TRABAJOS ORIGINALES

Asociación de polimorfismos de simple nucleótido (SNP) de CD28 (IVS3+17T/C) Y CTLA-4 (+49A/G) con autoinmunidad tiroidea (AIT)

Association of single nucleotide polymorphism (SND) of CD28 (IVS3+17+K) and CTLA-4 (+49 A/G) with thyroid autoimmunity AIT)

Galarza P.^*; Canitano F.^*, Botta S.^º, Domínguez M. E.^º, Roveto S^º., Perusco A., Rimoldi D^º.,

*Laboratorio de Histocompatibilidad e Inmunogenética y
ºDepartamento de Endocrinología Clínica Instituto de Investigaciones Médicas A Lanari. UBA

Dirección Postal: Av. Combatientes de Malvinas 3150 II Cuerpo, I piso. CABA1427
Correspondencia a: drimoldi@lanari.fmed.uba.ar endoroveto@lanari.fmed.uba.ar

Resumen

La enfermedad tiroidea autoinmune es la patología autoinmune más prevalente y afecta hasta el 5% de la población general. Su desarrollo está dado por la interacción entre susceptibilidad genética y otros factores. Una característica es la temprana producción de anticuerpos antiperoxidasa tiroidea (aTPO) que a menudo predicen el desarrollo clínico de la enfermedad. La susceptibilidad genética para AIT es generada por genes del HLA y por otros candidatos del cromosoma 2q33. Esta región contiene los genes CTLA-4 y CD 28, y sus polimorfismos estarían asociados.
Objetivo: Analizar y comparar la distribución de los polimorfismos de simple nucleótido (SNP) de CD28 (IVS3+17 T/C) y CTLA-4 (+49 A/G) en pacientes con aTPO >10 IU/ml (AIT) comparados con un grupo
control aTPO ≤ 10 IU/ml sin AIT.
Sujetos y métodos: Estudiamos 69 pacientes y 36 sujetos considerados controles. Para determinar aTPO se utilizó IMMULITE 1000 y muestra sérica. Para el estudio de los SNP se extrajo ADN de sangre periférica. La amplificación de los genes se realizó por PCR. Las diferencias entre grupos fueron comparadas usando el test de Chi Cuadrado. Resultados: Observamos diferencia significativa en el genotipo CD28 C/T entre AIT y controles (p=0.026). Analizando los genotipos de los polimorfismos CTLA-4 no observamos diferencia significativa entre AIT y controles. Del análisis de asociación de genotipos CD28 C/T y CTLA-4 A/A o A/G, observamos diferencia significativa comparando AIT vs. controles (p=0,013). Conclusión: Encontramos una posible asociación significativa del genotipo CD28 C/T en individuos con AIT, y estos portadores tendrían un riesgo tres veces mayor de adquirir AIT. La combinación de los genotipos CD28 C/T y CTLA-4 A/A o A/G incrementaría cuatro veces el riesgo de adquirir AIT. Estos resultados permitirían llevar a cabo un diagnóstico precoz, con la adecuada caracterización de una posible enfermedad tiroidea autoinmune en pacientes con AIT.

Los autores declaran no poseer conflictos de interés.

Palabras clave: CD28; CTLA4; Autoinmunidad tiroidea

Abstract

The autoimmune thyroid disease is the most prevalent autoimmune affection and affects until 5% of the general population; its development is given by the interaction between genetic susceptibility and other factors. One particularity is the early production of thyroid autoantibodies against thyroid peroxidase (aTPO) which often predicts the clinical development of the disease. The genetic susceptibility for the thyroid autoimmunity (AIT) is generated by genes of the HLA and by other genes candidates of the chromosome 2q33. This region contains the genes: CTLA-4 and CD 28. Several polymorphisms of both would be associated according to previous studies. Objective: To analyze and to compare the simple nucleotide polymorphism distribution (SNP) of CD28 (IVS3+17 T/C) and CTLA-4 (+ 49 A/G) in patients with aTPO> 10 IU/ml (AIT) compared to a control group aTPO ≤ 10 IU/ml with no AIT.
Subjects and Methods: We have studied 69 patients with AIT and 36 control subjects. Serum aTPO were measured by using chemiluminescence immunoassay (IMMULITE1000, Siemens). Genomic DNA was prepared from peripheral white blood cells. The amplification of the genes was carry out by polymerase chain reaction (PCR). Statistical analyses : the differences between groups were made using the chisquare test. P less than 0.05 was considered statistically significant.
Results: There was a significant difference of genotype CD 28 C/T in patients with AIT compared with controls (p=0.026). The genotypes of CTLA-4 was analyzed and there was no significant difference between AIT and controls. Analysis of genotypes association CD 28 C/T and CTLA-4 A/A or A/G, revealed significant difference comparing AIT versus controls (p= 0.013).
Conclusions: We found a possible association of genotype CD 28 C/T in individuals with AIT, since carriers of genotype C/T would have a risk three times higher to acquire AIT. The combination of genotypes CD 28 C/T and CTLA-4 A/A or A/G would increase the risk of acquiring AIT four times. These results could be useful in order to make a premature diagnosis, with adequate characterization of a possible autoimmune thyroid disease in patients with AIT.

No competing finantial interest exist.

Key Words: CD28; CTLA4; Thyroid autoimmunity

Introducción

La enfermedad tiroidea autoinmune (ETA) incluye un grupo de desórdenes complejos, que comparten en común la respuesta inmune humoral y celular contra la tiroides. Es la enfermedad autoinmune más prevalente y afecta hasta el 5% de la población general: 4% en mujeres y 1% en hombres ⁽¹⁾.
ETA incluye la enfermedad de Graves (GD) y Tiroiditis de Hashimoto (HT). Ambas GD y HT presentan infiltración de linfocitos T y B reactivos contra antígenos tiroideos, producción de anticuerpos y consecuentemente manifestaciones clínicas ⁽²⁾.
Las variantes adicionales de ETA son: tiroiditis posparto, hipotiroidismo primario, tiroiditis inducido por drogas (INFα), tiroiditis asociado a síndrome poliendocrino autoinmune y presencia de anticuerpos antitiroideos sin aparente enfermedad clínica⁽³⁾.
Frecuentemente, su desarrollo está dado por la compleja interacción entre susceptibilidad genética y otros factores de riesgo. Dichos factores comprenden inadecuada ingesta de yodo, radioterapia, infecciones virales, cirugía, que pueden iniciar la respuesta inmune contra autoantígenos tiroideos: peroxidasa tiroidea, tiroglobulina y receptor de TSH ⁽⁴⁾.
Una revisión bibliográfica sobre incidencia de ETA estima para el hipotiroidismo 350/100,000/ año y 80/100,000/año y para el hipertiroidismo 80/100,000/año y 8/100,000/año; en mujeres y hombres respectivamente ⁽⁵⁾.
Una característica distintiva de ETA es la temprana producción de aTPO, la prevalencia es de 12-15% en la población general, que a menudo predicen el desarrollo clínico de la enfermedad ⁽⁶⁾. Existen evidencias previas de una predisposición genética hacia la producción de estos autoanticuerpos, y dicha susceptibilidad puede desencadenar en desórdenes endocrinos autoinmunes. Estas afecciones son poligénicas, numerosas vías coestimulatorias han sido estudiadas en diferentes modelos de enfermedades autoinmunes, con diversos resultados. Sus conclusiones en general mostraron algún tipo de relación con la respuesta generada y el proceso de tolerancia inmune.
La susceptibilidad genética para la
autoinmunidad tiroidea y adrenal en humanos es aportada, entre otros, por genes correspondientes al HLA y por otros candidatos localizados en cromosoma 2q33. Esta región contiene el gen de CTLA-4 que codifica un receptor de células T y el de CD 28 que compite por la unión a B7.
CD 28 y CTLA 4 son moléculas pertenecientes a la superfamilia de inmunoglobulinas, generan señales positivas (activación) y negativas (inhibición) respectivamente, entre células presentadoras de antígenos y linfocitos T. La vía positiva (CD28) genera activación, proliferación y diferenciación; mientras que la negativa (CTLA-4), anergia, muerte celular y regulación de la expansión clonal T.
CD28 provee una señal coestimulatoria positiva de célulasT y regula la producción de IL-2. La señal de su ligando CD28- B7 podría contribuir a"gatillar" la respuesta autoinmune.
CTLA-4 se expresa en células T activadas, inhibe la transcripción de la IL-2 y la progresión de las célulasT en el ciclo celular. El efecto directo es la inhibición de la señal generada por CD28. CTLA-4 juega un rol importante en el curso de la enfermedad tiroidea autoinmune ⁽⁷⁾.
Sabiendo que el linfocito T es el principal mediador de la autoinmunidad tiroidea, el fenotipo de CTLA-4 puede afectar la función celular en la patogénesis de la enfermedad ^{(8, 9)}.
Varios polimorfismos genéticos del CD28 (IVS3+17T/C) y CTLA-4 (-318 C/T y + 49 A/G) estarían asociados según estudios y diseños experimentales previos, con numerosas enfermedades autoinmunes, entre ellas: lupus, artritis reumatoidea, enfermedad celíaca, ETA y diabetes ^{(10, 11)}.

Objetivo

Analizar y comparar la distribución de los polimorfismos de simple nucleótido (SNP) de las moléculas CD28 (IVS3+17 T/C) y CTLA-4 (+ 49 A/G), en pacientes con aTPO >10 IU/ml (AIT) comparados con un grupo control aTPO ≤ 10 IU/ ml sin AIT.

Población

Estudiamos 69 pacientes ambulatorios de 21 a 65 años, (media 48 ± 14) con aTPO > 10 UI/ml (media 459 ± 388) y 36 sujetos ambulatorios de 21 a 65 años (media 51 ± 16) con aTPO ≤ 10 IU/ml considerados como grupo control ⁽¹²⁾. Los pacientes analizados eran: 9 hipertiroideos (13%); 24 eutiroideos (35%) y 36 hipotiroideos (52%). TABLA I

Tabla I

Para el cálculo de parámetros estadísticos de aTPO, los resultados >1000 (que superaban el rango de calibración) fueron considerados = 1000. El criterio de inclusión para esta población fue aTPO > 10 IU/ml; y el de exclusión para ambas poblaciones de estudio fue la presencia de enfermedad autoinmune no tiroidea, por la evaluación clínica correspondiente
Todos los individuos fueron asistidos en nuestra Institución y firmaron el consentimiento informado. Los datos se obtuvieron de las planillas de registro individual realizada por los integrantes del equipo de investigación y de las historias clínicas. Se utilizó un diseño tipo caso-control apareado por edad y sexo.

Métodos

Para determinar aTPO se utilizó un ensayo inmunométrico enzimático secuencial en fase sólida por quimioluminiscencia (IMMULITE 1000, Siemens) y muestra sérica matutina obtenida de una extracción por punción venosa del pliegue del codo. Sensibilidad analítica del método 10 IU/ ml y nuestro CV= 15%.
Para el estudio de los SNPs se realizó la extracción de ADN partiendo de sangre entera anticoagulada con EDTA. Todas las muestras fueron conservadas hasta su procesamiento. La amplificación de los genes se realizó por PCR (reacción de polimerasa en cadena).
CTLA-4: +49 A/G a través de PCR-RFLP, digerido por la enzima de restricción BstEII (Fermentas- Tecnolab). CD28: IVS3+17T/C a través de PCRRFLP, digerido por la enzima de restricción Aci-1 (Fermentas-Tecnolab). Ambos se visualizaron en geles de agarosa al 3%
Estadística: las diferencias entre grupos fueron comparadas usando el test de Chi Cuadrado. Fueron consideradas estadísticamente significativas p<0.05. Los riesgos relativos fueron calculados como Odds Ratio (OR) con intervalos de confianza (IC) del 95%.

Resultados

Observamos una diferencia significativa en el genotipo CT del polimorfismo CD 28 +17T/C entre AIT y Controles (38% vs. 17% respectivamente, p=0.026, OR= 3, IC95= 1.1-8.3) TABLA II. No encontramos en nuestra población el genotipo CC. GRÁFICO 1

Tabla II

Gráfico 1

Analizando los genotipos de los polimorfismos CTLA-4 + 49A/G no observamos diferencia significativa entre AIT y controles (p=0.73) TABLA III y GRÁFICO 2

Tabla III

Gráfico 2

Del análisis de asociación de genotipos CD 28 CT y CTLA4 AA o AG, observamos diferencia significativa en los portadores comparando AIT vs. Controles (p= 0.013; OR= 4, IC95= 1.3-12.6). TABLA IV y GRÁFICO 3.

Tabla IV

Gráfico 3

Los 23 pacientes estudiados con la combinación de polimorfismos considerados por nosotros como candidatos marcadores de AIT, presentaban clínica diversa y tan sólo 26% era eutiroideo. TABLA V

Tabla V

Conclusiones

Encontramos una posible asociación significativa del genotipo CT del gen CD28 en individuos con AIT, ya que quienes portan el genotipo CT tendrían un riesgo incrementado de tres veces de adquirir AIT.
No observamos diferencia en la distribución de las frecuencias genotípicas entre las variantes del polimorfismo CTLA-4 +49 A/G entre AIT y controles.
La combinación de los genotipos CT en CD28 y AA o AG de CTLA4 representaría un riesgo incrementado de cuatro veces de adquirir AIT. Estos resultados obtenidos en nuestra población de estudio son discordantes a los ya publicados, principalmente con respecto a CD28, donde no demuestran asociación con AIT en sujetos de diferentes etnias pertenecientes a países de Europa.
Conociendo la alta prevalencia de AIT y basados en estos resultados se podría llevar a cabo un diagnóstico precoz, con la adecuada caracterización de una posible enfermedad tiroidea autoinmune en pacientes con AIT. Además, implementar en los portadores del polimorfismo del CD28 hallado, un estricto seguimiento con la posibilidad de estudiar familiares de 1er grado.

Agradecimientos:

Siemens por la donación de kits de aTPO Tecnolab S.A

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