, Carlsson y col. investigó la hipótesis que la resistencia periférica observada en estos niños, podía responder a anormalidades en el receptor de GH y ésto, a su vez, ser reflejado estudiando los niveles de GHBP séricos en una población de niños con deficiencia clásica de GH (DGH) y niños con BTI, estudiados en relación a la edad cronológica y sexo(100). Los niveles séricos de GHBP en niños con BTI y niños con DGH fueron inferiores al rango de normalidad estipulado por edad y sexo, aunque esta disminución resultaba más pronunciada en los niños con BTI. En este estudio, el 90 % de los niños con BTI presentó niveles de GHBP por debajo de la media para la edad y sexo, mientras que un subgrupo presentó una concentración de esta proteína por debajo de -2 DE.
Attie y col. estudió en un grupo de pacientes con BTI la concentración de IGF-I en SDS y la concentración media de secreción nocturna de GH en relación con la concentración de GHBP en SDS. Los pacientes con niveles más bajos de GHBP en SDS presentaron mayores niveles de GH y bajo IGF-I, consistente con insensibilidad a la acción de GH(101).
Los trabajos de Woods, Carlsson y Attie, ponen de manifiesto la posible utilidad de la determinación de GHBP en suero, que junto a otros parámetros y pruebas funcionales, permitirían identificar aquellos niños con diagnóstico probable de resistencia a la acción de GH, en sus formas parciales y severas (Sme. Laron), con el fin de orientar el posterior estudio molecular del gen del RGH.
Como fue mencionado anteriormente, niveles normales o aumentados de GHBP total en un paciente con diagnóstico probable de IGH, podrían indicar fallas a nivel posreceptor (Ver defectos posreceptor en el apartado del RGH).
Cabe finalmente mencionar que existen ciertas situaciones fisiológicas y patológicas donde no se establece el vínculo positivo entre la concentración de GHBP circulante y la función del RGH, como por ejemplo en la infancia temprana(63) y en la acromegalia(102). Los pacientes acromegálicos presentan baja concentración de GHBP, posiblemente reflejo del "down-regulation" del RGH ejercido por la alta concentración de GH, tal cual fue demostrado in vitro(103). Por otro lado, existen otras patologías crónicas, no relacionadas directamente a alteraciones en el gen del RGH, donde los niveles de GHBP total pueden estar disminuidos, como en la insuficiencia renal, la diabetes mellitus insulinodependiente, y patologías tendientes a la reducción de la masa hepática funcionante como la cirrosis(85). En la Tabla 2 se resumen las patologías que se asocian a niveles anormales de GHBP en suero:

Tabla 2: Patologías asociadas a variaciones en los niveles normales de la concentración sérica de GHBP.

- Utilidad en la determinación de complejos endógenos GH/GHBP

Existe escasa información en la literatura acerca de la utilidad potencial de la determinación sérica de los complejos endógenos entre la GH y su proteína de transporte, GHBP. Probablemente, tenga su explicación en la falta de métodos sensibles y precisos que pudieran determinar la concentración del complejo GH/GHBP. En el Laboratorio de la División de Endocrinología del Hospital Ricardo Gutiérrez se realizó un estudio de diferentes componentes del eje GH-IGFs-BPs en niños con obesidad simple, con el fin de explicar el normal/ aumentado crecimiento observado en estos niños a pesar de la conocida disminución de la GH(66). La población estudiada de obesos, presentó niveles normales de IGF-I, IGFBP-3 y ALS (todos parámetros GH dependientes) a pesar de una disminuida concentración de GH al ser comparados con un grupo de niños con peso adecuado. Por otro lado, los niños obesos, tuvieron niveles significativamente aumentados de la GHBP total (medida por un método inmunofuncional mediado por ligando generado en nuestro laboratorio). En el grupo de niños obesos, los niveles de GHBP total correlacionaron en forma positiva y significativa con el índice de masa corporal y la concentración de insulina. Este aumento de la GHBP total, reflejo del nivel de expresión del RGH en los tejidos blanco, estaría indicando un aumento en la sensibilidad a la acción de GH. Lo novedoso de este trabajo resultó el hallazgo de niveles normales de complejos endógenos GH/GHBP, medidos por la misma metodología, lo que sugeriría la existencia de un reservorio normal de GH en circulación para los tejidos blanco.
Este trabajo pone de manifiesto que la determinación conjunta de la GHBP total y complejos GH/GHBP puede ser de utilidad para conocer la dinámica del eje somatotrófico en su conjunto, tratando de explicar situaciones aún no del todo esclarecidas como el crecimiento normal/aumentado habitualmente observado en niños obesos bajo un estado de hiposomatrofinismo.

Conclusión

El receptor de hormona de crecimiento humana (RGH) es el efector más importante de la acción de la hGH en los tejidos, ya que mutaciones en los dominios que conforman su receptor producen una falla en su mecanismo de acción. La población normal puede expresar diferentes formas moleculares del RGH, producto de polimorfismos en las secuencias codificantes del gen del RGH. Sin embargo, todavía queda por dilucidar si estas variantes génicas podrían afectar algunos aspectos de la fisiología y/o farmacología de la acción de la hGH. Además, la hGH en el plasma se une con alta afinidad a la proteína de transporte (GHBP) generada por el clivaje proteolítico del dominio extracelular del RGH por acción de una enzima de membrana denominada TACE. A pesar del tiempo transcurrido desde su descubrimiento, aún hoy se desconoce la función biológica precisa de la GHBP en el plasma aunque está ampliamente documentada su relación con la secreción de GH, la composición corporal, la edad y el estatus de hormonas sexuales. Debido a la homología que existe entre la GHBP sérica y el dominio extracelular del RGH, y la relación positiva de esta proteína con la sensibilidad a la GH, se propone la determinación de GHBP en suero como un indicador periférico de la abundancia del RGH en los tejidos. Las controversias en la literatura respecto de sus niveles en plasma y su asociación a distintas condiciones clínicas, podrían deberse a aspectos metodológicos relacionados a la interferencias de la propia hGH del plasma en los ensayos para la determinación de GHBP. La utilización de metodologías inmunofuncionales de alta sensibilidad mediadas por ligando podrían constituir una herramienta útil a incluir en el estudio especialmente de pacientes con baja talla idiopática.

Agradecimientos

Las autoras desean agradecer la gentil colaboración del Dr. Horacio Domené en la lectura de la presente revisión previa a su publicación. Además, quieren resaltar el equipo de salud que integran junto a médicos, bioquímicos, técnicos y enfermeros del Grupo Crecimiento de la División de Endocrinología del Hospital de Niños Dr. Ricardo Gutiérrez para el estudio de niños con alteraciones del crecimiento.
Parte de los resultados presentados en la presente revisión fueron realizados con subsidios otorgados por el Laboratorio Pfizer Global Pharmaceutical y el PICT/2003 Nº 05-14354.

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